拟南芥血红蛋白3的亚细胞定位

拟南芥的血红蛋白3（AtGLB 3）属于截短的血红蛋白。与拟南芥血红蛋白1相比,拟南芥血红蛋白3具有不同的起源、不同的生化特性和结构;但其功能还不清楚。蛋白质的定位与蛋白质的功能息息相关。为深入研究该基因功能,构建了拟南芥血红蛋白3基因与绿色荧光蛋白融合的植物表达载体pUCGFP/AtGLB3。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白3在细胞中的定位。荧光显微镜检测结果表明,AtGLB3基因表达产物主要定位在细胞膜上。     

拟南芥血红蛋白1的亚细胞定位

为研究拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)基因的亚细胞定位,该实验构建了拟南芥血红蛋白1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pUCGFP/ AtGLB1.利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白1在细胞中的定位.荧光显微镜检测结果表明,AtGLB1基因表达产物主要定位在细胞核中,少量定位在细胞质中.     

拟南芥谷氨酸受体基因的亚细胞定位

为明确拟南芥谷氨酸受体1.3基因(AtGLR1.3)的亚细胞定位,该实验以拟南芥(Arabidopsis thalianaCo-lumbia ecotype)为材料,运用PCR方法从其基因组中扩增得到了AtGLR1.3的启动子和基因序列,将其连接到载体pBIsGFP上,构建成AtGLR1.3基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体,通过农杆菌介导的花序浸润法将重组载体转化拟南芥野生型,转基因植株通过激光共聚焦扫描显微镜观察显示,GFP荧光信号存在于细胞质膜上,表明AtGLR1.3为细胞膜蛋白.该结果为进一步研究AtGLR1.3的作用机理奠定了基础.     

两个拟南芥未知功能蛋白的亚细胞定位研究

蛋白质的亚细胞定位对于深入了解该蛋白质所行使的生理功能具有重要意义。经生物信息学预测,两个拟南芥未知功能基因At4g16410与Atl gI8060编码蛋白含有叶绿体定位信息。我们分别克隆了这两个基因5’端长199bp与220bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白（GFP）基因构建重组表达载体pMON530-cTP1-GFP与pMON530-cTP2-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥。两种转基因植株经激光共聚焦显微镜观察,GFP荧光仅在叶绿体中观察到,表明所克隆的两段DNA序列编码的多肽能够将At4gl6410与Atlgl8060编码蛋白质引导进入叶绿体,确定这两个蛋白质均为叶绿体蛋白质。     

拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达

通过克隆拟南芥磷酸酶PP2C家族基因At3g51370,构建了绿色荧光蛋白融合表达载体,用基因枪将构建好的载体轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析,发现该At3g51370基因表达蛋白定位在细胞核中;用实时定量PCR方法分析At3g51370基因的组织表达特性,发现该基因在花器官中的表达量明显高于其它组织.进一步构建了含At3g51370基因的启动子和GUS报告基因的植物表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,分析该启动子在不同生长时期与不同组织中的转录活性,结果发现,在幼苗期At3g51370基因主要集中在根尖分生组织和顶端分生组织表达,在成年植株中则集中在生殖器官如花和果荚柄等部位表达,在光照和黑暗条件下,At3g51370基因的表达特性没有明显差异.研究表明,At3g51370可能与其它核定位的PP2C磷酸酶一样参与了基因表达的调控,可能在拟南芥早期发育阶段的细胞增值分裂相关信号转导途径中发挥功能,并在花器官的发育过程中行使功能,且不参与光信号转导.     

拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

生物信息学分析表明,模式植物拟南芥叶绿体中含有大约4000多种蛋白质,目前只分离得到1000多种,其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白AT5G48790进行了亚细胞定位研究。我们克隆了该基因5端长178bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白（GFP）基因构建重组载体pMON530-cTP-GFP。转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察,GFP只在叶绿体中特异表达。实验结果表明,AT5G48790的确为叶绿体蛋白。本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。     

拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

生物信息学分析表明, 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约4 000多种蛋白质, 目前只分离得到1 000多种, 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白AT5G48790进行了亚细胞定位研究。我们克隆了该基因5'端长178 bp的DNA片段, 与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组载体pMON530-cTP-GFP。转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察, GFP只在叶绿体中特异表达。实验结果表明, AT5G48790的确为叶绿体蛋白。本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。     

两种瞬时表达体系研究拟南芥Profilin-1的亚细胞定位

使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1(PRF1)的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到p CAMBIA1300-GFP的改造载体上,成功的构建p CAMBIA1300-GFP-PRF1的表达载体。然后分别利用PEG转化拟南芥原生质体、农杆菌浸染烟草叶片两种技术进行了瞬时表达,并在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达。研究结果表明,将PRF1基因导入拟南芥的原生质体和烟草表皮细胞后,融合蛋白绿色荧光均能被观察到,PRF1基因与GFP融合蛋白的产物在烟草表皮细胞中主要定位在细胞质和外周细胞器中,在拟南芥的原生质体中的细胞核和细胞质中都有定位。两种不同的瞬时表达体系中PRF1蛋白的定位出现了不同,这可能与同源或异源表达的植物的特性相关。     

人类GABARAPL2基因的亚细胞定位

为了对GABARAPL2（GABAA受体相关蛋白相似蛋白2）基因的功能进行初步分析,首先通过同源比较的方法将序列与其同源物进行比较,发现GABARAPL2的氨基酸序列与GABARAP（GABAA受体相关蛋白）高度同源,而GABARAP已证实通过结合细胞骨架的微蛋白,使GABAA受体聚集,定位在细胞膜上,本文采用PCR法从人脑组织的cDNA文库中扩增出GABARAPL2的cDNA,克隆至T质粒载体中进行测序验证,然后以此为模板引物中引入酶切位点再次PCR,扩增出GABARAPL2的开放阅读框,并将其插入到加强型绿色荧光蛋白融合表达载体EGFP中,将绿色荧光蛋白标记的GABARAPL2和GABARAP分别转染HLF细胞株,结果两种蛋白的分布情况基本一致,在细胞质内和核内均有分布,而且核内的分布较胞质为多,结构功能域分析表明,GABARAPL2含有蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点,可能通过磷酸化参与细胞骨架的变化,结论 GABARAPL2和GABARAP不仅在胞质中作为受体相关蛋白协助受体的聚集、定位,还参与体内许多其它重要的生理过程。     

镉诱导拟南芥细胞程序性死亡过程中NO产生和亚细胞定位观察

镉是一种高度有毒的重金属,能够抑制植物生长,甚至导致死亡,但是其诱导细胞程序性死亡(PCD)的分子机制仍然不是很清楚。本文利用荧光探针分子成像和激光共聚焦扫描显微技术,以拟南芥叶肉细胞原生质体为材料,观察100μmol/L CdCl2诱导PCD过程中一氧化氮(NO)的产生和亚细胞定位。结果表明高浓度CdCl2能够明显降低细胞活力,100μmol/L CdCl2能够诱导大量NO产生,在处理12 h后NO产生达到峰值。亚细胞定位观察发现NO荧光首先和线粒体有共定位。随着处理时间的延长在叶绿体和胞质也观察到NO荧光。     

蛋白质亚细胞定位

我们知道,对蛋白质在细胞中的特异定位,可以增进我们对该蛋白质以及与该蛋白互作的其他蛋白功能的了解,确定蛋白质位置的一个方法是。在其上加一特异抗体。即对其贴上标签,然后加入能同此抗体特异结合的探针,最后用显微镜确定此探针在细胞中的位置。     

拟南芥3个蛋白磷酸酶2C基因编码蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

利用gateway技术从拟南芥中克隆了3个蛋白磷酸酶2C基因At5G66080、At1G68410和At5G06750,3个基因的ORF全长分别为1 158 bp、1 311 bp和1 182 bp,分别编码一条385、376和393个氨基酸残基的多肽.构建了3个基因的植物表达载体35S:GFP:At5G66080、35S:GFP:At1G68410和35S:GFP:At5G06750,采用基因枪法进行的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,荧光信号主要分布在细胞核上,显示这3个基因的产物可能在细胞核上发挥作用.利用实时荧光定量PCR研究At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在不同组织中的表达特性,结果表明:3个基因在各个器官均有表达,但表达量不同;At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在花中表达量最大;At5G66080和At5G06750基因在根、叶和叶柄中的表达量次之,在茎中的表达量最低;At1G68410基因在根中的表达量次之,在茎、叶和叶柄中的表达量较低.     

PF40 的亚细胞定位研究

pf40 基因是从谷子未成熟种子 cDNA 文库中获得的,与水稻、拟南芥的离子通道蛋白同源性很高 , 具有 8 个跨膜区 . 该基因转入烟草,可使烟草分枝增多,将其转入谷子,可使谷子分蘖增多 . 构建 pf40 与绿色荧光蛋白 gfp 的融合基因,转入烟草进行稳定表达,通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察研究其亚细胞定位,发现荧光主要集中在内质网 . 将 pf40 不同缺失区段的 4 个片段与 gfp 构建融合基因,转入烟草进行稳定表达,发现 PF40 N 端 93 个氨基酸残基就能够使得 PF40 定位在内质网, C 端缺失没有影响蛋白质的亚细胞定位 .     

蛋白质亚细胞定位的生物信息学研究

细胞中蛋白质合成后被转运到特定的细胞器中,只有转运到正确的部位才能参与细胞的各种生命活动,如果定位发生偏差,将会对细胞功能甚至生命产生重大影响.蛋白质的亚细胞定位是蛋白质功能研究的重要方面,也是生物信息学中的热点问题,数据库的构建和亚细胞定位分析及预测加速了蛋白质结构和功能的研究.     

水稻OsRhoGDI2蛋白生物信息学分析及亚细胞定位研究

水稻OsRhoGDI2是通过酵母双杂交筛选到的小G蛋白Rho家族成员OsRacD的互作蛋白的编码基因,为研究OsRhoGDI2和OsRacD的相互作用特点和调控机制,对OsRhoGDI2进行了生物信息学分析和亚细胞定位检测。通过生物信息学方法比较了二者编码蛋白的理化性质、修饰位点和亚细胞定位特点,并进一步构建了受控于CaMV35S启动子的与绿色荧光蛋白融合表达的OsRhoGDI2基因的双元植物表达载体,采用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,通过荧光显微镜观察了融合蛋白在活细胞内分布特点。OsRhoGDI2和OsRacD具有一些相似的理化特性和翻译后修饰位点,在洋葱表皮细胞中,OsRhoGDI2主要分布在细胞质、细胞膜和细胞核。OsRhoGDI2与OsRacD在蛋白理化特性和胞内分布上存在一定的相关性,OsRhoGDI2蛋白可能在调控OsRacD的胞内分布和活性中发挥重要作用。     

人SDCT2蛋白亚细胞定位信号分析

为了确定人高亲和力钠离子依赖性二羧酸共转运蛋白（high-affinity sodium-dependent dicarboxylate co-transporter, SDCT2,NaDC3）在细胞内的定位,构建了SDCT2与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白表达载体,并转染肾小管上皮细胞LLC-PK1,激光共聚焦显微镜观察显示,SDCT2蛋白主要定位于细胞的基底侧膜上.同时将SDCT2-EGFP融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达,可见融合蛋白的绿色荧光仅分布在细胞膜上.为了进一步确定该蛋白质的亚细胞定位信号序列,将SDCT2基因的N端及C端分别缺失,并构建缺失突变体与EGFP的融合蛋白表达载体,将它们转染到LLC-PK1中,观察SDCT2 缺失体在细胞内的分布情况.结果显示,N端缺失的SDCT2蛋白主要位于细胞质中,顶膜和基底侧膜上也有表达;C端缺失的SDCT2蛋白主要位于基底侧膜上,顶膜几乎没有表达,细胞质中表达很少.免疫组化结果也显示,SDCT2只表达于人近端肾小管上皮细胞的基底侧膜.这表明SDCT2蛋白的N端序列对其亚细胞定位是必需的,人SDCT2蛋白的基底膜定位信号位于N端序列中.     

拟南芥AtPUB18的亚细胞定位和酶活性及AtPUB18的表达

通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆到AtPUB18全长ORF。利用VectorNTI和MEGA 5.0对蛋白序列进行生物信息学分析结果显示,AtPUB18和AtPUB19蛋白序列相似性为74.9%,一致性为63.5%;构建AtPUB18启动子(1 974bp)融合GUS报告基因载体并转化拟南芥,组织化学染色分析显示,低温和干旱诱导后转基因植株中AtPUB18表达水平显著提高;构建AtPUB18与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的瞬时表达载体并转化原生质体,激光共聚焦显微镜观察发现,AtPUB18-GFP融合蛋白分布在细胞核和细胞质中;构建AtPUB18与麦芽糖结合蛋白基因(MBP)融合表达载体并转化大肠杆菌表达融合蛋白,纯化后的蛋白进行泛素连接酶活性检测结果显示,在小麦泛素激活酶E1和人泛素结合酶E2存在时,AtPUB18具有泛素连接酶活性。研究表明,AtPUB18是一个有功能的泛素连接酶,定位在细胞膜和细胞质中,可能参与拟南芥对非生物胁迫的响应。     

蛋白质亚细胞定位的识别

根据蛋白质的亚细胞定位,将蛋白质分为12类,用离散量的数学理论,以蛋白质中400个氨基酸二联体数目构成离散源,通过计算离散增量预测蛋白质的亚细胞定位,用Self-consistency和Jackknife两种方法测试均获得较高的预测成功率。结果表明：Self-consistency方法预测成功率为84．5％,Jackknife方法预测成功率为81．1％。