共聚焦显微技术简介

共聚焦显微镜在生物学研究中得到广泛应用,共聚焦显微技术按照显微镜构造原理的不同分成激光扫描共聚焦和数字共聚焦显微技术两种,共聚焦技术具有成像清晰,获得三维图像,进行多标记观察,活细胞内动态生理反应的实时观察记录,定性定量分析等优势,与共聚焦显微技术相关的技术有荧光染料的选择,荧光指示剂装载以及图像数据处理等。     

水稻双受精过程的共聚焦显微镜观察

(郑州大学离子束生物工程省重点实验室,郑州450052)摘要:首次利用核特异荧光染色与整体透明技术并利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)对水稻双受精过程进行了观察。激光扫描共聚焦显微镜具有"组织与细胞CT"的功能,可以对整体组织进行扫描并构建三维结构。经荧光染色及透明处理后,在激光扫描共聚焦显微镜下经488nm激光激发,胚囊内各细胞的细胞核以及核仁发出明亮荧光,细胞核轮廓比较清晰,层次感强,并能清晰观察到胚囊内各细胞的结构特点和空间位置关系。不论是对开花前较小的成熟胚囊材料还是开花后较大的胚囊材料都取得了较好的观察效果。同传统的光学显微镜和荧光显微镜相比,其观察到的图像更清晰、更直观、更具立体感。     

激光扫描共聚焦显微镜在医学研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）具有高分辨率、高灵敏度、三维重建、动态分析等优点,使图像更为精确清晰和数字化。该仪器现已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、遗传学和药理学等研究领域中。本文简述了激光扫描共聚焦显微镜的结构、工作原理并归纳了其在医学各领域研究中的应用。     

激光扫描共聚焦显微镜在孢粉研究中的应用

在MRC1000型激光扫描共聚焦显微镜下,观察具有自发荧光的孢子、花粉、沟鞭藻以及疑源类等不同时代的化石标本,发现现代和第四纪孢粉具有较强的自发荧光,古生代的孢子自发荧光强度最弱。后者很难聚焦成清晰的二维投影图像。在观察孢粉样品过程中,选择合适的激光波长及激光扫描强度是关键的技术问题。一般以氪、氩离子激发为效果最佳,以波长488,568,647nm最合适。     

三种显微技术对人毛囊蠕形螨的观察和研究

目的 采用荧光显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜对人体毛囊形蠕形螨进行形态学观察.方法 选用5 μg/mL碘化丙啶(propidine iodide,PI)对虫体进行荧光染色,避光染色15 min,分别置于荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察;2.5%戊二醛固定虫体标本,梯度酒精和叔丁醇脱水,金喷镀后扫描电镜观察.结果 荧光显微镜下碘化丙啶对虫体有很强的结合力,虫体荧光信号均匀展示于细胞表面,充分展现虫体形态,扫描电镜更加清楚、细致地展示人体毛囊型蠕形螨的超微结构,激光共聚焦显微镜将虫体分层扫描图片进行三维重建,真实、完全、直观地展露了虫体.结论 三种显微技术均可展示蠕形螨超微形态.PI对虫体有很好的荧光染色作用,使激光扫描共聚焦显微镜能够获得更加精准的超微形态结构,结合三维重建技术有着广泛的应用价值.     

鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察

将鸭梨PPO基因与绿色萤光蛋白GFP基因相融合共同进行遗传转化的方式,对鸭梨多酚氧化酶开展细胞定位研究。通过克隆该酶基因除终止密码子TAA外长度为1 779bp的CDS序列,与绿色荧光蛋白基因重组构建了荧光表达载体pBI121-PPO-GFP,借助农杆菌转化烟草,转基因烟草叶片细胞经激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光与叶绿体自发荧光相重合。结果表明鸭梨多酚氧化酶为叶绿体蛋白质。     

用激光扫描共聚焦显微镜观察雪松花粉和花粉管

为更直观地观察和显示花粉和花粉管中细胞结构及其细胞核的状态与行为。雪松花粉和花粉管经卡诺液固定,分别以埃氏苏木精、曙红、Hoechst 33243单染和曙红-Hoechst 33342双染后,用冬青油整体透明,在激光扫描共聚焦显微镜下观察。4种染色法观察效果不同;以曙红-Hoechst 33342双染的样品观察效果最佳,在紫外光激发下清晰地显示出细胞核,在488 nm激光激发下不仅能清晰看到花粉和花粉管壁结构,且能分辨管细胞、柄细胞及体细胞的结构特点和空间位置关系。建立了一种快速简便的适于在激光扫描共聚焦显微镜下观察花粉和花粉管中成员细胞结构及其细胞核的状态、行为的制片技术;激光扫描共聚焦显微镜具有独特的共轭成像装置、连续光学扫描、图像三维重组和多通道检测等功能,极好地展示了雪松花粉和花粉管的结构特点,相比于传统的光学显微镜和荧光显微镜,其观察到的图像更清晰、更直观、更具立体感。     

激光共聚焦显微技术在植物学中的应用

激光扫描共聚焦显微镜（Ｌａ－ｓｅｒ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｃｏｎｆｏｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ,ＬＳＣＭ）是近年来发展起来的一种新型高精度显微镜,它在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,使用可激发的荧光探针对样品进行标记,利用计算机进行图像采集处理,从而可得到样品内部细微结构的荧光图像。目前此种显微技术不仅用于观察经固定的各种细胞和组织结构,而且还可对活细胞的形态、结构,离子实时动态等进行观察和定量荧光测定,以及定量图像分析。另外,该仪器还具备样品断层扫描,三维图像重建的独特功能。因此,共聚焦…     

激光共聚焦扫描技术与荧光组织化学染色

激光扫描共聚焦显微镜Confocal Laser Scanning Microscope)是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术[1].在传统光学显微镜基础上,激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源,采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出.其特点是可以对样品进行断层扫描和成像,进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构.同时,利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针,该技术也可对活细胞内的生命活动进行动态观察和分析,是细胞生物学研究的重要手段和工具,极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识.     

激光扫描共聚焦显微镜荧光探针的选择和应用

激光扫描共聚焦显微镜是检测生物荧光信号的最新技术手段。不仅广泛用于荧光定性、定量测量,还可用于活细胞动态荧光监测、组织细胞断层扫描、三维图象重建、共聚焦图象分析、荧光光漂白恢复、激光显微切割手术等。本文拟就激光扫描共聚焦显微镜常用的检测内容及其相关荧光探针的选择和应用做一简单的介绍。     

利用激光扫描共聚焦显微镜研究植物细胞发育形态学变化

通过激光扫描共聚焦显微镜,利用不同种类(波长)的激光研究植物细胞发育形态学变化。结果表明,利用紫外激光(351 nm)扫描可以清楚地观察到拟南芥叶片表皮细胞的形态及其变化,在已分化的叶片表皮上可观察到包括“铺垫”表皮细胞(epidermal pavement cells)、气孔保卫细胞(guard cell)、气孔伴胞(subsidiarycells)、表皮毛细胞(trichomes)和表皮毛的足细胞(socket cells)等多种形态不同的细胞种类;利用蓝光激光(488nm)辅助曙红浅染,可清晰地显示出拟南芥根生长区内部的各种原始细胞,包括静止区(quiescent center)细胞、皮层/内皮层原始细胞(cortex/endodermal initial cell)、表皮/根冠原始细胞(epidermal/root cap initial cell)和中柱/根冠原始细胞(columella/root cap initial cell)等。利用双光子激光(800 nm)连续扫描30 s可以诱发叶绿体产生自发荧光,并可观察到叶绿体在叶肉细胞中的运动轨迹。结果说明激光扫描共聚焦显微镜在植物细胞形态及发育研究上具有独特的功能。     

共聚焦激光扫描显微镜技术

自1985年共聚焦激光扫描显微镜问世以来,该项技术一直在飞速发展和完善。近年来一系列新型的共聚焦显微镜相继研制成功和投入使用,如视频共聚焦激光扫描显微镜、双光子显微镜、4Pi显微镜、荧光寿命成像显微镜等,它们较传统共聚焦显微镜有着各自独特的优势,了解它们的基本性能和特点有助于其在生物学领域更为广泛深入的应用。     

激光共焦显微成像的最新进展及其在生命科学研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜近年来得到了迅速发展,是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。通过它可以对观察样品进行无创断层扫描和成像,在生物学和医学研究诊断的各个方面都得到了广泛的应用。本文主要介绍了激光扫描共焦显微镜的基本原理和发展状况,并着重介绍了在共焦荧光显微镜中采用薄荧光层和切片成像特性图来表征成像状态的功能。这种方法一般用于表征共聚焦和多光子显微镜的成像特性,是比较显微镜切片成像条件、成像质量等相关性能的重要依据。     

激光共聚焦显微技术在瓮安生物群中的应用

激光共聚焦显微技术是一种以激光作为激发光源,通过特殊装置"针孔"来过滤离焦光线以提高光学分辨率和对比度的光学成像技术。由于大部分化石不能自发荧光,该技术在古生物学领域尚未实现大范围的应用。但若围岩能自发荧光而与化石之间具有一定衬度,或化石因含特殊成分能在特定波段激光照射下自发荧光而产生结构衬度,则可以运用激光共聚焦显微技术获得在普通光学显微镜及荧光显微镜下难以清晰观察到的信息。为推动激光共聚焦技术在古生物学领域中的应用,文中系统介绍了该技术的原理与使用方法,并以埃迪卡拉纪磷酸盐化特异埋藏的瓮安生物群微体化石为例,展示了该技术在化石成像中的若干优势。实验结果表明,瓮安生物群微体化石因富含磷灰石可自发荧光实现成像,使用激光共聚焦显微成像技术观察瓮安生物群化石薄片不仅可以获得较好衬度,而且还能提高成像的分辨率和清晰度。此外,在化石薄片的厚度范围内还可以实现化石结构三维重建。     

一种同步观察喜树碱与菌根丛枝结构的方法

本文介绍一种用激光共聚焦扫描显微镜同步观察喜树碱、丛枝茵根及其结构的方法.喜树丛枝茵根经甘油浸润和明胶包埋后制成切片,再经酸性品红染色后在激光共聚焦扫描显微镜下观察.波长488mm处激发光下可获得清晰的丛枝茵根透射图像.364 nm处激发光下可获得喜树碱的荧光图像,通过两图像的叠加,在喜树丛枝菌根中得到喜树碱的定位图像.用此方法初步研究了喜树丛枝茼根的喜树碱分布.     

胰岛素对β细胞FoxO1胞质-胞核穿梭定位的影响

目的:通过激光扫描共聚焦显微镜对小鼠胰岛素瘤min6细胞免疫化学染色后观察外源性高胰岛素对Fox O1胞质-胞核穿梭定位的影响。方法:小鼠胰岛素瘤min6细胞用DMEM(low glucose)培养基(含有15%FBS、100 U/m L青霉素、100 U/m L链霉素)于25 m L培养瓶放置在37℃、5%CO2浓度的细胞孵箱中培养。细胞爬片后给予100μIU/m L浓度胰岛素分别刺激12、24和48小时。细胞免疫化学染色后激光扫描共聚焦显微镜观察Fox O1的表达位置变化,用Image pro plus软件对Fox O1荧光强度进行半定量分析。结果:与低糖孵育的对照组相比,胰岛素孵育12 h、24 h和48 h时胞质内Fox O1荧光强度逐渐增强,而细胞核Fox O1荧光强度减弱(P0.05)。结论:高浓度胰岛素孵育min6细胞使Fox O1出细胞核转位至细胞质,并且具有时间依赖性,提示Fox O1是高胰岛素血症对β细胞功能影响的机制之一。     

胰岛素对beta细胞FoxO1 胞质-胞核穿梭定位的影响

目的：通过激光扫描共聚焦显微镜对小鼠胰岛素瘤min6 细胞免疫化学染色后观察外源性高胰岛素对FoxO1 胞质- 胞核穿 梭定位的影响。方法：小鼠胰岛素瘤min6 细胞用DMEM( low glucose )培养基（含有15%FBS 、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉 素）于25 mL培养瓶放置在37 ℃、5%CO2浓度的细胞孵箱中培养。细胞爬片后给予100 uIU/mL 浓度胰岛素分别刺激12、24 和 48 小时。细胞免疫化学染色后激光扫描共聚焦显微镜观察FoxO1 的表达位置变化,用Image pro plus 软件对FoxO1 荧光强度进 行半定量分析。结果：与低糖孵育的对照组相比,胰岛素孵育12 h、24 h和48 h时胞质内FoxO1 荧光强度逐渐增强,而细胞核 FoxO1 荧光强度减弱（P＜0.05）。结论：高浓度胰岛素孵育min6细胞使FoxO1 出细胞核转位至细胞质,并且具有时间依赖性,提 示FoxO1是高胰岛素血症对beta细胞功能影响的机制之一。     

拟南芥未知功能基因At3g61870编码蛋白的叶绿体定位研究

利用反向遗传学研究方法对1个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At3g61870编码蛋白进行了亚细胞定位研究.通过克隆At3g61870基因5′端长229 bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-CP-TP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥.转基因植株的叶肉细胞经激光共聚焦显微镜观察,叶绿素自发荧光与GFP荧光共定位于叶绿体中.结果表明,未知功能基因At3g61870编码的蛋白质为叶绿体蛋白质.     

中药臭灵丹中3, 5-二羟基-6, 7, 3′, 4′-四甲氧基黄酮对人鼻咽癌CNE细胞凋亡的影响及机制

中药臭灵丹中黄酮类化合物3,5-二羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基黄酮(3,5-hydroxy-6,7,3′,4′-tetramethoxyflavone,HTMF)体外对多种肿瘤细胞有抑增殖作用,但机制尚未完全清楚.为探讨HTMF对人鼻咽癌CNE细胞凋亡的影响,用MTT法检测HTMF对CNE细胞株的增殖抑制率,倒置显微镜观察HTMF作用于CNE细胞后细胞形态变化,Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态的变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,Western blot法检测凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的变化,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位(△准m)值的改变,并用JC-1荧光染料染色,激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化.结果显示,分离自臭灵丹的HTMF呈浓度、时间双重依赖性显著抑制CNE细胞的增殖,诱导细胞凋亡,引起线粒体膜电位下降及凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的活化.提示:3,5-二羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基黄酮对人鼻咽癌CNE细胞的生长有显著的抑制作用,并可通过降低线粒体膜电位激活Caspase9,进而活化Caspase3诱导CNE细胞凋亡.     

共聚焦激光扫描对呼吸窘迫综合症大鼠肺组织的观察

目的：为了更直观地观察和显示呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrom,ARDS)典型的病理变化(肺泡内形成一层蛋白质透明膜)。方法：利用百草枯(Paraqual)染毒SD大鼠复制ARDS实验动物模型,取肺病理组织,切片,试剂Goat—Anti-Rat—FITC IgM IgG染色,共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scarming microscope,CLSM)观察。结果：CLSM能清晰到样品内不同层面的病理变化。结论：共聚焦激光扫描显微镜能清晰观察样品内不同层面的结构,相比于传统的光学显微镜,其观察到的图像更直观、更具立体感,能更好表达ARDS的病理变化特征。