针对线粒体复合体Ⅰ基因突变的Leigh综合征细胞模型的基因治疗研究

该研究旨在探讨转导酵母NDI1基因对线粒体ND1基因突变的Leigh综合征细胞模型的恢复效果,从而为线粒体复合体I基因突变所致Leigh综合征的基因治疗提供研究基础。已知线粒体复合体Ⅰ的ND1基因的m.3697G>A突变是Leigh综合征的致病突变之一。该研究采用已构建的携带该ND1基因突变的胞质杂合细胞作为线粒体复合体I基因突变的Leigh综合征细胞模型,将酵母NDI1基因的重组慢病毒转导至该细胞模型中表达NDI1蛋白(即酵母复合体I),检测NDI1蛋白对线粒体复合体I各方面功能的恢复效果。酵母NDI1基因转导该细胞模型后能高效表达并定位于线粒体。转导酵母NDI1基因可以恢复复合体I酶活性(外源酵母复合体Ⅰ的补偿)、线粒体有关的氧耗水平、线粒体偶联效率、线粒体有关的ATP水平,并且可以降低线粒体氧化应激水平、线粒体自噬水平。在线粒体复合体Ⅰ基因突变的Leigh综合征细胞模型中,酵母复合体Ⅰ可以替代性补偿线粒体的氧化磷酸化功能,并且可以缓解线粒体的氧化应激和自噬状态。该研究结果可以为线粒体复合体Ⅰ基因突变所致Leigh综合征的基因治疗提供研究基础。     

mtDNA单倍型D4和B4a细胞线粒体功能及其影响衰老发生的机制研究

该文初步分析了两个与衰老发生抑制及促进的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)单倍型D4和B4a细胞的线粒体功能情况,并对其影响衰老的可能机制进行了探究。通过细胞融合构建两个核背景一致但mtDNA单倍型分别是D4和B4a的胞质杂合细胞。应用RT-PCR方法检测细胞mt DNA拷贝数以及线粒体基因的mRNA水平,氧电极法和非变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(blue native polyacrylamide gelelectrophoresis,BN-PAGE)技术检测细胞线粒体氧化呼吸能力及线粒体复合体水平,TMRM染料和DCFH-DA染料法检测细胞线粒体膜电位和活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成水平。结果显示,D4单倍型细胞线粒体氧呼吸能力、膜电位水平以及线粒体基因(mt-ND1、mt-7S RNA)转录水平均明显高于B4a单倍型细胞,而ROS生成水平明显降低,mt DNA拷贝数则并无明显差异。该结果表明,在D4单倍型细胞中,通过提高某些线粒体基因的表达,使得线粒体呼吸复合体表达得到提升,继而提高线粒体氧化呼吸功能,降低细胞氧化损伤,从而延缓衰老的发生。     

靶向核酸酶在线粒体基因组编辑中的应用

线粒体基因组(mt DNA)的突变可导致多种人类疾病,其中绝大多数的mt DNA突变是异质性的:即在细胞中同时存在突变型和野生型的mt DNA,当突变型mt DNA的比例达到一定阈值时,就会引发疾病的发生。线粒体靶向的核酸内切酶可以诱导mt DNA异质性的改变,将突变型mt DNA的含量控制在发病阈值之下,从而达到疾病治疗的目的。本研究介绍了线粒体靶向的锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas)以及常规的限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)在线粒体基因组编辑及疾病治疗中的应用。     

线粒体T12338C突变可能是与Leber遗传性视神经病变相关的突变位点

Leber遗传性视神经病变变(Leber’s hereditary optic neuropathy,LHON)是一种与线粒体DNA(Mito-chondrial DNA,mtDNA)突变相关的母系遗传性眼科疾病。文章报道了两例具有典型LHON临床、分子遗传特征的中国汉族家系。首先通过对家系先证者和其他成员进行眼科相关检查,发现两个家系成员中视力都仅有先证者一人损害严重,即外显率很低。经常规的方法对母系成员进行mtDNA测序及相关软件分析,结果发现携带ND4 G11696A和ND5 T12338C同质性突变位点,多态性变异位点均属于东亚单体型F2。线粒体DNA ND4 G11696A是一个已知的与LHON相关的突变位点,而T12338C位于线粒体氧化磷酸化复合体I亚基ND5的第2个碱基,该突变使起始密码子由蛋氨酸转变成苏氨酸,并且紧连tRNALeu(CUN)的3′末端。这可能影响tRNA Leu(CUN)空间结构和稳定性发生改变,以及起始密码子改变导致线粒体ND5蛋白合成功能受损和ATP障碍,最终导致需求能量高的视神经受损和视力损害。因此,线粒体ND4 G11696A和ND5 T12338C突变可能协同作用Leber遗传性视神经病变的发生,是与LHON相关的mtDNA突变位点,但外显率很低说明突变本身不足以造成LHON的表型表达,提示其他修饰因子(核修饰基因、环境等)可能对这两个家系发病起协同作用。     

人类线粒体tRNA生物合成与线粒体疾病

线粒体是普遍存在于真核细胞中的一类细胞器.每个线粒体含有多个拷贝的闭合环状双链DNA. 人类线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)共编码22种线粒体tRNA(mitochondrial tRNA,mt tRNA), 2种rRNA 及13种多肽.mt tRNA独特的结构特点决定了它们与具有典型三叶草结构的细胞质 tRNA不同.编码mt tRNA的基因突变频率较高,这可能是引起线粒体功能障碍的主要原因之一. 同时 ,这与很多病理现象相关.目前发现,大量与mt tRNA生物代谢和功能相关的核因子包括加工内切酶、 tRNA修饰酶和氨酰-tRNA合成酶.这些核因子的异常导致了疾病相关的tRNA致病突变.由此可见mt tRNA功能对于线粒体活性的重要性.     

常见结直肠癌无线粒体DNA细胞株的建立

目的:流行病学研究表明结直肠癌细胞线粒体DNA(mt DNA)拷贝数变异与患者预后具有显著相关性,但因缺乏相关体外细胞模型导致其细胞生物学效应及具体分子机制尚不明确。因此研究建立结直肠癌ρ0细胞株(无mt DNA)的方对该研究域具有重大意义。方法:在含有丙酮酸、尿苷及不同浓度溴化乙锭的培养基中培养大肠癌细胞株SW480、HCT 116、HCT-8,以不加溴化乙锭的细胞为对照,利用实时定量PCR技术监测不同处理组mt DNA拷贝数的变化,并观察结直肠癌ρ0细胞线粒体形态数目及细胞形态的变化。结果:SW480细胞用50 ng/m L EB处理25代后,再以100 ng/m L EB处理14代可成功构建SW480ρ0细胞株;HCT116细胞加用EB 100 ng/m L培养32代,继续用EB 200 ng/m L培养10代,再用EB 500 ng/m L培养3代,可成功获得HCT116ρ0细胞株;HCT-8细胞用200 ng/m L EB培养24代,可成功获得HCT-8ρ0细胞株。同时,ρ0细胞较亲本细胞变大变长,其线粒体的个数增多,线粒体形态变大变长。结论:利用EB处理法可成功构建大肠癌ρ0细胞株,但不同肠癌细胞方法不尽相同。mt DNA拷贝数的降低可显著影响大肠癌细胞的形态。     

线粒体DNA数目不同的人角质形成细胞模型的建立

该研究采用溴化乙锭(ethidium bromide,Et Br)对人永生化角质形成细胞(HaCaT)进行诱导,采用RT-PCR法、MTT法和健那绿染色技术联合鉴定Et Br对HaCaT细胞线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)拷贝数的影响,建立不同mt DNA拷贝数目的HaCaT细胞模型。结果显示,HaCaT细胞经100 ng/m L和50 ng/m L Et Br分别处理10 d后,细胞形态随着处理时间的延长发生改变,由规则铺路石形状逐渐变圆,某些细胞体积变小,成团生长,细胞膜边缘不光滑,且随着mt DNA数目的减少,细胞增殖速率明显下降。RT-PCR分析结果显示,与对照组相比,50 ng/m L和100 ng/m L Et Br处理10 d的HaCaT细胞中,mt DNA的拷贝数分别减少了52.9%和97.6%[以线粒体DNA脱氢酶1(mitochondrial NADH dehydrogenase 1 gene,ND1)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的比值来表示mt DNA的相对拷贝数变化情况]。健那绿染色显示,对照组HaCaT细胞中可见分散存在的蓝绿色线粒体颗粒,100 ng/m L Et Br处理10 d后的HaCaT细胞中,显微镜下蓝绿色线粒体颗粒明显减少。综上所述,该研究证明了HaCaT细胞可通过Et Br诱导被成功培养成ρ–细胞,且Et Br浓度与HaCaT细胞mt DNA拷贝数的变化在一定的范围内存在着剂量–效应关系。     

克氏光唇鱼线粒体基因组测定及光唇鱼属的系统发育分析

根据侧条光唇鱼(Acrossocheilus parallens)线粒体基因(mt DNA)序列设计引物,采用引物步移和PCR扩增产物测序,获得了克氏光唇鱼(A.kreyenbergii)的mt DNA全序列。结构分析表明,克氏光唇鱼mt DNA为首尾闭合的环状基因,全长16 596 bp,编码37个基因,包括13个蛋白编码基因、22个t RNA基因、2个r RNA基因和两段非编码区(D-loop和轻链复制起点OL),碱基组成具有明显的A+T偏好和反G偏倚现象。13个蛋白编码基因中,除COⅠ的起始密码子是GTG,其余基因的起始密码子均为ATG;终止密码子包括完全的终止密码子TAA(38.46%)和TAG(7.69%),不完全的终止密码子TA(15.38%)和T(38.46%)。在D-loop区的811~837 bp区间发现了一段"TA"短串联重复序列。从蛋白编码基因所包含的信息量、变异位点和变异率看,ND5、ND4、COⅠ和ND2最适合作为光唇鱼属种间系统发育分析的分子标记。采用贝叶斯法利用13个蛋白编码基因所构建的系统发育树显示,光唇鱼属和白甲鱼属(Onychostoma)的24种鱼类各自没有聚为单系群,相互间不能明确区分。     

线粒体DNA单体型M8a对转线粒体细胞线粒体能量代谢的影响

为了观察线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)单体型M8a对细胞线粒体能量代谢的影响,该研究利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导血小板–细胞融合技术,构建mt DNA单体型M8a和G2a转线粒体细胞(transmitochondrial cytoplasmic hybrid cell,cybrid)模型。后续运用Real-time PCR检测细胞mt DNA拷贝数和RNA转录水平,多功能酶标仪检测细胞活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),线粒体呼吸测定仪检测细胞内源性氧呼吸(oxygen consumption,OC)情况。结果表明,与G2a细胞相比,M8a细胞mt DNA拷贝数和线粒体轻链(L链)转录水平明显降低(P0.01),细胞基础耗氧量、ATP合成耗氧量、最大氧呼吸能力和MMP显著下降(P0.05),细胞ROS水平显著上升(P0.05)。mt DNA单体型M8a细胞的线粒体呼吸功能受损,可能增加了该单体型人群罹患2型糖尿病的风险。     

mt ND2基因多态性与弱精子症的相关性分析

为了探讨线粒体ND2(mt ND2)基因多态性与弱精子症的相关性,按WHO标准收集了134例弱精子症和1 12例精子活力正常的精液标本,PCR测序或双向等位基因PCR(Bi-PASA)技术分析ND2基因多态性,统计ND2基因4个位点多态性在两组间的差异。应用变性高效液相色谱(DHPLC)分析m.5442TC和m.5466AG多态性变异的异质性。结果发现了34个变异位点,其中6个位点未曾报道;ND2基因m.5351AG、m.5460GA和m.5466AG变异率弱精子症组显著高于对照组(P0.05),m.5442TC变异率对照组显著高于弱精子症组(P0.05);进一步分析m.5460GA和m.5466AG突变阳性标本精子活力显著低于突变阴性标本(P0.001),m.5442TC突变阳性标本精子活力显著高于突变阴性标本(P0.001)。提示:ND2基因一些核苷酸变异(m.5351AG、m.5460GA和m.5466AG)可能与弱精子症有关,m.5460GA和m.5466AG错义突变可能是精子活力的有害因素,而m.5442TC多态性可能对精子活力具有一定的帮助。     

线粒体DNA甲基化研究进展

DNA甲基化是表观遗传修饰的重要方式之一.线粒体是真核细胞内的关键细胞器,线粒体DNA(mt DNA)编码部分线粒体基因,其mt DNA的甲基化修饰可能引起所编码基因的异常表达,从而参与调节生理和病理过程.本文就目前mt DNA甲基化及其在疾病中的研究进展进行总结.     

哺乳类线粒体基因组

作为真核细胞的一种重要细胞器的线粒体含有独立的并自主复制和转录的DNA基因组。虽然线粒体蛋白质的大部分系核DNA编码,但有一小部分是线粒体DNA(mt DNA)编码,并由线粒体的蛋白质合成系统合成。线粒体蛋白质合成系统中的rRNA和tRNA也是mt DNA编码。mt DNA的复制、转录以及蛋白质合成系统均有其本身特点,既与非线粒体真核系统有所不同,又有别于原核细胞中者。因此,线粒体基因组的研究在生物学上有重要意义。此外,线粒体的起源和进化是许多生物学家所感兴趣的和长期争论的问题,而mt DNA的进化比较     

哺乳类线粒体基因组

作为真核细胞的一种重要细胞器的线粒体含有独立的并自主复制和转录的DNA基因组。虽然线粒体蛋白质的大部分系核DNA编码,但有一小部分是线粒体DNA(mt DNA)编码,并由线粒体的蛋白质合成系统合成。线粒体蛋白质合成系统中的rRNA和tRNA也是mt DNA编码。mt DNA的复制、转录以及蛋白质合成系统均有其本身特点,既与非线粒体真核系统有所不同,又有别于原核细胞中者。因此,线粒体基因组的研究在生物学上有重要意义。此外,线粒体的起源和进化是许多生物学家所感兴趣的和长期争论的问题,而mt DNA的进化比较     

肝癌患者单个核细胞线粒体DNA拷贝数与抗氧化能力的变化

目的:探讨肝癌患者单个核细胞(PBMC)线粒体DNA(mt DNA)拷贝数的变化及其与机体抗氧化能力的关系。方法:用Ficoll Hypaque离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),采用实时荧光定量PCR反应,检测线粒体NADH脱氢酶亚基1(ND1)基因的拷贝数,并以核基因组的β-actin作为内参基因,比较25例肝癌患者与30例健康人外周血单个核细胞中mt DNA拷贝数的差异。流式细胞术检测单个核细胞活性氧(ROS)含量的变化。生化检测法检测血浆中总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果:肝癌组外周血单个核细胞ND1基因拷贝数是健康对照组的73%,表明肝癌患者外周血单个核细胞mt DNA拷贝数明显下降。肝癌组单个核细胞活性氧含量的平均荧光强度为(417.82±110.62),健康对照组为(301.82±75.54),肝癌组单个核细胞活性氧含量显著高于健康对照组(P0.01)。肝癌组血浆总抗氧化能力(单位/毫升血浆)吸光度为(1.30±0.85),健康对照组为(3.20±1.62),肝癌组血浆总抗氧化能力显著低于健康对照组(P0.01)。结论:肝癌患者的外周血单个核细胞线粒体DNA拷贝数减少可能与机体抗氧化水平下降有关。     

携带线粒体CO1/tRNA~(Ser(UCN))7444G>A突变和12S rRNA 1555A>G突变的非综合征性耳聋家系的线粒体功能研究

该研究通过构建携带突变的血小板融合细胞系,探讨12S r RNA 1555AG和CO1/t RNA~(Ser(UCN))7444GA突变对线粒体功能的影响。首先,采集携带12S r RNA 1555AG和CO1/t RNA~(Ser(UCN))7444GA双突变、单突变及正常对照组患者外周血,构建血小板融合细胞系。其次,对构建成功的血小板融合细胞系进行一系列功能研究,包括细胞内活性氧类(ROS)生成量、线粒体膜电位水平、蛋白质水平和t RNA稳态水平的分析。通过对各组血小板融合细胞系的线粒体功能的研究,结果与对照组相比发现,细胞内ROS生成量显示,仅携带m.1555AG单突变组细胞ROS上升66.54%,仅携带m.7444GA单突变组细胞ROS上升83.09%,而同时携带m.1555AG和m.7444GA双突变组细胞ROS上升131.08%;线粒体膜电位水平显示,m.1555AG单突变组的ΔΨm水平下降32.86%,m.7444GA单突变组的ΔΨ水平下降0.66%,m.1555AG和m.7444GA双突变组的ΔΨm水平下降29.86%;Western blot结果显示,各突变样本的CO1、CO2均有不同程度的下降,仅携带m.1555AG单突变组中ND4、ND5和ND6差异不明显,而仅携带m.7444GA单突变组和m.1555AG和m.7444GA双突变组中ND4、ND5和ND6均有不同程度的下降;Northern blot结果显示,m.7444GA对t RNA~(Ser(UCN))稳态水平的改变并不是很明显。提示CO1/t RNA~(Ser(UCN))7444GA突变可能只是12S r RNA 1555AG突变的病理效应的修饰因子,但在耳聋的发生过程中,还是12S r RNA 1555AG突变起主导作用。     

麦穗鱼线粒体基因组序列测定及分析

利用麦穗鱼Pseudorasbora parva和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出2对长批引物和30对短批引物,采用基于长PCR的2次PCR扩增法测定并注释麦穗鱼线粒体基因组全序列。结果表明,麦穗鱼线粒体基因组长16600bp,A+T含量为58.9%,37个基因位置及组成与其它硬骨鱼一致,均由13个蛋白编码基因、22个tRNA、2个rRNA基因和1个控制区(D-loop)组成。其中L链仅含8个tRNA(Pro、T yr、Ser、Ala、Asn、Cys、Glu、Gln)及ND6基因,其余基因皆由H链编码。基因排列紧密,间隔序列共计13处64bp,长度从1～32bp不等;基因重叠区7处23bp,重叠碱基数在1～7bp之间。13个蛋白编码基因中,除COI起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子;有8个基因(ND1、ND2、COI、ATP6、ATP8、ND4L、ND5、ND6)3’端有完全的TAA或TAG终止密码子,其它5个基因终止密码子为不完整的TA(ND3和ND4)或T(COⅡ,COⅢ,Cyt b)。除tRNASer(AGY)外,其余21个tRNA基因的二级结构均为典型的三叶草结构。预测的lrRNA二级结构共有6个结构域,53个茎环结构,srRNA二级结构包含43个茎环结构。控制区(D-loop)存在3个结构区:终止序列区(TAS)、中央保守区(CSB-F、CSB-D)和保守序列区(CSB-1、CSB-2、CSB-3),其中TAS与DNA复制终止相关,出现茎环结构。     

SEQUENCE AND ANALYSIS OF COMPLETE MITOCHONDRIAL GENOME OF PSEUDORASBORA PARVA

利用麦穗鱼Pseudorasbora parva和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出2对长批引物和30对短批引物,采用基于长PCR的2次PCR扩增法测定并注释麦穗鱼线粒体基因组全序列.结果表明,麦穗鱼线粒体基因组长16600 bp,A+T含量为58.9％,37个基因位置及组成与其它硬骨鱼一致,均由13个蛋白编码基因、22个tRNA、2个rRNA基因和1个控制区(D-loop)组成.其中L链仅含8个tRNA(Pro、Tyr、Ser、Ala、Asn、Cys、Glu、Gln)及ND6基因,其余基因皆由H链编码.基因排列紧密,间隔序列共计13处64 bp,长度从1～32 bp不等;基因重叠区7处23 bp,重叠碱基数在1～7bp之间.13个蛋白编码基因中,除COI起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子;有8个基因(ND1、ND2、COI、ATP6、ATP8、ND4L、ND5、ND6)3端有完全的TAA或TAG终止密码子,其它5个基因终止密码子为不完整的TA (ND3和ND4)或T(COⅡ,COⅢ,Cyt b).除tRNAser(AGY)外,其余21个tRNA基因的二级结构均为典型的三叶草结构.预测的lrRNA二级结构共有6个结构域,53个茎环结构,srRNA二级结构包含43个茎环结构.控制区(D-loop)存在3个结构区:终止序列区(TAS)、中央保守区( CSB-F、CSB-D)和保守序列区(CSB-1、CSB-2、CSB-3),其中TAS与DNA复制终止相关,出现茎环结构.     

一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法北大核心CSCD

旨在建立一种简便检测线粒体DNA(mt DNA)核酸酶靶向剪切活性的方法。利用转基因技术,将一段含有两个靶向目标序列(T1、T2)的线粒体DNA序列随机整合到宿主基因组中,通过实时荧光定量PCR筛选单拷贝或低拷贝的单克隆转基因细胞株。将含有T1、T2的CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9质粒分别瞬时转染到所选细胞株中,靶向剪切核基因组,在靶向目标序列处造成DNA双链断裂,引发非同源末端连接修复机制,引入插入或缺失突变。观察测序峰图,证明两个靶向目标序列T1、T2均有剪切效率,且T1高于T2。建立了一种高效快速检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法。     

一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法

旨在建立一种简便检测线粒体DNA(mt DNA)核酸酶靶向剪切活性的方法。利用转基因技术,将一段含有两个靶向目标序列(T1、T2)的线粒体DNA序列随机整合到宿主基因组中,通过实时荧光定量PCR筛选单拷贝或低拷贝的单克隆转基因细胞株。将含有T1、T2的CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9质粒分别瞬时转染到所选细胞株中,靶向剪切核基因组,在靶向目标序列处造成DNA双链断裂,引发非同源末端连接修复机制,引入插入或缺失突变。观察测序峰图,证明两个靶向目标序列T1、T2均有剪切效率,且T1高于T2。建立了一种高效快速检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法。     

胞质异质性——人类肿瘤组织线粒体基因突变的普遍现象

为了探讨不同肿瘤组织中线粒体基因体细胞性突变的胞质异质性和同质性状态,利用32对重叠引物对149例肿瘤组织和匹配的正常组织的全线粒体基因进行PCR扩增,并同时进行时相温度梯度凝胶电泳扫描突变筛选,基因测序确定突变类型与异质状况。结果表明,不同肿瘤组织中线粒体基因体细胞性突变的异质率不同,口腔癌（65%）和食道癌（64%）具有较高的异质率,其次为乳腺癌（45.9%）。4种转换形式的发生频率Hm→Hm > Hm→Ht > Ht→Hm > Ht→Ht。碱基转换的主要转换形式为Hm→Hm,碱基颠换则以Hm→Ht。认为胞质异质性是人类肿瘤组织线粒体基因突变的普遍现象。Abstract: To explore the status of heteroplasmy and homoplasmy of Mitochondrial DNA somatic mutations in different tumors. DNA from 149 tumors and corresponding normal tissues were extracted and entire mitochondrial genome was amplified using 32 pairs of overlapping primers. The somatic mutations were screened by temporal temperature gradient gel electrophoresis and their heteroplasmic statute were identified by sequencing. The results showed that the incidence rate of heteroplasmy of mitochondrial DNA somatic mutations varies in different tumors. There is a high rate of heteroplasmic mutation in oral cancer (65%) and esophageal cancer (64%), followed by breast cancer (45%). The frequency of four transfer types is Hm (homoplasmy)→Hm (heteroplasmy) > Hm→Ht > Ht→Hm > Ht→Ht. The main transfer forms of transition and transversion mutations are Hm→Hm and Hm→Ht respectively. Heteroplasmy is a common phenomenon in mitochondrial DNA somatic mutations of human tumors.