大肠杆菌青霉素酰化酶的提纯及其性质的研究

大肠杆菌(Escherichia coli) AS 1.70发酵液经有机溶剂处理,硫酸铵分级,再用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到了聚丙烯酰胺凝肢电泳均一的青霉素酰化酶纯品。纯酶作用的最适温度为45—55℃,最适pH为7．0—7．7,在无NIPAB存在下,纯酶在45℃以下稳定,但在55℃保温一小时,酶活力残存33．58％,纯酶在pH5．0—8.0稳定。酶作用于重排酸的米氏常数为3．33×10-2g／ml。Ag+对酶有抑制作用。用聚丙烯酰胺薄层凝胶等电聚焦测定酶的等电点(pI)为6．7—6．8,用SDS凝胶电泳测酶的亚基分子量分别为14300和58900。纯酶具有水解苯甘氨酸甲酯盐酸盐的作用,反应两小时产生12．74mM苯甘氨酸。     

诺卡氏菌属GS-17耐热茁霉多糖酶的提纯和性质

诺卡氏菌属GS-17(Nocardia sp.GS-17)的耐热茁霉多糖酶(Pullulanase EC.3.2.1.41)的粗酶液经中空纤维柱超滤浓缩、羟基磷灰石柱层析和Pullulan-Sepharose 6B亲和层析,得到凝胶电泳均一的纯酶,比活提高264倍.酶作用最适温度为55℃,最适PH6.2,分子量140000,等电点pI为6.0.该酶水解茁霉多糖、支链淀粉和可溶性淀粉,但不水解糖原.酶在50℃作用于茁霉多糖的米氏常数K_m为0.90mg/ml,最大反应速度V_(max)为57μmol·min~(-1)·mg~(-1).Zn~(2+)、Fe~(3+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)和环状糊精对酶有抑制作用,Ca~(2+)对酶有激活作用.经蛋白质侧链化学修饰研究表明,色氨酸残基位于酶的活性位区.该酶是由1129个氨基酸残基组成的单肽链,酶的N末端序列经测定为:Ala-Gly-His-Gly-Pro-Asp-Val-Gln-Asp-Gly-     

康氏木霉C1酶的简捷提纯法及酶性质的研究

康氏木霉(Trichoderma Koningii)白色变异菌株AS 3．4001的粗酶制剂,经Sephadcx G-75凝胶过滤柱脱盐并除去大量杂蛋白,然后通过DEAE—scphadcx A一50离子交换层析,用0—0.5M Nacl梯度冼脱即得c。酶纯品。全程序仅需二天时间。 经聚丙烯酰胺凝胶电泳及SDS电泳鉴定均为单一带。此酶的分子量用SDS电泳及凝胶过滤法测定分别为58,000和5 2,000,用等电聚焦测其等电点为pH4 0。作用最适pH也为q o。此酶有较好的稳定性,在酸性pH(2 2)、碱性pH(8 0)及中性(水)中均能保持较长时间而不丧失活力。     

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A236热稳足葡萄糖淀粉酶的纯化及其特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A2a6在液体培养基中50℃下静止培养14天,粗提酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、Sephacryl S100凝胶过滤和FPLC Mono Q离子交换层析,得到了凝胶电泳均质的葡萄糖淀粉酶。酶促反应产物经TLC分析为葡萄糖,证明纯化的酶为葡萄糖淀粉酶(EC 3．2．1.3)。SDS-PAGE测定其分子量为72,000,不具亚基,pI为4．0,富含val和Leu。酶反应最适温度和pH分别为70℃和5．0。在pH5．0条件下,酶在60℃保温lh,仍具有原酶活性。酶活性在70℃和80℃的半衰期分别为20min和6min, Ca²⁺对酶有激活作用,Fe³⁺、Al³⁺、Hg²⁺等金属离子对酶活力有一定的抑制作用。纯酶碳水化合物含量为12．4％。纯酶可水解可溶性淀粉,直链淀粉、支链淀粉．糊精、糖原、麦芽三糖和麦芽糖,其中可溶性淀粉为最适底物。     

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的提纯与性质

通过聚乙二醇6000一磷酸钾缓冲液双相分离,Sephadex G—100凝胶过滤、DEAE-Sephadcx A-50及SE-Se phadex C-50离子交换柱层析等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspe rgillutphoenlcis)麦麸培养物抽提液中提纯到凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。该酶的最适pH5．0,最适温度60℃,在pH 4．0--7．5之间及55℃以下稳定。Ag+及Hg2+对该酶有强烈的抑制作用。用SDS-凝胶电泳法及梯度凝胶电泳法测得该酶均分子量分别为118000及195000薄层凝胶等电聚焦法测得其等电点为pH 3.95。     

糖化酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pLCl为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)Sau34基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA,转化酿酒酵母BJ1991,选出具有淀粉水解酶活性的转化子,它含有编码扣囊拟内孢霉胞外糖化酶的基因片段,能发酵淀粉。琼脂糖凝胶电泳证明所插入DNA片段为5.3kb,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得糖化酶的分子量为54000。酶活最适温度为50℃,最适pH为5.5。     

绿色木霉纤维素酶系中C1酶的提纯与性质

从绿色木霉(Trichoderma viride) X2-85的麸曲抽提液中,分离出纤维素酶系中的C1酶,经纯化后,用聚丙烯酰胺凝腔电泳和超速离心鉴定,都为均一蛋白。在我们的实验条件下,它对羧甲基纤维素、3-葡萄糖苷及纤维二糖,都不表现活性。该酶能降解徽晶纤维紊、磷酸膨胀纤维素和脱脂棉,主要产物是纤维二糖。用Sephadex G一100凝胶过滤和SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量,分别为54,000和55,000。其沉降系数为4.18。     

根霉的研究IV．根霉淀粉葡萄糖苷酶的研究

本文研究根霉属内各种羣产生淀粉葡萄糖苷酶的情况及选择高活性的菌种。我们由150株根霉中选择出3株淀粉葡萄糖苷酶很强的根霉,共名称和菌号为Rhizopus japonicus AS 3.849(日本根霉),Rh. Tonkinensis AS 3.1175(河内根霉)和Rh.chinensis AS 3.2746(中国根霉)。酶作用的最适pH是4.5—5.0,最适温度因菌而异,一般以50一55℃最好,其中3．2 746耐热性最强,稳定性最高。根霉睫粉酶对原料的选择性不强,对6种不同的淀粉(可溶性淀粉、马铃薯、甘薯、玉米、大米和高粱),几乎都能全部水解成葡萄糖。3种根霉的性能,在很多方面都不相同,在一般条件下,3．849糖化力最强,3.1175次之,3.274 6糖化之初速度较低,而它的优点是生长迅速,酶的耐热性和稳定性强。     

海枣曲霉β-木糖苷酶的提纯和性质

从海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)麦麸培养物抽提液中。通过聚乙二醇6000-磷酸钾缓冲液双水相分离．相继用SephadexG-100凝胶过滤、DEAE—Sephadex A-50离子交换柱层析、羟基磷灰石吸附层析、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、SE—Sephadex C-50离子交换层析以及Sephadex G-50柱层析等提纯步骤,提纯到凝胶电泳均一的β-木糖苷酶。该酶的最适pH为3．5,最适温度为65 C．在pH3．5—6．5之间稳定,酶保温30分钟时的半失活温度(t1-2)为68C。酶的分子量勾95 000,等电点为4．4。Hg2-和Ag+对该酶有强烈的抑制作用。在所测定的底物中．Β-术糖苷酶仅对β-木精苷(pNP-β-Xyl)有强水解作用。其Km值为0．63mmol／L．Vmax为410 umol·min 1．Mg-1。D-木糖为β-木糖苷酶的竞争性抑制剂,其K．值为7．5mmol／L。     

米曲霉5037α-淀粉酶性质的研究

米曲霉(Aspergillus oryzae)5037产生的α-淀粉酶,酶反应最适温度范围为55—63℃,以60℃为最好。反应pH范围在4.4—6.0之间,最适PH为4.8—5.2。酶的pH稳定性为5.5—8.5。酶的热稳定性在50℃以下较好,加Ca~(++)对酶的稳定性有显著的作用。凝胶电泳分析,此菌株产生的酶系较纯。酶作用产物为糊精和低聚糖,延长反应时间则产生麦芽三糖和多量麦芽糖以及部分葡萄糖。     

黑曲霉An-76木聚糖酶系的酶学研究

用分子筛和离子交换等色谱分离技术,由黑曲霉An-76的木聚糖酶系中分离纯化到一种β-木糖苷酶(βx)和三种内切-β-木聚糖酶组分(EX1,EX 2,EX 3)。这几种酶均达到凝胶电泳纯和聚焦电泳纯。用凝胶过滤方法测得3X的分子量为147000,用凝胶电泳法测得EX1、EX2和EX3的分子量分别为2 3000、22000和41 000;βX、EX1、EX2和EX 3的等电点分别为4．6、5．9、4．1和3．9。本文还研究了各种酶的最适反应温度和PH、酶的热稳定性和pH稳定性;研究了金属离子和巯基试剂对酶活力的影响、动力学参数、氨基酸组成、底物持异性和反应产物等。各酶组份不具有分解纤维素的交叉活力。巯基试剂能完全抑制卢βX活力,其活力丧失可被半胱氨酸恢复。     

木霉GXC产β-葡聚糖酶条件和酶学性质

研究了木霉GXC产 β 葡聚糖酶的条件。结果表明 ,最适产酶碳源为麸皮 ,氮源为硫酸铵 ;产酶的最适条件为 :初始pH为 4 0～ 5 0 ,30℃培养 44h。粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG 2 5、SephadexG 1 0 0和DEAE SephadexA 50柱层析得到纯β 葡聚糖酶 ,SDS PAGE凝胶电泳显示一条带 ,测得分子量为 35kD。该酶最适反应pH5 0 ,最适反应温度为 60℃ ,在 40℃以下、pH4 0～ 5 0酶活力相对稳定。 5 0mmol L以下的Ca²⁺、Zn²⁺和Fe²⁺,以及 1 0 0mmol L以下的Co²⁺对酶活力有激活作用 ;而Cu²⁺和Fe³⁺具有抑制作用。     

分枝犁头霉a-半乳糖苷酶的纯化和性质

分枝犁头霉菌丝体球经金刚砂磨碎用水提取的粗酶液,用两种方法纯化,一是用制备垂直平板凝胶电泳;另一是经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-200、DEAE-Sephadcx A50及羟基磷灰石等柱层析。这两种方法纯化后的样品经PACE鉴定皆为均一带,无其他糖苷酶活性。酶反应最适温室为55—60℃,在50℃保温7h,剩余活力为50％,70℃保温10min,则全部失活。最适pH为5．0,pH6．0一8．5稳定。     

诺卡氏菌属GS-17耐热茁霉多糖酶的提纯和性质

诺卡氏菌属GS-17(Nocardia sp.GS-17)的耐热茁霉多糖酶(Pullulanase EC.3.2.1.41)的粗酶液经中空纤维柱超滤浓缩、羟基磷灰石柱层析和Pullulan-Sepharose 6B亲和层析,得到凝胶电泳均一的纯酶,比活提高264倍.酶作用最适温度为55℃,最适PH6.2,分子量140000,等电点pI为6.0.该酶水解茁霉多糖、支链淀粉和可溶性淀粉,但不水解糖原.酶在50℃作用于茁霉多糖的米氏常数K_m为0.90mg/ml,最大反应速度V_(max)为57μmol·min~(-1)·mg~(-1).Zn~(2 )、Fe~(3 )、Hg~(2 )、Cu~(2 )、Pb~(2 )和环状糊精对酶有抑制作用,Ca~(2 )对酶有激活作用.经蛋白质侧链化学修饰研究表明,色氨酸残基位于酶的活性位区.该酶是由1129个氨基酸残基组成的单肽链,酶的N末端序列经测定为:Ala-Gly-His-Gly-Pro-Asp-Val-Gln-Asp-Gly-     

尖镰孢青霉素V酰化酶的纯化及性质

通过硫酸铵沉淀、硅藻土吸附、DEAD-纤维素离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤,由尖镰孢(Fusarium oxysporum)FP941培养滤液中得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的青霉素V酰化酶。酶作用最适pH为7.0,最适温度为50℃。酶在pH6.0—8.0和42℃以下稳定。酶作用青霉素V的米氏常数Km为4.65×10~(-3)mol/L;苯氧乙酸是酶的竞争性抑制剂,抑制常数Ki为23.87×10~(-3)mol/L;6-氨基青霉烷酸是酶的非竞争性抑制剂,抑制常数Ki为30.01×10~(-3)mol/L。某些金属离子对酶有抑制作用,Fe~(2+)最强,其次是Hg~(2+)和Cu~(2+)。用SDS凝胶电泳测定酶亚基分子量为77600;用分子筛测定自然酶分子量为148000。     

克鲁维酵母Y-85菊粉酶的纯化和性质

克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)Y-85产生的胞内菊粉酶(endocellular inulinase)和胞外菊粉酶(exocellular inulinase)粗酶液分别经PEG6000-磷酸盐缓冲液双水相抽提得部分纯化酶液。前者进一步用硫酸铵分级沉淀、Protein-PAK DEAE离子交换、Protein-PAK200SW凝胶过滤后得到两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ;后者采用DEAE-Sephacel离子交换、Sephadex G150凝胶过滤后得到菊粉酶Eexo。经Waters 650E蛋白纯化系统鉴定,三者均呈单一的对称峰;EⅠ和EⅡ达聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳纯。EⅠ、EⅡ和Eexo的分子量分别为42kD、65kD和57kD;三者均为糖蛋白,多糖含量分别为30％、35％和25％;I/S(Inulinaseactivity/Sucrase activity)比值分别为0.086、0.078和0.072;三者均属外切菊粉酶。EⅠ、EⅡ和Eexo酶反应最适pH分别为4.6、4.5和4.6,最适温度分别为52℃、52℃和55℃;Ag⁺、Hg2+和PCMB对酶活性有强烈的抑制作用;三者水解菊芋…     

华丽曲霉Z58有机磷农药降解酶的纯化和性质

华丽曲霉(Aspergillus ornatus)Z58有机磷农药降解酶经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G100凝胶过滤、DEAE52离子交换层析得到了分离纯化,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定为单一组分。凝胶过滤法测得分子量为67 000,提纯倍数为34.2,收率为17.8%。该酶的最适反应温度45℃,最适反应pH72,对热较稳定,并且能在pH6～10范围保持活性。重金属Cu2+对该酶具有明显的促进作用,而SDS对酶具有抑制作用。此酶对所试的有机磷农药都有较好降解作用。     

日本根霉IFO5318胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及部分特性

采用硫酸铵沉淀及柱层析等步骤纯化了日本根霉IFO5318的β—葡萄糖苷酶,回收率为22％。该酶分子量约为4.0×10~5,由四个相同大小的亚基组成;最适反应温度55℃,最适反应pH5.5;对热较敏感,但能在较大的pH范围内保持稳定。用对硝基苯基—β-D-吡喃葡糖苷为底物,测得的K_m和V_(max)值分别为0.825mg·ml~(-1)和135.4μmol·min~(-1)·mg~(-1)。该酶对纤维二糖的水解能力最强,SDS、Fe³⁺、Hg²⁺等对酶活力有抑制作用。     

地中海诺卡氏菌丙氨酸脱氢酶的纯化和性质

采用硫酸铵分部沉淀、DEAE纤维素-52柱层析和亲和蓝柱层析的方法,分离纯化了地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)U-32丙氨酸脱氢酶(ADH),用聚丙烯酰胺凝肢电泳鉴定为单一组份。以聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳测得丙氨酸脱氢酶的分子量为228000,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其亚基分子量为38000,表明地中海诺卡氏菌U-32丙氢脱氢酶由六个相同的亚基组成。ADH加氨反应最适pH为8．5,脱氨反应最适pH为11．5,ADH的pH稳定范围在pH 7．5-11．5。脱氨反应的最适温度为50℃。ADH的米氏常数KM为：丙酮酸4．88×10-4mol／L;NH+44．03×10-3Mol／L;NADH 6．02×10-5Mol／L;L—Ala7．45×10-3mol／L;NAD+6．67×10-5mol／L。 Hill作图法求得ADH的Hill系数n为：ADH对丙酮酸、NADH和NAD+的Hill系数都为1;对L—Ala和NH4+的Hill系数n值分别为0．52和0．51,ADH对L—Ala和NH+4有负协同效应,由此初步推测ADH是一个调节酶。     

黄杆菌(Flavobacterium sp.)几丁质酶的纯化和性质

黄杆菌(Flavobacteium sp.)在几丁质的诱导下产生几丁质酶.通过(NH_4)_2SO_4沉淀、DEAE纤维素柱层析、Sephacryl 300柱层析及Sephadex G-75柱层析,从Flavobacterium sp.培养上清液中分离纯化了几丁质酶.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯度分析表明,纯化后的几丁质酶达到了均一的程度.用SDS-PAGE测得该酶的分子量约45D00道尔顿.该酶水解几丁质的最适pH为 7.0,最适温度为50℃,-20C贮存两年以上仍有活性.水解几丁质的Km值为5.0mg/ml.金属离子对几丁质酶活性影响较大,Ca~(2+) 、Co~(2+)’和Cu~(2+)对酶有激活作用.而NH_4~-、Ba~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)对酶有抑制作用.几丁质酶水解几丁质的产物是几丁质二糖.