美国白蛾丝氨酸蛋白酶基因HcSP1的克隆、时空表达及对取食不同寄主植物的表达响应

【目的】为探究美国白蛾Hyphantria cunea在寄主转换过程中的消化生理机制奠定基础。【方法】通过筛选美国白蛾cDNA文库,克隆美国白蛾丝氨酸蛋白酶基因。荧光定量PCR检测该基因在美国白蛾不同发育阶段的表达特性;半定量RT-PCR和荧光定量PCR分别检测该基因在美国白蛾5龄幼虫体内不同组织中的分布及表达特性;荧光定量PCR检测取食不同寄主植物(美洲黑杨Populus deltoides,日本晚樱Cerasus serrulata var.lannesiana,山樱花Cerasus serrulata,喜树Camptotheca acuminata和法国梧桐Platanus orientalis)叶片后美国白蛾4龄幼虫中该基因的表达量。【结果】克隆获得美国白蛾丝氨酸蛋白酶基因HcSP1(GenBank登录号:MH663425),开放阅读框长882 bp,编码293个氨基酸,预测分子量为30.5 kD,理论等电点预测为9.86。编码蛋白N末端疏水区包含15个氨基酸组成的信号肽;具有丝氨酸蛋白酶的典型特征,即氨基酸序列中具有组氨酸(His)、天门冬氨酸(Asp)以及丝氨酸(Ser)残基组成的酶活性催化中心三元件;具有明显的胰蛋白酶前体的特征,即具有信号肽、激活肽以及胰蛋白酶N末端保守的起始氨基酸序列(IVGG)。NCBI BLAST比对结果表明美国白蛾HcSP1与其他鳞翅目昆虫丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性在50%～70%之间。荧光定量PCR结果显示,HcSP1在美国白蛾幼虫不同发育阶段的相对表达量呈现动态的变化,并随着幼虫虫龄的增长呈现上升趋势。半定量RT-PCR及荧光定量PCR结果显示,HcSP1在美国白蛾5龄幼虫头部、唾液腺、中肠、脂肪体、表皮、马氏管和血淋巴等组织中均有表达且在幼虫中肠中表达量极高。与取食其他寄主植物叶片相比,美国白蛾取食喜树叶片后HcSP1的相对表达量明显升高,并显著高于取食其他寄主植物。【结论】本研究克隆获得美国白蛾丝氨酸蛋白酶基因HcSP1,检测了其在美国白蛾不同发育阶段、不同组织以及取食不同寄主植物叶片后的表达量,为探究美国白蛾在寄主转换过程中消化生理的机制奠定基础,也为美国白蛾的防治提供新的思路。     

Effects of different food plants on the growth, development and reproduction of fall webworm ,Hyphantria cunea, larvae

2010年6月至7月,在室内研究了美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)第1代幼虫对洋白蜡、欧美107号杨、法桐和白榆的取食量及不同的食料种类对美国白蛾生长发育和繁殖的影响.结果表明,美国白蛾对受试的各树种的取食量以洋白蜡为最多,完成一代平均每头可以取食2.21g,其次为欧美107号杨1.95g,再次为法桐和白榆,分别为1.85g/头和1.68g/头.3龄后幼虫对不同的寄主呈现出一定的偏好性,特别是5龄和6龄幼虫对不同的寄主的取食量表现出显著差异.不同的食料植物对美国白蛾幼虫和蛹的发育历期、存活率、蛹重、成虫寿命、产卵量等有显著影响.取食法桐对其生长发育和繁殖表现出明显的不利性,主要表现为幼虫期延长、蛹重减轻、单雌产卵量降低.     

美国白蛾热激蛋白70基因的鉴定及功能分析

【目的】探究热激蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)基因在美国白蛾Hyphantria cunea抵御高温胁迫过程中的作用,为揭示美国白蛾的扩散机制以及预测潜在分布区提供理论支撑。【方法】利用PCR技术克隆美国白蛾HSP70基因,并进行生物信息学分析;利用qPCR技术检测新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在25, 30, 35和40℃处理下HSP70基因的表达特性;构建美国白蛾HSP70的原核表达载体,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞中诱导表达该蛋白,利用Ni²⁺-His柱纯化蛋白,并通过Western blot验证该蛋白;利用体外实验测定原核表达获得的重组蛋白在高温胁迫下的ATP酶活性。【结果】克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70(GenBank登录号: MT995848)和HcHSC70(GenBank登录号: MT261583),其ORF长度分别为1 917和2 061 bp,分别编码637和687个氨基酸,分子质量分别约为69.66和74.96 kD,等电点分别为5.90和5.96;氨基酸序列结构均含有3个高度保守的区域GIDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和VGGSTRIPKVQ,符合热激蛋白70家族的特征;蛋白三维结构均由N端ATPase功能域和C端底物结合功能域所组成。系统进化树显示HcHSP70与鳞翅目HSP70家族其他成员聚为一支,而HcHSC70与鳞翅目HSC70家族的其他成员聚为另一支。qPCR结果表明,新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在热胁迫下HcHSP70的相对表达量显著上调,且在35℃处理2 h下达到峰值,而热胁迫下HcHSC70的表达响应较微弱。成功构建了HcHSP70的原核表达载体并在体外诱导表达。纯化后的重组蛋白HcHSP70具备ATPase活性,且在高温胁迫下酶活性稳定。【结论】本研究克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70和HcHSC70,明确了两条基因在高温处理下的表达特性;成功对美国白蛾HcHSP70进行原核表达及纯化,并证明重组蛋白HcHSP70在高温下具有稳定的ATPase活性,推测其在美国白蛾应对高温胁迫中发挥着重要作用。     

绿原酸对美国白蛾幼虫生长发育和解毒相关蛋白活性的影响

【目的】明确植物次生代谢物质绿原酸对美国白蛾Hyphantria cunea幼虫生长发育和解毒相关蛋白活性的影响。【方法】将含不同浓度绿原酸(0, 0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%)的人工饲料饲养美国白蛾幼虫,测定各组中5龄幼虫6 d内的死亡率, 各组中5龄幼虫在取食48 h时的营养效应指标,0.500%绿原酸处理组中幼虫(3龄幼虫开始)的生长发育,以及在取食36 h时各组中5龄幼虫肠道中的解毒相关蛋白活性。【结果】绿原酸处理组中美国白蛾5龄幼虫6 d内的死亡率随着人工饲料中绿原酸浓度的增大而逐渐升高,且显著高于对照组(取食含10% DMSO人工饲料的)。绿原酸对美国白蛾5龄幼虫的营养效应指标有显著影响,各处理组幼虫的相对取食量和近似消化率显著高于对照组,食物转化率显著低于对照组,除0.125%绿原酸处理组外,其余处理组幼虫的食物利用率和相对生长速率也显著低于对照组。0.500%绿原酸处理使美国白蛾3-5龄幼虫发育历期比对照组显著延长28.24%(3.7 d),老熟幼虫(6-7龄幼虫)的发育历期缩短8.97%(0.7 d),且幼虫总成活率、化蛹率、羽化率、雌雄性比及产卵量等各项指标均显著低于对照组。不同浓度绿原酸处理对美国白蛾幼虫肠道中的细胞色素P450酶(CYP450)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)和ABC转运蛋白(ABC transporters)的活性具有显著影响,但对羧酸酯酶(CarE)活性未见显著影响。【结论】绿原酸可影响美国白蛾幼虫的存活率、食物利用效率、生长发育和繁殖,而美国白蛾幼虫可能通过调节食物利用率和诱导其解毒相关蛋白活性从而对食物中绿原酸产生适应性。     

不同食料植物对美国白蛾生长发育和繁殖的影响

2010年6月至7月,在室内研究了美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)第1代幼虫对洋白蜡、欧美107号杨、法桐和白榆的取食量及不同的食料种类对美国白蛾生长发育和繁殖的影响。结果表明,美国白蛾对受试的各树种的取食量以洋白蜡为最多,完成一代平均每头可以取食2.21 g,其次为欧美107号杨1.95 g,再次为法桐和白榆,分别为1.85 g/头和1.68 g/头。3龄后幼虫对不同的寄主呈现出一定的偏好性,特别是5龄和6龄幼虫对不同的寄主的取食量表现出显著差异。不同的食料植物对美国白蛾幼虫和蛹的发育历期、存活率、蛹重、成虫寿命、产卵量等有显著影响。取食法桐对其生长发育和繁殖表现出明显的不利性,主要表现为幼虫期延长、蛹重减轻、单雌产卵量降低。     

棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达分析

【目的】通过对棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达谱分析,进一步明确Polycalin基因在抗性中发挥的作用,为棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性治理提供理论依据。【方法】通过RACE结合PCR技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列,利用实时荧光定量PCR技术测定了在棉铃虫不同发育时期、幼虫肠道不同部位的Polycalin基因表达量,比较了棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料后,Polycalin基因表达量的变化。【结果】该基因全长序列为2 955 bp,开放阅读框为2 781 bp,编码926个氨基酸(Gen Bank登录号为KP100652);预测蛋白的分子量为101.68 ku,等电点为4.57。推导的氨基酸序列中,N末端含有20个氨基酸组成的信号肽,含有8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,C末端存在2个GPI结合位点。Polycalin在棉铃虫所有发育阶段都可以表达,幼虫期表达量较高,尤其在1~3龄幼虫体内表达量最高,在卵、成虫和蛹中的表达量较低。棉铃虫4龄幼虫取食含活化Cry1Ac蛋白的人工饲料后,Polycalin基因的表达受到抑制。【结论】研究结果可以为进一步揭示Polycalin基因的功能及其在Bt杀虫机制中的作用奠定基础。     

寄主转换对美国白蛾幼虫生长发育和消化酶活性的影响

[目的]明确寄主转换对美国白蛾Hyphantria cunea幼虫生长发育以及体内消化酶活性的影响,探究美国白蛾幼虫在不同寄主植物之间转换后的适应性与生理响应机制.[方法]在实验室条件下,人工饲料饲养美国白蛾一代后,第2代初孵幼虫分别持续饲喂落羽杉Taxodium distichum与日本晚樱Cerasus serru...     

不同寄主植物对美国白蛾幼虫取食行为及解毒酶活性的影响

【目的】明确美国白蛾Hyphantria cunea对常见寄主植物的取食偏好,依据寄主植物中次生物质的含量及美国白蛾幼虫乙酰胆碱酯酶和解毒酶活性来探明美国白蛾对寄主植物的取食策略。【方法】以北京地区美国白蛾危害程度不同的8种植物(桑Morus alba、洋白蜡Fraxinus pennsylvanica、臭椿Ailanthus altissima、白榆Ulmus pumila、黑杨Populus nigra、垂柳Salix babylonica、西府海棠Malus micromalus和金银木Lonicera maackii)为寄主,通过室内饲养,测定美国白蛾4龄幼虫对不同寄主植物叶片的取食量、选择率及营养效应指标,划分其对寄主植物的取食偏好。对8种寄主植物中类黄酮、总酚、单宁含量以及取食不同寄主植物叶片的美国白蛾4龄幼虫体内乙酰胆碱酯酶和解毒酶活性进行测定。【结果】美国白蛾4龄幼虫对不同寄主植物具有选择差异,选择率大小则为洋白蜡和臭椿桑白榆西府海棠、垂柳和金银木黑杨。寄主植物叶片中类黄酮的含量与幼虫的取食量呈显著负相关(r=-0.657,P=0.017)。不同寄主植物对美国白蛾具有不同的营养效应。金银木饲喂组近似消化率(0.97%±0.01%)最高,相对取食量(2.92±0.49 g/g·d)也较高,但食物利用率(0.005%±0.01%)、食物转化率(0.005%±0.008%)和相对生长率(0.007±0.02 g/g·d)最低;西府海棠饲喂组相对生长率(0.34±0.04 g/g·d)最高,近似消化率(0.72%±0.10%)、食物利用率(0.16%±0.01%)、食物转化率(0.24%±0.06%)和相对取食量(2.19±0.38 g/g·d)均处于较高水平。取食不同寄主植物的美国白蛾幼虫乙酰胆碱酯酶(Ach E)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(Car E)和昆虫细胞色素P450(P450)的活性存在显著差异(P0.01)。【结论】美国白蛾幼虫对不同寄主植物存在取食选择和营养效应差异,幼虫灵活的取食策略以及解毒代谢调节能力可能是其适应不同寄主的主要原因。     

桃蛀螟CYP6AE76基因参与对Cry1Ab蛋白的解毒作用

【目的】明确桃蛀螟Conogethes punctiferalis幼虫取食Cry1Ab蛋白后体内CYP6AE76的过表达及对Cry1Ab蛋白有解毒作用。【方法】分析桃蛀螟CYP6AE76序列特征;利用RT-qPCR检测CYP6AE76在不同发育阶段(1-5龄幼虫)和4龄幼虫不同组织(头、中肠、血淋巴和脂肪体)以及4龄幼虫取食含有Cry1Ab蛋白(LC₅₀=1.08 ng/cm2)的人工饲料3 d存活的幼虫中肠和血淋巴中的表达量;利用RNAi饲喂法沉默桃蛀螟4 龄幼虫CYP6AE76后检测中肠中CYP6AE76的表达量,并统计120 h后幼虫体重并计算幼虫存活率;利用RNAi饲喂法沉默桃蛀螟初孵幼虫CYP6AE76后饲喂含1.08 ng/cm² Cry1Ab蛋白的饲料,7 d后统计幼虫体重并计算幼虫存活率。【结果】桃蛀螟CYP6AE76基因开放阅读框长1 572 bp,编码524个氨基酸,分子量约为60.34 kD,属于CYP6家族基因。发育表达谱结果表明, CYP6AE76基因在桃蛀螟整个幼虫阶段均有表达且在1龄幼虫期表达量最高,随着幼虫龄期增大而表达量降低;组织表达谱结果表明,CYP6AE76在4龄幼虫中肠中表达量最高。4龄幼虫取食含有Cry1Ab蛋白(1.08 ng/cm²)的人工饲料后,CYP6AE76在中肠和血淋巴中的表达量相比对照显著上调。通过RNAi沉默CYP6AE76后,桃蛀螟初孵幼虫再取食含有Cry1Ab蛋白的人工饲料后体重显著降低。【结论】CYP6AE76可能参与对桃蛀螟幼虫摄入的Cry1Ab蛋白的解毒。     

桉蝙蛾3龄幼虫嗅觉结合蛋白的高表达量与其寄主选择时期的一致性

为分析桉蝙蛾Endoclita signifer幼虫嗅觉蛋白中结合蛋白（OBPs+CSPs）在不同龄期和体段的表达,揭示桉蝙蛾幼虫结合蛋白的时空表达谱,基于表达谱阐明其与幼虫寄主选择行为的关系,本研究利用qRT-PCR分析桉蝙蛾幼虫结合蛋白在4个龄期和3个体段中的表达。在各龄期幼虫的头部中,EsigOBP2、EsigOBP5、EsigOBP8、EsigGOBP2、EsigGOBP3、EsigGOBP6、EsigCSP1和EsigCSP2 均在3龄幼虫头部显著地高量表达,同时82.4%的结合蛋白在幼龄幼虫（3龄和5龄）的某个体段表达量最高。此外,47.1%和35.3%的结合蛋白在桉蝙蛾幼虫腹部和胸部的表达量最高。以上筛选出的8个结合蛋白是桉蝙蛾3龄幼虫在地栖转树栖过程中,参与寄主识别最主要的蛋白;且结合蛋白在3龄幼虫头部的显著高量表达与3龄幼虫转移栖息地和选择寄主相一致,同时结合蛋白在幼龄幼虫中的高量表达可能与选择寄主后幼龄幼虫对寄主挥发物的适应相一致;本研究支持了桉蝙蛾幼龄幼虫寄主选择的推测。与其他昆虫一致,结合蛋白在桉蝙蛾幼虫的腹部和胸部（非嗅觉部位）高量表达,其功能有待解读。     

八仙山国家级自然保护区山樱花种群结构特征

山樱花(Cerasus serrulata)是樱花的野生种,其花色和树形优美,是重要而稀少的樱属观赏植物资源。近年,在燕山山脉东麓的天津北部山区,发现比较集中分布的山樱花种群。为明确该野生山樱花种群特征,探究其生态分布习性,本研究选取了天津八仙山国家级自然保护区阴坡、山脊、阳坡3种不同坡位中的山樱花群落,设置样地进行了野外群落学调查,研究了山樱花的种群结构及所在群落物种多样性随海拔和坡位的变化规律,并运用主成分分析法,分析群落间的差异以及群落结构对多样性变化的影响。结果表明:(1)山樱花为落叶阔叶林伴生种,所在群落乔木层主要树种为蒙古栎(Quercus mongolica)、槲栎(Q.aline)、白蜡(Fraxinus chinensis)、鹅耳枥(Carpinus turczaninowii)、臭檀(Euodia daniell)、桑(Morus alba)和元宝槭(Acer truncatum),灌木层主要物种为迎红杜鹃(Rhododendron mucronulatum)、三裂绣线菊(Spiraea trilobata)、小花溲疏(Deutzia parviflora)、大花溲疏(D.grandiflora)、大叶朴(Celtis koraiensis)和锦带花(Weigela florid);山樱花种群结构和所在群落的结构依坡位不同而发生变化;(2)山樱花种群的年龄结构呈倒"J"型分布,600~800 m海拔和阳坡更新状况最好;(3)不同坡位山樱花种群的Shannon生态位宽度为阳坡>山脊>阴坡。与山樱花生态位重叠最高的种群,阴坡为中国黄花柳和蒙古栎,山脊为臭檀和蒙古栎,阳坡为杏和桑;(4)山樱花所在群落的乔木层径级分布呈倒"J"型,多样性指数随海拔增加先增后减;阴坡多样性指数最高,山脊和阳坡较低。灌木层的多样性指数变化趋势与乔木层相反。群落的物种多样性将随群落发育而增加,其优势种的优势度也将进一步提高,作为伴生种的山樱花种群将在阴坡可能衰退,在山脊和阳坡发育良好。该研究可为我国北方地区野生山樱花种群的保护与开发利用提供科学的参考依据。     

The expression analysis of silk gland-enriched intermediate-size non-coding RNAs in silkworm Bombyx mori

Small non-protein coding RNAs （ncRNAs） play important roles in development, stress response and other cellular processes. Silkworm is an important model for studies on insect genetics and control of Lepidopterous pests. We have previously identified 189 novel intermediate-size ncRNAs in silkworm Bombyx mori, including 40 ncRNAs that showed altered expression in different developmental stages. Here we characterized the functions of these 40 ncRNAs by measuring their expressions in six tissues of the fifth instar larvae using Northern blot and real-time polymerase chain reaction assays. We identified nine ncRNAs （four small nucleolar RNAs and five unclassified ncRNAs） that were enriched in silk gland, including four ncRNAs that showed silk gland-specific expression. We further showed that three of nine silk gland-enriched ncRNAs were predominantly expressed in the anterior silk gland, whereas another three ncRNAs were highly accumulated in the posterior silk gland, suggesting that they may play different roles in fibroin synthesis. Furthermore, an unclassified ncRNA, Bm- 152, exhibited converse expression pattem with its antisense host gene gartenzwerg in diverse tissues, and might regulate the expression of gartenzwerg through RNA-protein complex. In addition, two silk gland-enriched ncRNAs Bm-102 and Bm-159 can be found in histone modification complex, which indicated that they might play roles through epigenetic modifications. Taken together, we provided the first expression and preliminary functional analysis of silk gland-enriched ncRNAs, which will help understand the molecular mechanism of silk gland-development and fibroin synthesis.     

Effects of transgenic Cry1A＋CpTI cotton and Cry1Ac toxin on the parasitoid, Campoketis chlorideae （Hymenoptera：Ichneumonidae）

Abstract The effect of transgenic double genes, Cry1A + CpTI cotton and Cry1Ac toxin on the parasitoid, Campoketis chlorideae Uchida of cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hübner), was investigated in the laboratory. Helicoverpa armigera larvae when in the first, second and third instar could not survive if fed on transgenic cotton leaves. Consequently, C. chlorideae larvae could not complete their development if parasitizing on such hosts. After H. armigera larvae were reared on transgenic or traditional cotton leaves for 12J48 hours, they were parasitized by C. chlorideae females. Parasitized larvae continued to feed on transgenic or traditional cotton for 12–48 h. The present results showed that the body weight of larvae of the parasitoids were significantly reduced when parasitized hosts fed on transgenic cotton leaves compared to those fed on traditional cotton. Duration of egg and larvae stage were significantly prolonged, pupal and adult weight of C. chloridae was decreased when the host larvae fed on transgenic cotton leaves longer than 48 h. The development duration of C. chlorideae pupae on the hosts fed on transgenic cotton leaves in each treatment was not significantly different from those of controls. The longevity of parasitoid females and males fed with a solution containing Cry1Ac toxin was not significantly different with that of the control.