基于冰核蛋白的乳酸菌表面展示系统的构建

[目的]验证来源于丁香假单胞菌的冰核蛋白在乳酸乳球菌表面展示外源蛋白的可能性.[方法]以绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)基因gfp为报告基因,以冰核蛋白基因的N末端和NC端作为展示单元,构建乳酸菌表面展示载体pHZ101和pHZ102,并转化大肠杆菌(Escherichia coli JM109和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363.[结果]荧光显微镜观察显示重组大肠杆菌和乳酸乳球菌均能检测到绿色荧光.Western blot结果表明GFP蛋白在重组大肠杆菌和乳酸乳球菌中均得到表达,并且INPN-GFP蛋白多数滞留于乳酸乳球菌细胞质内,而INPNC-GFP蛋白则大部分定位于乳酸乳球菌的细胞膜上.[结论]以上结果表明丁香假单胞菌的冰核蛋白能引导外源蛋白定位于乳酸乳球菌的细胞膜上,为乳酸菌表面展示系统的构建提供了新的方向.     

癌胚抗原单链抗体在细菌表面的展示及其应用

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)作为肿瘤标志物,在临床肿瘤诊断及肿瘤靶向治疗等方面具有重要应用价值。癌胚抗原单链抗体（CEA-specific single chain antibody fragments , CEA-scFv）能够特异性结合癌胚抗原。本研究将癌胚抗原单链抗体展示于大肠杆菌细胞表面,分析其作为癌胚抗原检测平台和细菌靶向载体的可行性。首先将CEA-scFv基因克隆到表面展示载体pBAD-OmpA-mCherry 中,经酶切和测序证实,成功构建了重组质粒pBAD-OmpA-mCherry-CEA。重组菌经阿拉伯糖诱导后可检测到红色荧光,荧光强度在胰酶的作用下降低,全菌ELISA检测呈阳性反应,提示融合蛋白和目的蛋白质在重组菌表面展示成功。由Western印迹分析可知,融合蛋白的相对分子质量约为85 kD,符合预期设计。进一步的研究提示,重组菌在大肠杆菌表面展示的癌胚抗原单链抗体具有生物活性,能够有效结合A549细胞裂解液的癌胚抗原。在细菌侵染细胞实验中,与对照组相比,重组菌孵育A549细胞后细胞内可明显观察到点状红色荧光,证明重组菌能够靶向侵入癌胚抗原阳性肿瘤细胞。本研究为癌胚抗原相关的快速诊断和基于细菌载体的肿瘤靶向治疗奠定了实验基础。     

冰晶核蛋白及其在细菌表面展示技术中的应用

冰晶核蛋白(ice nucleation protein,INP)是一种分泌型外膜蛋白,广泛分布于丁香假单胞菌,荧光假单胞菌和其他革兰氏阴性菌中。由于其在相对高温下(-2~-4℃)形成冰核的特性,INP最早应用于生物制冷领域。在细菌表面展示技术中,冰晶核蛋白作为运载蛋白得到广泛的应用。与其他的表面技术载体蛋白相比较,冰晶核蛋白具有稳定表达外源蛋白及展示分子量较大的外源蛋白的优点。INP细胞表面展示技术已被应用于全细胞生物催化剂、全细胞吸附剂和环境污染物降解剂等的开发,本文将简述INP表面展示技术的研究进展。     

重组ETEC k88ac-LTB干酪乳杆菌在人工消化液中的生存性能

探讨重组干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在人工消化液中的存活能力。将K88ac-LTB基因从表达载体pQE-30克隆到L. casei细胞表面表达载体pLA中, 构建了重组表达载体pLA-K88ac-LTB, 并将其电转化至L. casei中, 在MRS培养基中培养后, Western blotting检测, 有约71.2 kD蛋白得到了表达, 表达蛋白的大小与理论值相符且可被抗血清所识别, 间接免疫荧光实验及流式细胞结果表明, 多聚谷氨酸合成酶A蛋白(pgsA)能够将融合蛋白成功地展示在菌体表面。将重组菌接种于人工模拟的胃肠液中, 通过平板计数观察其存活能力。结果表明, 重组干酪乳杆菌在人工消化液中均具有良好的存活性能, 符合益生菌的基本特征, 为实验动物模型的建立奠定了基础。     

利用冰核蛋白N末端结构域在大肠杆菌表面展示粘质沙雷氏菌脂肪酶

【目的】利用细胞表面工程技术将活性脂肪酶展示于大肠杆菌细胞表面并对展示脂肪酶的酶学性质进行研究。【方法】将丁香假单胞菌冰核蛋白N末端结构域序列与粘质沙雷氏菌脂肪酶编码基因融合,构建成脂肪酶表面展示载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】重组菌以终浓度0.05 mmol/L异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)、25°C条件下诱导培养,16 h后表面展示脂肪酶活力达到最大值1 852 U/g细胞干重。表面展示酶的最适pH为9.0,最适反应温度为40°C,表面展示酶热稳定性较游离酶有较大提高,在40°C孵育1 h后仍能保持90%以上的酶活力。【结论】以上结果表明细菌表面展示技术为脂肪酶固定提供了一个很有前景的替代方法。     

GFP-SA融合蛋白的表达纯化及其锚定修饰肿瘤细胞的研究

目的　GFP（绿色荧光蛋白）-SA（链亲和素）双功能融合蛋白的制备及其鉴定研究,以展示我们建立的技术平台,即用含链亲和素的双功能融合蛋白对生物素化的细胞表面进行高效的锚定修饰。方法　构建原核表达载体pET24d/GFP-SA转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导重组蛋白的表达,用镍金属螯合（Ni-NTA）层析柱进行纯化。用制备的GFP-SA双功能融合蛋白,对B16肿瘤细胞已生物素化的细胞表面进行修饰,经荧光显微镜和流式细胞仪进行修饰效率分析。此外,用MTT法检测细胞表面修饰对肿瘤细胞活力及其生长情况的影响。结果　GFP-SA重组融合蛋白在大肠杆菌实现了高效表达（约占细菌总蛋白的20%）,通过纯化和复性制备的GFP-SA双功能融合蛋白具有双重活性,即：链亲和素介导的、对生物素高效特异的结合活性,和GFP发射绿色荧光的活性,并能高效修饰表面已生物素化的肿瘤细胞。此外,GFP-SA双功能融合蛋白的细胞表面修饰对细胞的活力及其生长无显著影响。结论　GFP-SA融合蛋白能高效修饰表面已生物素化的肿瘤细胞,可用作肿瘤疫苗研究的示踪蛋白及实验对照体系。     

基于谷氨酸棒杆菌NCgl1221蛋白的新型细菌表面展示系统

【目的】开发一种新型的大肠杆菌表面展示系统,为C末端截短NCgl1221蛋白作为锚定蛋白提供科学依据,丰富并优化细菌表面展示系统。【方法】扩增C末端截短NCgl1221序列和β-淀粉酶基因,构建融合蛋白表达载体。将重组载体PET-NA和空载体PET-28a分别转入Rosetta(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白表达情况。将诱导表达菌株进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察和流式细胞分析检测β-淀粉酶的展示。酶活测定和淀粉水解分析验证被展示β-淀粉酶的活性。【结果】融合蛋白成功地在大肠杆菌中表达,有活性的β-淀粉酶通过与锚定蛋白C末端的融合被展示在了宿主菌表面,展示β-淀粉酶的重组菌可以水解利用培养基中的淀粉。【结论】成功开发了一种以C末端截短NCgl1221为锚定蛋白的新型大肠杆菌表面展示系统,并以此系统展示了分子量大小为56 kDa的活性酶,为该系统在全细胞催化剂或吸附剂等方面的应用奠定了基础。     

两种主流载体蛋白在大肠杆菌表面展示抗体应用中的系统分析

抗体表面展示技术对于新抗体的筛选和抗体亲和力的成熟是非常重要的工具．目前,较为广泛应用的表面展示技术是噬菌体的表面展示和酵母的表面展示．大肠杆菌,以其培养简单和基因改造便捷,有望成为非常好的一种表面展示的宿主．但是,目前为止,大肠杆菌还没有被广泛地应用于抗体的表面展示技术中．主要的原因之一是在大肠杆菌外膜展示抗体的效率还不够高．作为外膜展示的载体,许多蛋白都被研究过,其中自转运蛋白(autotransporter,AT)和冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)是人们研究最多的两种载体蛋白．还有一个原因是大肠杆菌作为宿主,在表达异源基因和展示异源蛋白过程中的存活率问题．在本研究中,系统地研究了Ag43β(一种自转运蛋白Antigen43的β结构域)和INPNC(去掉中间冗余序列的冰核蛋白的N端和C端)两种载体蛋白在强弱不同的三种启动子(T7、araBAD和lac)诱导表达的情况下,表达量、展示率、抗原亲和力以及宿主菌存活率的差异．我们发现,Ag43β展示的抗体在抗原亲和力上优于INPNC展示的抗体．在存活率方面,T7启动子诱导表达的存活率很低：用INPNC作为载体蛋白时只有0.0033%,用Ag43β作为载体蛋白时只有0.02%存活率．lac启动子诱导表达的存活率：用INPNC作为载体蛋白时为2.04%,用Ag43β作为载体蛋白时为13.27%．araBAD启动子诱导表达的存活率很高：用INPNC作为载体蛋白时为37.80%,用Ag43β作为载体蛋白时高达90.23%．但是araBAD诱导表达量和展示率都很低,所以其表现出的宿主高存活率意义有限．综合看来,由lac启动子驱动的、以Ag43?茁为载体蛋白的抗体表面展示系统是最好的选择．     

GP64表面展示元件与组Ⅱ HaSNPV出芽病毒的融合

利用杆状病毒组ⅠAcMNPV(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)GP64信号肽(GP64SP),C-末端跨膜区(GP64CTD)及报告基因绿色荧光蛋白(eGFP)构成的表面展示系统(gp64sp-egfp-gp64ctd),同源重组到组ⅡHaSNPV的多角体基因位置,筛选重组病毒。通过激光共聚焦观察,HaSNPV重组病毒感染Hz-AM1细胞后绿色荧光分布在质膜,表明GP64SP可以引导表达产物趋向于细胞膜。病毒感染后,收集并纯化重组的出芽病毒(BV),经Western blot检测,eGFP存在于重组病毒BV中。结果表明,组ⅠGP64表面展示系统中的重要元件GP64SP和GP64CTD能够装配到组ⅡHaSNPV BV上,可以用于组ⅡNPV表面展示目的蛋白。     

结核分枝杆菌PE＿PGRS15调控分枝杆菌细胞包膜结构与耐药性

【目的】研究结核分枝杆菌PE＿PGRS15的功能。【方法】构建过表达PE＿PGRS15蛋白的重组耻垢分枝菌酸杆形菌，通过细胞分级分离实验检测其细胞定位。通过涂布实验、扫描电镜和透射电镜观察细菌菌落形态、细菌表面形态及细胞包膜(cell envelope)结构。通过杀菌曲线法及微量肉汤稀释法检测重组菌对环境压力及抗生素的耐受性。通过染料摄取实验检测重组菌细胞壁通透性，并用气相色谱-质谱联用仪检测重组菌细胞壁脂肪酸谱。通过蛋白截短及融合实验分析PE＿PGRS15蛋白结构域的功能。【结果】PE＿PGRS15蛋白定位于重组菌细胞壁，其表达影响重组菌菌落形态和细胞包膜结构，增强重组菌对环境压力和抗生素的耐受。PE＿PGRS15的表达导致重组菌细胞包膜脂肪酸含量增加，也降低了重组菌的细胞壁通透性。PE＿PGRS15蛋白的PE结构域负责将该蛋白转运到细胞表面，而PGRS结构域介导重组菌对压力条件和抗生素的耐受。【结论】PE＿PGRS15蛋白可能通过调控耻垢分枝菌酸杆形菌细胞包膜的结构进而影响细菌菌落形态、细胞壁通透性及耐药性，为解析PE/PPE家族蛋白的功能奠定了一定的基础。     

禽流感病毒核蛋白在噬菌体表面的展示

利用PCR技术,扩增禽流感病毒（AIV）核蛋白基因片段,将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR—np,以此重组载体转化大肠杆菌Escherichia coli2（E2）,用溶菌酶缺陷噬菌体T4-zl感染重组E2菌,重组载体与缺陷噬菌体T4-zl基因发生同源重组,将np基因整合到噬菌体基因组中,用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-zl—np。经Western blot免疫电镜与ELISA检测证实,T4-zl-np表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。结果表明,AIV核蛋白成功地在T4噬菌体表面展示,为禽流感防治奠定了基础。     

HIV-1 gp41的酵母表面展示及表达优化

以His标签检测蛋白的表达, 利用酿酒酵母表面展示系统, 成功地将HIV-1 gp41片段锚定在酵母表面, 并检测到gp41的活性。以pMD18T-gp41为模板, 通过PCR技术克隆了gp41基因, 将gp41基因通过双酶切连接到载体pICAS-His上,构建了gp41酵母表面展示载体, 并将其转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT8-1中。重组菌经培养, 利用免疫荧光染色方法进行染色, 显微镜观察发现重组酵母细胞表面有绿色荧光, 流式细胞仪结果进一步证实gp41正确折叠展示于酵母细胞表面。采用不同浓度的葡萄糖培养基进行表达优化。当葡萄糖浓度为1%时, 82.46%的酵母细胞表达了gp41抗原; 随着葡萄糖浓度升高, 蛋白表达受到抑制。     

HIV-1 gp41的酵母表面展示及表达优化

以His标签检测蛋白的表达, 利用酿酒酵母表面展示系统, 成功地将HIV-1 gp41片段锚定在酵母表面, 并检测到gp41的活性。以pMD18T-gp41为模板, 通过PCR技术克隆了gp41基因, 将gp41基因通过双酶切连接到载体pICAS-His上,构建了gp41酵母表面展示载体, 并将其转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT8-1中。重组菌经培养, 利用免疫荧光染色方法进行染色, 显微镜观察发现重组酵母细胞表面有绿色荧光, 流式细胞仪结果进一步证实gp41正确折叠展示于酵母细胞表面。采用不同浓度的葡萄糖培养基进行表达优化。当葡萄糖浓度为1%时, 82.46%的酵母细胞表达了gp41抗原; 随着葡萄糖浓度升高, 蛋白表达受到抑制。     

细菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的功能性展示

细胞表面展示技术已广泛应用于突变文库的高通量筛选,有力地促进了蛋白质工程的发展。以来自于铜绿假单胞菌的自转运蛋白Est A的羧基端结构域作为锚定区,构建脂肪酶LipA与EstA羧基端结构域的融合基因,并将融合基因插入到改造后的pACYC-Duet表达载体中,获得表面展示载体pBCCB-X1。将载体pBCCB-X1分别导入到大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600菌株中,以IPTG诱导融合基因的表达。分别用三丁酸甘油酯定性检测和pNPO定量检测诱导表达后的全细胞脂肪酶的水解活性。试验结果表明,脂肪酶LipA在大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600细胞表面均得到功能性展示,水解活性分别为(2.8±0.1)U/OD和(2.6±0.06)U/OD。脂肪酶LipA在大肠杆菌细胞表面的功能性展示,为后续高通量筛选LipA突变基因文库,奠定了坚实的基础。     

杆状病毒表面展示甲型流感病毒核蛋白的免疫原性及保护效果的初步评价

流感病毒的核蛋白(Nucleoprotein,NP)高度保守,具有型特异性,能够诱导产生细胞介导的免疫应答,从而起到保护作用,抵抗不同亚型流感病毒的攻击。本研究利用杆状病毒表面展示技术,将杆状病毒GP64蛋白的信号肽(Signal peptide,SP)和胞质尾(Cytoplasmic tail,CT)与甲型流感病毒(A/Hubei/1/2010(H5H1))的NP蛋白融合表达,从而将NP蛋白展示在杆状病毒的表面,并对该病毒NP蛋白的免疫原性和保护效果进行了研究。Westernblot实验证明NP蛋白可以在Sf9细胞中有效表达。免疫电镜试验显示NP蛋白已成功展示在杆状病毒表面。通过小鼠感染实验,ELISA结果证明NP疫苗可以诱导产生高水平的IgG血清抗体。ELISPOT结果表明NP蛋白的2个细胞免疫抗原表位(NP57-66IQNSITIERM和NP441-450RTEIIKMMES)可以诱导小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ,利用NP57-66、NP441-450和NP蛋白均可刺激CD4+和CD8+T细胞产生IFN-γ,但主要以CD8+诱导为主,表明重组病毒可以产生有效的细胞免疫反应。利用小鼠鼠肺适应株A/PR/8/34(H1N1)进行攻毒实验,结果表明该重组病毒感染小鼠后可以降低小鼠肺病毒载量,减轻肺组织损伤,减少体重下降,并可以保护50%小鼠存活。     

利用S-层蛋白在细胞表面展示α-淀粉酶和金属硫蛋白

选用苏云金芽胞杆菌CTC菌株细胞表面S 层蛋白作为表面展示载体 ,利用其N 端信号肽以及锚定序列分别将不同生物特性的外源蛋白带到胞外并锚定在细胞的表面。为研究外源蛋白的分子量和生化特性对表面展示以及对其在细胞表面生物活性的影响 ,选用分子量较大的分泌性蛋白α 淀粉酶和富含半胱氨酸的非分泌性蛋白金属硫蛋白作为目标蛋白。将α 淀粉酶的结构基因 (amy)和金属硫蛋白的结构基因 (smtA)与S 层蛋白的锚定区slh结合 ,构建融合蛋白基因slh amy及slh smtA ,克隆至穿梭载体pHT30 4上 ,得到重组质粒pBMBSA 30 4和pBMBSM 30 4 ;转入带有帮助质粒的重组菌株BMB171 pBMB CSA中 ,得到新的重组菌株BMBSAC和BMBSMC。SDS PAGE显示融合蛋白SLH AMY和SLH SMTA在重组菌的表面得到了表达。利用锥虫蓝染色 打孔加膜法表明重组菌SAC的确具有表面酶活性 ,α 淀粉酶被固定在细胞表面。碘液法测定的数据表明重组菌SAC的菌悬液样品较之受体菌BMB171菌悬液样品酶活提高了 4 2 4 %。Ni NTA 琼脂糖微球吸附试验显示重组菌SMC能够被微球所吸附 ,证实SMTA在重组菌表面具有活性。对游离镉离子的吸附试验显示重组菌对镉离子的吸附能力是对照受体菌的 4倍。     

SH-SY5Y细胞α-突触核蛋白的过表达可部分抵抗鱼藤酮诱导的氧化应激

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的发病机制涉及到遗传和环境因素。环境因素通过线粒休导致氧化应激和α-突触核蛋白（α—synuclein）聚集,但其确切的作用机制尚不明确。本文利用过表达α-突触核蛋白-增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein．EGFP）的人多巴胺能神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y为模型,研究α-突触核蛋白对鱼藤酮诱导氧化应激的影响,从而进一步了解α-突触核蛋白和细胞存活之间的关系。（1）用荧光显微镜观察融合绿色荧光蛋白的α-突触核蛋白的表达情况;（2）用实时定量PCR检测α-突触核蛋白基因的表达;（3）用免疫细胞化学测定α-突触核蛋白的分布;（4）用不同浓度的鱼藤酮作用细胞后,以MTT法测细胞的活力、DCF法检测细胞的氧化应激状态、黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶的活力,并用流式细胞仪分析细胞的凋亡。实时定量PCR结果显示,α-突触核蛋白基因表达量在α-突触核蛋白过表达的细胞要高于SH—SY5Y细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白和α-突触核蛋白的表达。鱼藤酮可使细胞活力下降、线粒体complex Ⅰ的活性降低,诱导细胞内氧化应激,而过表达α-突触核蛋白的细胞可以部分抵抗鱼藤酮的毒性作用,表现为细胞抗氧化能力迅速增高（P〈0．05）和鱼藤酮诱导的细胞凋亡数目明显降低。本研究证明α-突触核蛋白对鱼藤酮产生的氧化应激有部分抵抗作用,而使过表达α-突触核蛋白的SH—SY5Y细胞对鱼藤酮的毒性作用表现出一定的耐受性。这种耐受性也可能是细胞对外界损害的一种代偿反应,从而促进细胞的存活。     

利用荧光标记的T7噬菌体研究配体/受体的相互作用

将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)衣壳蛋白VP2展示到T7噬菌体表面,以FITC标记纯化的重组噬菌体,通过荧光显微镜观察与流式细胞仪检测,研究标记噬菌体与病毒受体细胞--法氏囊B细胞的相互作用.结果展示有IBDV VP2蛋白的噬菌体经FITC标记后仍然具有与受体细胞结合的特性,荧光显微镜下可见绿色荧光,流式数据显示其平均荧光强度明显高于阴性对照,且IBDV疫苗株TAD可明显阻断其结合.由此得出结论,FITC标记与噬菌体展示技术相结合,可进行配体/受体间相互作用的研究.     

利用N-乙酰葡糖胺糖苷酶在乳酸乳球菌表面展示超氧化物歧化酶

分别将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因(acmA)的信号肽序列(ss)、C-末端结构域(cA)及全长基因,与来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的超氧化物歧化酶(SOD)基因sod构建成融合基因ss-cA-sod和acmA-sod,并连接于表达载体pMG36K,然后导入乳酸乳球菌ATCC11454菌株,获得了能在细胞表面展示SOD的重组工程菌MB193和MB194。经SDS-PAGE验证,重组菌MB193和MB194可分别表达产生分子量约为46和64kD的融合酶蛋白cA-SOD和AcmA-SOD。通过黄嘌呤氧化酶法测定MB193和MB194菌株的全细胞Mn-SOD酶活力分别为(2.63±0.51)U/mL和(3.51±0.64)U/mL,明显高于仅在细胞内表达产生SOD的对照重组菌MB192的酶活性(1.53±0.38)U/mL,且表达融合酶AcmA-SOD的重组菌MB194具有最大的表面展示效率(56.4%)。     

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的表面展示及酶学性质

【目的】构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)在毕赤酵母GS115中的细胞表面展示体系,筛选展示成功且酶活力及展示率较高的重组子作为全细胞催化剂,并研究其酶学性质。【方法】克隆TLL基因tll,以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白,构建表面展示载体pPICZαA-TLS。重组载体经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母GS115中,经三丁酸甘油酯平板检测及摇甁发酵筛选获得高酶活力的毕赤酵母重组子,采用抗FLAG标签一抗和R-PE荧光素标记的二抗处理细胞后,进行荧光显微镜检测和流式细胞仪分析,并考察全细胞催化剂的最适反应温度和pH、金属离子耐受性等酶学性质。【结果】成功构建TLL毕赤酵母细胞表面展示体系,筛选到1株具有三丁酸甘油酯和橄榄油水解活力的克隆子,经1%的甲醇诱导发酵120 h后,水解橄榄油酶活力达257.8 U/g干细胞。经抗体处理后的重组菌发酵细胞在荧光显微镜下呈现强烈的红色荧光,流式细胞仪分析结果也证实脂肪酶被成功展示在酵母细胞表面,展示率达98.36%。展示的TLL作为全细胞催化剂水解对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的最适温度为30℃,最适pH为8.0,且具备良好的热稳定性和有机溶剂耐受性;K+、Ca2+、Mg2+对其有微弱的激活作用,Mn2+、Ni2+则有微弱的抑制作用,Cu2+的抑制作用较强,而EDTA、SDS、Tween 20对酶活力影响不明显。【结论】首次将TLL脂肪酶成功展示在毕赤酵母细胞表面,获得具有较高水解活力和良好酶学特性的全细胞催化剂,为表面展示TLL脂肪酶的规模化应用奠定了技术基础。