地黄C3H基因的克隆及生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶属于植物中最大的蛋白酶细胞色素P450家族之一,在植物生命活动中发挥着重要作用。为了解地黄香豆酸-3-羟化酶基因RgC3H合成毛蕊花糖苷的功能,该研究基于地黄代谢组学分析获得KEGG途径中的C3H,采用多重比对在NCBI中获得同源基因的一个保守序列,并基于该保守序列和地黄SRA数据库,采用电子克隆和RT-PCR克隆技术获得地黄C3H基因全长CDS(RgC3H),对其进行生物信息学分析。结果表明:RgC3H基因全长为1 530 bp,且编码一个含509个氨基酸、分子量为57.91 kD、无信号肽的蛋白质; 基于氨基酸序列的结构分析显示,RgC3H有一个保守区域-P450结构域; 系统进化分析结果显示,RgC3H与芝麻和猴面花的C3H基因具有很高的同源性。上述结果为进一步研究RgC3H基因在地黄毛蕊花糖苷生物合成途径中的作用奠定了基础。     

Presence of Rhizobium Etli bv . Phaseoli and Rhizobium Gallicum bv . Gallicum in Egyptian Soils

Seven bean rhizobial strains EBRI 2, 3, 21, 24, 26, 27 and 29 identified as Rhizobium etli, and EBRI 32 identified as Rhizobium gallicum, isolated from Egyptian soils and which nodulated Phaseolus vulgaris efficiently, were subjected to hybridization with a nifH probe in order to estimate the copy number of this gene. Seven strains (EBRI 2, 3, 21, 24, 26, 27 and 29) which were only able to nodulate Phaseolus vulgaris, contained three copies of the nifH gene, consistent with their identification as Rhizobium etli bv. phaseoli. Only one strain (EBRI 32) which nodulated both Phaseolus vulgaris and Leucaena leucocephala, had one copy of nifH gene. This confirmed the classification of this strain as Rhizobium gallicum bv. gallicum.     

柠条锦鸡儿F3H基因克隆及功能分析

柠条锦鸡儿为豆科灌木,对各种环境胁迫具有较强的适应能力,类黄酮是天然的抗氧化剂,花青素属类黄酮化合物,逆境胁迫会影响植物体内花青素的合成,而黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成所必需的一种关键酶。该研究成功分离克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因,命名为CkF3H。CkF3H基因的开放阅读框(ORF)为1095 bp,编码364个氨基酸,推测的蛋白质分子量为41.3 kDa,理论等电点为5.9。生物信息学分析发现,CkF3H基因序列与其它植物F3H有较高的一致性,推测CkF3H蛋白与其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色体步移法克隆得到CkF3H起始密码子ATG上游468 bp的启动子序列,PlantCARE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,CkF3H在柠条的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;CkF3H的表达受低温、高盐、干旱和高温胁迫的诱导,并且在低温胁迫下,CkF3H的表达还受到光周期的影响。综上所述,研究结果表明CkF3H基因在柠条锦鸡儿适应低温、高盐、干旱和高温胁迫的过程中发挥作用。     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC₅₀为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

白菜CesA基因家族鉴定及表达模式分析

为探究CesA基因家族在白菜生长发育及纤维素合成过程中的作用机制,该文通过生物信息学的方法,以白菜的全基因组序列为研究区域,进行理化特征、基因结构、进化特征、保守基序及结构域、顺式作用元件和组织表达等鉴定分析。结果表明:(1)共鉴定出16个编码纤维素合成酶亚基的CesA基因,该家族成员所编码蛋白的理论等电点为4.76～9.12,相对分子量为17.76～122.67 kD,长度为153～1 089 aa。(2)15个基因不均匀地分布于白菜的7条染色体上,Bra036008定位于scaffold上。(3)大部分成员包含4～14个外显子,1～11个保守基序。(4)该家族具有保守的DDD-QXXRW 保守功能域。(5)该家族编码蛋白主要分布在质膜上,二级结构以无规则卷曲与α-螺旋为主,多数成员都含有CesA蛋白典型的N端、C端和跨膜区。(6)CesA基因在茎中表达量相对较高,其中Bra011865、Bra023952和Bra029874在茎、叶、花中显著表达。该研究结果为后续深入研究CesA基因功能以及白菜生长发育研究奠定了基础。     

红曲霉繁殖相关brlM基因鉴定及功能分析

brlA作为曲霉分生孢子形成的中心调控路径中最上游的转录因子,能够诱导下游特异基因的表达调控分生孢子的产生,brlA缺失将导致曲霉无法产生分生孢子,同时生长代谢发生改变,但对不同菌种的影响有显著差异。【目的】探究brlA同源基因brlM在红曲霉中的基因功能,探索红曲霉繁殖调控机制。【方法】从紫色红曲霉Mp-21菌株中克隆了brlA同源基因brlM。利用同源重组原理,用农杆菌介导转化法构建了brlM基因缺失突变株(△brlM),分析△brlM和野生菌株Mp-21在菌落表型、显微结构、生长速率和次生代谢产物等方面的差异,明确brlM基因在红曲霉中的主要功能。【结果】在形态水平上,brlM基因缺失菌株导致菌丝生长更加旺盛,赋予菌落更加蓬松的表型;显微观察发现△brlM失去了有性繁殖产生闭囊壳的能力,但却提升了无性繁殖产生分生孢子的能力;同时代谢产物红曲色素、莫纳可林K和桔霉素产量显著下降。【结论】红曲霉brlM基因的功能与曲霉属中的brlA并不相同,brlM基因在红曲霉有性繁殖中的作用不可替代。本研究的结果对进一步探索丝状真菌繁殖调控机制提供了新的思路。     

不结球白菜BcMPK4基因的分离及表达

为了进一步探讨植物MAPKs(mitogen-activated protein kinases)在植物防卫中的作用,该研究从不结球白菜抗病品种‘苏州青’中克隆到一个抗核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)相关基因,命名为BcMPK4(DDBJ登录号AB557751)。该基因核苷酸序列全长1 334bp,编码373个氨基酸,与已克隆的MPK4基因有不同程度的相似性。系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性。基因组DNA杂交表明,BcMPK4可能属于一个较小的多基因家族,属组成型表达。实时定量PCR检测表明,核盘菌能够诱导不结球白菜BcMPK4基因的转录表达;BcMPK4基因在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对核盘菌的抗性。     

沙柳SpsLAS基因超表达对拟南芥营养生长的影响

用沙柳SpsLAS基因构建35S∷SpsLAS超表达载体并转化野生型拟南芥,对转基因拟南芥进行表型观察,利用荧光定量PCR,对分枝、生长素及细胞分裂素相关基因进行表达分析。结果显示:(1)成功构建35S∷SpsLAS超表达载体,并获得9株纯合转基因株系,且转基因株系的萌芽速率快于野生型(对照),生活周期也较长;其中7个株系表现为生长迅速、株高增加、莲座叶叶片增大、分枝增加,2个株系表现为矮化、分枝增加、育性降低等一系列变化。(2)荧光定量PCR显示,与对照相比24h时转基因株系幼苗生长素及细胞分裂素途径关键基因无明显变化,4d时各基因在各转基因株系呈上调趋势;30d时分枝相关基因RAX1、RAX3表达量均上调,而MAX1、MAX3、REV、AXR1无明显变化。研究表明,SpsLAS基因过表达对拟南芥株型、莲座叶有明显影响,该研究结果为进一步研究该基因对分枝调控机制奠定了基础。     

中国水仙NtAP1基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)幼嫩花芽中分离得到1个与花发育相关的MADS-box基因,将其命名为NtAP1(GenBank登录号为JN704304)。该基因全长1 155bp,含有1个762bp的开放阅读框,编码253个氨基酸。系统进化分析表明,该基因属于AP1-like基因。半定量RT-PCR分析表明,该基因在水仙品种‘金盏银台’和‘玉玲珑’的花瓣、副冠、雄蕊和雌蕊中均有表达,且在雌蕊中的表达量最高。研究认为,该实验分离出的NtAP1基因在‘玉玲珑’重瓣的形成过程中没有发挥重要的作用。     

荧光假单胞菌CLW17菌株pqqE和GDH基因的功能

[背景]磷是植物生长所必需的大量元素,但绝大多数不能被植物吸收利用。然而溶磷微生物能够分泌有机酸来溶解土壤中难溶性磷,提高土壤中磷的利用率,促进植物生长,提高作物的产量和品质。[目的]探究高效解磷荧光假单胞菌CLW17菌株的pqqE和GDH基因的生理学功能。[方法]利用生物在线软件对2个基因编码蛋白进行生物信息学分析。利用同源重组技术分别获得pqqE和GDH基因缺失突变株(CLW17ΔpqqE,CLW17ΔGDH),并使用接合转移的方式获得回补菌株(ΔpqqE/pqqE,ΔGDH/GDH)。分别采用NBRIP培养基、钼锑抗比色法及高压液相色谱法(HPLC)对野生型、突变株及互补株的溶磷及产有机酸能力进行检测。[结果]pqqE和GDH基因编码氨基酸数目分别为390和803,均无信号肽。pqqE无跨膜结构域,而GDH预测有5个跨膜结构域。pqqE和GDH基因是CLW17菌株的溶磷相关基因,2个基因的缺失均使该菌株的溶磷能力显著下降,而回补株可以恢复溶磷能力。CLW17野生株能分泌多种有机酸,其中葡萄糖酸(gluconic acid,GA)含量最多,其次是乙酸;但敲除株产有机酸的能力明显降低...     

毛尖紫萼藓抗旱相关基因Gp-LEA的克隆与表达分析

以毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得的一段与LEA基因同源性较高的EST序列为基础,采用RACE技术分离该基因cDNA全长序列,命名为Gp-LEA。Gp-LEA基因的cDNA全长814bp,开放阅读框456bp,编码含151个氨基酸蛋白质。生物信息学分析结果显示,Gp-LEA蛋白为稳定蛋白,分子质量为16.612kD,理论等电点（pI）为5.06,含有LEA₂功能结构域,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。系统发生分析表明,Gp-LEA基因编码蛋白与花旗松LEA蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,Gp-LEA基因在复水和快速干旱模式下均能表达。推测Gp-LEA基因在毛尖紫萼藓的复水和干旱过程中起着重要作用。     

蔗茅EfMYB1基因的克隆与表达分析

为了充分利用蔗茅(Erianthus fulvus)野生资源,挖掘其优良的抗性基因,丰富转基因甘蔗育种候选基因库,该研究结合蔗茅转录组数据,以蔗茅99 1无性系为试验材料,利用RT PCR技术克隆蔗茅MYB基因,并对其进行生物信息学分析及胁迫表达分析,以解析蔗茅的耐寒机理,为转基因甘蔗育种奠定理论基础。结果表明：(1)成功克隆得到一个蔗茅MYB基因,命名为EfMYB1基因(登录号ON586646)。(2)生物信息学分析表明,EfMYB1基因全长1 000 bp,ORF为759 bp,编码251个氨基酸;编码蛋白具有一个保守的SANT结构域,无跨膜结构和信号肽,有多个磷酸化位点;二级结构与三级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主;与南荻相似性最高,遗传距离最近。(3)qRT PCR分析结果发现,EfMYB1基因在蔗茅根和叶组织中的相对表达量随低温胁迫时间的持续而逐渐显著上调,并于胁迫72 h时达到最大值,而在茎中的表达则几乎没有变化;茉莉酸甲酯胁迫下,EfMYB1基因的相对表达量呈先升高后降低的趋势,且在处理6 h时达到最高值;脱落酸胁迫下EfMYB1基因的表达水平较0 h时极显著降低。研究认为,EfMYB1基因属于低温胁迫响应基因,可能参与蔗茅低温胁迫下的应答反应。     

巴西橡胶树HbMyb1基因的原位PCR物理定位

为探讨巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)死皮病抗性相关HbMyb1基因的定位,采用所建立的橡胶树染色体原位PCR技术体系进行研究。结果表明,HbMyb1基因初步定位于巴西橡胶树‘热研7-33-97’的第5号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离为15.21,并观察到在巴西橡胶树‘热研7-33-97’叶片细胞核的不同分裂时期均扩增到1~2个信号。同时对染色体标本的制备、保存、预处理等方面进行了探讨。     

海岛棉GbHCT13基因的功能验证

该研究利用海岛棉‘新海21’和陆地棉ND203以及模式植物拟南芥,通过转基因及荧光定量检测等方法探究海岛棉GbHCT13基因(GenBank 登录号MW048849)在纤维发育中的功能。结果显示：(1)成功构建重组载体pCAMBIA3301 GbHCT13,经农杆菌介导法转化、除草剂抗性基因筛选、荧光定量检测方法鉴定获得转GbHCT13基因拟南芥T₃代植株4株;qRT PCR检测表明,转基因植株中GbHCT13基因表达量较野生型极显著增加。(2)转基因拟南芥过表达GbHCT13基因使植株同一时期的生长较野生型旺盛,株形、叶片数、抽薹数和茎秆表皮毛数量均与野生型存在差异;组织化学分析发现,转GbHCT13基因的拟南芥较野生型茎秆初生木质部生长活跃,导管增粗,次生木质部导管细胞壁横截面积变大,但髓质细胞无明显变化;过表达GbHCT13使拟南芥中木质素合成途径基因发生不同程度改变,其中CAD、CCoAOMT、PAL和4CL与GbHCT13基因的表达呈正相关。(3)经大田筛选、分子鉴定,成功获得转GbHCT13基因棉花植株3株;转GbHCT13基因棉花的棉纤维伸长率增加,纤维强度增大;沉默GbHCT13基因使棉花植株木质素含量降低,茎秆表皮毛数量减少,木质部导管细胞数量减少,导管细胞壁中木质素沉积量降低,而棉株并未发生株高上的明显矮化现象,且木质素合成通路中的CAD、CCoAOMT、CCR、PAL 4个基因的表达均呈降低趋势,说明抑制GbHCT13使得棉花生长代谢受阻,影响纤维发育起始。研究表明,GbHCT13基因能影响棉花植株中木质素合成从而调控纤维的生长发育,其功能与GbHCT13基因在模式植物拟南芥中的基本一致。     

猪支气管败血波氏杆菌hcp基因缺失株构建及其生物学特性研究

【目的】构建猪支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)Ⅵ型分泌系统(T6SS)溶血素共调节蛋白hcp基因缺失株,并对其基本生物学特性进行初步的研究。【方法】使用自杀性质粒介导同源重组的方法敲除猪支气管败血波氏杆菌QH0814菌株hcp基因,并比较hcp基因缺失前后,菌体对细胞的黏附入侵、小鼠毒力及组织载菌量上的差异。【结果】成功构建支气管败血波氏杆菌hcp基因缺失株QH0814Δhcp,连续传50代且遗传稳定;缺失株与亲本株生长无明显差异;缺失株的黏附能力与亲本株差异不显著,但入侵能力显著降低(P0.05);与亲本株相比,半数致死量提高,同时,缺失株对昆明鼠的感染能力也显著降低(P0.05)。【结论】hcp基因的缺失对支气管败血波氏杆菌增殖无影响,但缺失后其入侵能力和定殖能力显著降低,由此推测hcp基因与支气管败血波氏杆菌的入侵和定殖相关。     

The Drosophila Tumorous lethal hematopoietic oncogene is a dominant mutation in the hopscotch locus

The Drosophila Tumorous-lethal (Tum-l) mutation acts as an activated oncogene, causing hematopoietic neoplasms, overproliferation, and premature differentiation. Tum-l is a dominant mutation in the hopscotch (hop) locus, which is required for cell division and for proper embryonic segmentation. The Tum-l temperature-sensitive period for melanotic tumor formation includes most of larval and pupal development.     

蕙兰CfCIN基因克隆及其功能分析

以蕙兰(Cymbidium faberi Rolfe)为试验材料,采用RT-PCR技术克隆了TCP家族的CIN同源基因,开放阅读框长1 161bp,编码386个氨基酸,将其命名为CfCIN(GenBank登录号为KJ956809)。为进一步分析CfCIN的功能,构建了植物表达载体,采用农杆菌介导法转化非洲紫罗兰叶片,获得了转化植株并对转基因植株进行了性状分析。结果显示:与野生型非洲紫罗兰叶片相比,转基因植株的叶片更大,由圆形变为卵圆形,叶缘由平整光滑变为有缺刻且稍向后卷曲,叶脉明显,叶柄红,花器官形状变化不明显。研究表明,CfCIN可能参与调控植物叶片的形态建成。     

SMB基因与拟南芥细胞脱分化

应用Affymetrix基因芯片技术研究脱分化过程的全基因组表达情况,分析拟南芥叶柄细胞在脱分化过程中的差异表达基因。结果显示:(1)脱分化叶柄有4 222个基因表现出2倍或以上的表达差异,其中1 684个基因表达上调,2 538个基因表达下调。(2)半定量RT-PCR对部分差异表达基因进行验证,进一步筛选出参与拟南芥脱分化候选基因SMB(SOMBRERO)。(3)实时PCR结果表明,野生型叶柄诱导脱分化时,SMB基因表达量随着诱导时间延长而逐渐增加。(4)SMB基因功能缺失突变体smb-3经CIM诱导很难形成愈伤组织;在激素诱导不同时间段,smb-3叶柄没有明显脱分化现象,SMB基因缺失造成拟南芥叶柄脱分化障碍。研究表明,SMB基因参与拟南芥叶柄细胞脱分化过程。