嗜酸乳杆菌S-层蛋白联合抗生素对Escherichia coli和Staphylococcus aureus的抑制作用研究

旨在检测嗜酸乳杆菌S-层蛋白以及S-层蛋白与抗生素联用对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用。采用液体发酵培养法获得嗜酸乳杆菌菌体,LiCl法提取S-层蛋白粗提物,凝胶过滤层析法纯化S-层蛋白,分别用E.coli和S.aureus处理Caco-2细胞2 h后,考察S-层蛋白在不同浓度和不同作用时间条件下对E.coli和S.aureus的抑制作用,并考察S-层蛋白联合抗生素对E.coli和S.aureus的抑制作用,实验分组:(1)空白对照;(2)嗜酸乳杆菌组;(3)S-层蛋白组;(4)抗生素组;(5)嗜酸乳杆菌+抗生素组;(6)S-层蛋白+抗生素组。结果显示,液体发酵得到嗜酸乳杆菌菌体,提取并纯化得到S-层蛋白;S-层蛋白对E.coli和S.aureus有很好的抑制效果,具有浓度依赖性,高浓度下抑制率达到42.2%和31.7%,差异极显著(P<0.01),且在E.coli和S.aureus作用的短时间内干预效果明显,0 h时的抑制率分别达到59.3%和48.4%;S-层蛋白联合抗生素的抑菌率分别达到81.7%和79.3%,差异极显著(P<0.01),效果优于单独使用抗生素。嗜酸乳杆菌S-层蛋白具有较强的抑菌作用,可以与抗生素联用,有望开发称为一种新型的抗菌药物。     

果蝇中整合素αPS3／βν介导吞噬细胞吞噬凋亡细胞和细菌

整合素是由2个跨膜α和β亚基组成的异源二聚体,具有各种细胞功能。整合素βν是果蝇整合素的β亚基,参与吞噬凋亡的细胞和细菌。该研究搜寻了与βν亚基形成复合物并共同作用的α亚基,通过RNAi感染动物模型检测发现,αPS3（而不是其他4个α亚基）是果蝇胚胎有效吞噬凋亡细胞所必需的。αPS3编码scb突变时,包括缺失突变、插入P元件或改变核苷酸序列,都能降低吞噬能力。这种降低作用能被过表达scb逆转。此外,用干扰RNA（RNAi）同时干扰苍蝇中αPS3和βν后,其吞噬能力与干扰任一个亚基相同。αPS3缺失也能降低幼虫血细胞吞噬金黄色葡萄球菌的能力。采用免疫共沉淀分析化学交联处理的果蝇细胞系发现,αPS3与βν具有物理相互作用。结果提示,整合素αPS3／βν是果蝇吞噬细胞吞噬凋亡细胞和细菌的受体。     

敲除核糖体蛋白L8对果蝇发育的阻滞与细胞凋亡紧密相关

核糖体蛋白L8是核糖体60 S大亚基的一个组分, 参与蛋白质合成. 尽管L8蛋白参与果蝇的正常发育过程, 但对其作用机理仍不清楚. 为了探讨其相关分子机制, 通过RNAi技术消除L8蛋白, 同时从体内和体外探测其对果蝇发育的影响. 结果发现, L8RNAi能导致胚胎或一期幼虫致死、幼虫发育迟缓、眼睛和翅膀形态严重缺陷, 并且显著减少S2培养细胞的数目, 表明L8对果蝇的发育起至关重要的作用. 用吖啶橙对果蝇翅膀disc染色表明, L8消除后能引起明显的细胞凋亡发生. 对一些细胞凋亡(p53, hid, reaper, Dark, Dcp-1)和细胞周期(cdc45, MCM3, cyclin B, incenp)调节因子的RT-PCR分析很好地支持了L8缺失造成的表型, 而它们表达水平的变化和其在诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞中的作用一致. 上述结果表明, L8的消除能严重损伤果蝇发育, 此过程与细胞分化阻滞和细胞凋亡紧密相关, 其间p53可能发挥了关键的作用.     

短双链RNA对鸡胚盘细胞外源绿荧光蛋白基因表达的影响

RNA干扰 (RNAinterference,RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法 ,正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具。为了了解RNA干扰在禽类中的作用情况 ,实验将体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA (siGFP)和 3 磷酸甘油醛脱氢酶短双链干扰RNA (siGAPDH )分别同绿荧光蛋白(Greenfluorescentprotein ,GFP)表达载体 (pEGFP C1Vector)用脂质体转染试剂LipofectamineTM2 0 0 0共转染鸡胚盘细胞 ,并于转染后 36h在荧光显微镜下观察转染和干扰效果。对细胞绿荧光蛋白表达率的方差分析结果显示 ,不同处理组间差异达极显著水准 ,其中GFP组和GFP siGAPDH组均同GFP siGFP组差异极显著 ,GFP组同GFP siGAPDH组差异不显著。实验结果说明 ,siGFP能特异、有效地敲低细胞绿荧光蛋白的表达。同线虫、真菌、拟南芥、水螅、锥虫、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等其它生物体一样 ,鸡胚盘细胞中也存在短双链干扰RNA (siRNA)特异性沉默基因表达的RNA干扰机制     

PI3K/AKT途径在大肠埃希菌诱导U937细胞凋亡中的作用

目的探讨PI3K/AKT信号转导通路在大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）诱导的人巨噬细胞系U937细胞凋亡中的作用。方法利用Western blot分析检测E.coli感染不同时间后磷酸化及非磷酸化AKT的表达;预先用不同浓度的LY294002（PI3K途径抑制剂）处理U937细胞60min,观察E.coli感染30min后U937细胞的凋亡情况。结果随着感染时间的延长,磷酸化AKT的表达逐渐下降。加入PI3K的抑制剂LY294002后,U937细胞的凋亡率逐渐升高。结论PI3K/AKT信号转导通路参与了E. coli诱导的U937细胞凋亡过程。LY294002通过特异性地抑制PI3K/AKT活性增加E.coli诱导的U937细胞凋亡率。     

细菌脂多糖被体外培养的牛白细胞的吸收和降解

本文报告了体外培养的牛白细胞对放射性同位素氚标记的E.coli 112 LPS(简称E.coli 112~3H—LPS)的吸收和降解。实验证实:S型~3H—LPS (Smooth)比R型~3H—LPS(Rough)更容易被牛白细胞吸收和降解,同时也发现经抗LPS IgG调理的S—LPS可大量的被细胞吸收。用HCl—Hexane提取反应物中~3H—Fatty Acid,用Thin layer chromatography(TLC)实验(Petrom Ether:Ether:Aciti 70:30:2)分析~3H—代谢产物,结果表明,从LPS中至少降解出2种~3H—Fatty Acid,Rf值分别为0.6和0.3,说明牛白细胞含有一种或几种能够降解LPS的酶。     

HPV-16早期基因E1在果蝇细胞S2中的表达和鉴定

目的:在果蝇S2细胞中表达人乳头瘤病毒16型(HPV-16)E1。方法:PCR扩增HPV-16 E1全长,将PCR产物连接至pMD18-T并测序鉴定,继而将HPV-16 E1构建至果蝇表达载体pMT/Bip/V5-HisA中。大量提取pMT/Bip/V5/His-E1重组表达载体并与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin S)筛选获得具有抗性的稳定转染S2细胞。提取稳转S2细胞基因组DNA,PCR鉴定S2细胞中整合的E1。以终浓度为5μmol/L CdCl2诱导表达,收集上清进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果:双酶切及测序结果显示HPV-16 E1基因已克隆人重组质粒pMT/Bip/V5-E1,PCR和Western blot结果表明HPV-16 E1基因已整合至果蝇S2细胞基因组并稳定表达。结论:获得HPV-16 E1转染的果蝇S2细胞株,该细胞株可持续稳定表达E1蛋白。     

结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白ESAT-6增强巨噬细胞吞噬功能

【目的】研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)分泌蛋白ESAT-6(early secreted antigenictarget of 6 kDa)对巨噬细胞吞噬功能的影响。【方法】用重组质粒pFLAG-ESAT-6和pFLAG-EGFP转染RAW264.7细胞,经G418筛选,PCR、RT-PCR和Western blot鉴定,获得稳定表达flag-ESAT-6和flag-EGFP的RAW细胞系,然后用流式细胞术观察各稳转细胞系吞噬荧光微球的能力,并用共聚焦显微镜和菌落计数法检测稳转细胞系吞噬大肠杆菌(Escherichia coli)的能力。【结果】获得了稳定表达flag-ESAT-6的RAW-E6细胞系和表达flag-EGFP的RAW-EGFP细胞系;流式细胞术检测结果表明RAW-E6吞噬荧光微球的能力显著强于野生型细胞系RAW264.7和对照细胞系RAW-EGFP;菌落计数和激光共聚焦分析表明RAW-E6细胞系吞噬E.coli的能力也显著强于RAW264.7和RAW-EGFP。【结论】通过胞内表达发现结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6能够增强巨噬细胞的吞噬功能,这将为深入理解结核分枝杆菌的致病机制提供新的思路。     

重度肥胖患者肠道内机会性致病菌Escherichia coli微多样性分析

本研究利用志贺氏菌显色培养基和ERIC-PCR指纹图谱技术,从一名重度肥胖患者肠道内分离出19种不同ERIC类型的分离物。选取不同ERIC类型的代表菌株进行16S r RNA基因分子鉴定并构建系统发育树,发现19种代表菌株的16S r RNA基因和埃希氏菌属(Escherichia)、志贺氏菌属(Shigella)的相似性达到99%。经生理生化反应鉴定,19种代表菌株均为肠杆菌科的肠埃希氏菌(Escherichia coli)。体外生物学分析发现19种E.coli代表菌株在生化特性、耐药性、毒性方面有明显差异。本研究表明来自一名重度肥胖患者肠道内同一种群的E.coli在菌株水平上具有丰富的微多样性,不同ERIC类型的E.coli在生理生化特性上存在较大的差异,且部分菌株具有潜在致病性。     

IL-17在黏附侵袭性大肠杆菌感染小鼠结肠过程中的作用机制研究

目的:评价IL-17在黏附侵袭性大肠杆菌感染小鼠结肠过程中的作用及其可能机制。方法:选择野生型及IL-17基因敲除的SPF级C57BL/6小鼠并随机分成4组,分别给予不同的处理:(1)野生小鼠+单纯蒸馏水灌胃处理组;(2)野生小鼠+E.coli LF82(1×109/CFU/只)灌胃10天处理组;(3)IL-17敲除小鼠+单纯蒸馏水灌胃处理组;(4)IL-17敲除小鼠+E.coli LF82灌胃10天处理组。从以下5个方面评价各组小鼠的炎症反应和IL-17水平:(1)组织病理评分评估炎症反应严重程度;(2)透射电镜下观察结肠上皮细胞的超微结构;(3)免疫组织化学检测结肠分泌的IL-17;(4)PCR检测小鼠结肠中IL-17m RNA表达;(5)ELISA检测结肠组织中IL-17的含量。结果:定植了E.coli LF82的IL-17敲除小鼠肠道炎症程度和超微结构损伤较野生型小鼠更加严重(P0.05)。与未经E.coli LF82处理组相比,定植了E.coli LF82的野生小鼠肠道中IL-17m RNA和IL-17含量明显升高(P0.05)。结论:IL-17在E.coli LF82在黏附侵袭结肠粘膜过程中的保护作用,IL-17是针对AIEC菌株E.coli LF82免疫的重要效应物,而结肠局部分泌增加的IL-17会改善感染的结果。     

E2F1 介导8-氯-腺苷引起的人肺癌细胞H1299的凋亡

8-氯-腺苷（8-Cl-adenosine,8-Cl-Ado）可诱导人非小细胞性肺癌细胞H1299发生凋亡,但其分子机制还没有阐明．首先用四唑盐（MTT）比色法检测了8-Cl-Ado 对H1299 细胞的生长抑制作用．进一步采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting) 检测了8-Cl-Ado 处理H1299细胞后,procaspase-3 的激活情况以及E2F1的蛋白水平．通过用pcDNA-HA-E2F1表达载体和pSUPER-E2F1 RNA 干扰载体分别转染H1299 细胞,研究在E2F1 过表达和RNA 干扰（RNA interference, RNAi）两种情况下对凋亡的影响．实验结果表明,8-Cl-Ado可抑制H1299 细胞的生长,激活凋亡关键执行蛋白procaspase-3,升高E2F1 蛋白水平．当E2F1 过表达后,同时伴有procaspase-3 的激活,而E2F1 表达受到抑制后,与对照相比,8-Cl-Ado 引起的procaspase-3 的激活被明显抑制,说明E2F1 介导8-Cl-Ado 引起的人肺癌细胞H1299 的凋亡．     

Notch信号途径中的Su(H)和E(spl)基因对果蝇天然免疫的影响

天然免疫系统是多细胞生物抵抗各种入侵微生物的第一道防线.Notch途径介导相邻细胞之间的相互作用,调节细胞、组织、器官的分化和发育.为了进一步探索Notch信号途径在果蝇天然免疫中的功能,利用Notch途径下游基因Su(H)和E(spl)的低表达突变体果蝇,通过体外注射病原体分析了生存率、血细胞的噬菌功能和抗菌肽的表达量以及突变体的血细胞数量.结果表明,革兰氏阴性细菌和真菌感染后果蝇E(spl)突变体的生存率、噬菌能力及抗菌肽的表达量明显降低,而且幼虫期血细胞出现异常增殖;Su(H)突变体只对真菌表现出敏感性,抗菌肽的表达量降低,但是对真菌的噬菌能力正常.此结果表明,Notch途径不仅影响个体的生长发育,而且在果蝇天然免疫中也起重要的调节作用.     

大鼠睾丸间质细胞的自体吞噬活动

本文结合超微结构和细胞化学观察,研究大鼠睾丸间质细胞(Leydig细胞)中溶酶体的结??构与功能。观察结果表明,大鼠睾丸间质细胞中高尔基体非常发达,在高尔基体的成熟面存在着CMP酶阳性反应的GERL系统,说明这种细胞有不断产生溶酶体的能力。细胞化学结果也证实在睾丸间质细胞有较多的初级和次级溶酶体。睾丸间质细胞不仅有较多的溶酶体,而且还有相当数量的自噬小体,存在着活跃的自体吞噬活动。自噬小体的界膜来源于特化的光面内质网或高尔基体膜囊,包围的内容物主要是光面内质网和少量线粒体。当自噬小体与溶酶体融合后即成为自体吞噬泡,由于酶的消化作用,自体吞噬泡内的细胞器有一系列形态变化。根据CMP酶细胞化学反应,可以区分自噬小体和自体吞噬泡,后者是一种次级溶酶体,呈CMP酶阳性反应。睾丸间质细胞是分泌雄性激素的内分泌细胞,其光面内质网和线粒体在类固醇激素分泌中起重要作用,自体吞噬活动的结果是去除部分内质网和线粒体,可能在细胞水平上起着对雄性激素分泌的调节作用。     

睾丸间质细胞——研究自体吞噬的一种正常细胞模型

细胞在生理状态下自体吞噬出现的频率很低,很难用正常细胞来研究自体吞噬活动,一般都通过诱导自体吞噬来获得有关自体吞噬活动的资料。本实验观察了肝、肾、睾丸等组织的32种细胞,发现睾丸间质细胞中自体吞噬出现频率远远高于其他细胞,平均每100个细胞切面中可以看到25个自噬小体,从而为研究自体吞噬的过程和机理提供了一个正常细胞模型。本实验还观察到睾丸间质细胞的自体吞噬活动可分为前自噬小体、早期自噬小体和晚期自噬小体三个阶段,是一个连续的过程。前自噬小体和早期自噬小体不含溶酶体酶,只有在自噬小体与溶酶体接触后,才从后者获取溶酶体酶并将其内容物消化分解,成为晚期自噬小体。由自体吞噬所产生的残余体并不在睾丸间质细胞内积聚,而是通过胞吐作用排出细胞外。     

优化的绿色荧光蛋白在超嗜热嗜酸古菌冰岛硫化叶菌中的表达与应用

【目的】开发可用于在极端嗜热嗜酸模式泉古菌冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)中进行高效表达的eCGP123(enhanced consensus green protein variant 123)荧光蛋白,并用作S.islandicus的细胞内蛋白定位工具。【方法】绿色荧光蛋白突变体eCGP123具有极高的热稳定性、耐酸性和可逆的荧光特性等。本研究主要对eCGP123的基因根据S.islandicus密码子偏好性进行优化与合成,在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并研究其蛋白性质;通过在eCGP123的C末端分别融合具有不同细胞内定位的蛋白(包括E.coli来源的Fts Z和S.islandicus来源的Ups E、PCNA1和SiRe_1200等),构建eCGP123及其融合蛋白的表达菌株,用激光共聚焦显微镜分析eCGP123及其融合蛋白在E.coli和S.islandicus活细胞中的亚细胞定位。【结果】我们确认了在E.coli中表达并纯化密码子优化后的e CGP123具有与野生型绿色荧光蛋白相同的吸光值和较高的热稳定性。细胞学分析显示细胞分裂相关蛋白FtsZ和Si Re_1200分别主要定位于E.coli和S.islandicus分裂细胞的中间;鞭毛组分蛋白Ups E呈点状均匀分布,可能定位于细胞膜上;DNA复制滑动夹亚基PCNA1呈区域性点状分布,暗示了DNA复制区域的位置。蛋白的亚细胞定位与预期结果基本吻合。【结论】绿色荧光蛋白e CGP123可以作为报告蛋白,应用于S.islandicus细胞的蛋白定位分析中,可作为该模式菌株中功能基因研究的重要工具,但需要进一步优化条件。     

牛病毒性腹泻病毒Erns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的:利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定.方法:用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用(G4-S)3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-E(MS)-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白.并对表达产物进行鉴定.结果:SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76 800;Westem blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力.结论:BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测.     

二化螟碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶基因RNA干扰技术体系的优化

【目的】比较不同方法以及不同靶标基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)效率,建立并优化二化螟Chilo suppressalis碱性神经酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase基因的RNAi的技术体系。【方法】通过培养液浸泡法将果蝇Drosophila daCER基因的dsRNA导入果蝇S2细胞内;分别通过显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法将体外合成的二化螟saCER和snSMase基因的特异性双链RNA(dsRNA)导入二化螟3龄(注射法)和2龄(喂食法)幼虫体内,之后利用qPCR测定靶标基因的mRNA表达水平,比较不同方法对不同基因的RNA干扰效率。【结果】将果蝇S2细胞浸泡在浓度为15 ng/μL的含daCER dsRNA细胞培养液中培养72 h后,daCER基因的表达水平下降了约84%。dsRNA (5 000 ng/μL)注射二化螟3龄幼虫60 h后对saCER基因的干扰效率达到最高(41%),dsRNA (2 500 ng/μL)注射48 h后对snSMase基因的干扰效率最高(47%);给二化螟2龄幼虫喂食dsRNA(48μg/d)后,分别在第7天和第8天对saCER(32%)和snSMase(52%)基因达到最大干扰效率。对于aCER基因,果蝇S2细胞浸泡法与二化螟注射法和喂食法相比,干扰效率差异极其显著;使用相同方法,对saCER基因和snSMase基因的干扰效率无显著差异;对于二化螟的同一基因(saCER或者snSMase),注射法与荧光纳米粒子喂食法之间干扰效率也无显著性差异。【结论】碱性神经酰胺酶基因和中性鞘磷脂酶基因对导入dsRNA进行RNAi的方法较敏感,本研究建立并优化的显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法RNAi技术体系在鞘脂质代谢酶基因功能的基础研究中具有可行性。注射法和喂食法对二化螟幼虫aCER基因的干扰效率远低于浸泡法对果蝇S2细胞中这一基因的干扰效率,进一步证实二化螟血淋巴中的RNA酶对dsRNA的快速降解以及中肠围食膜的阻隔很大程度上削减了dsRNA进入二化螟细胞内发挥干扰作用。     

冠蛋白-1不同表达水平对巨噬细胞iNOS、TLRs表达以及凋亡的影响

冠蛋白-1(Coronin-1)在真核细胞中广泛表达,涉及钙离子稳态、细胞骨架动力学、免疫及炎症反应等多种细胞功能。该研究探讨了冠蛋白-1不同表达水平对巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达和凋亡的影响并探讨其分子机制。根据冠蛋白-1表达水平的差异,实验细胞分为RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7、RAW264.7-Cor.Minus 3组。各组细胞分别经4μmol/L钙调磷酸酶抑制剂环孢素A(cyclosporin A,Cs A)处理24 h或2μmol/L肌动蛋白聚合抑制剂松胞菌素D(cytochalasin D,cyt D)处理48 h,同时设未处理对照,再分别用Real-time PCR法检测iNOS m RNA水平,Western blot法检测细胞TLR2、TLR4、TLR9及钙调磷酸酶(calcineurin,Ca N)的蛋白质水平,流式细胞术检测细胞凋亡百分率。各组细胞用四甲基异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)染色后,计算纤维型肌动蛋白(F-actin)重排率。结果显示,冠蛋白-1过表达细胞相对于冠蛋白-1正常表达细胞,其iNOSm RNA水平以及TLR2、TLR4、TLR9蛋白表达水平和细胞凋亡率均显著降低(P0.05);Cs A作用后,RAW264.7-Cor.Plus的iNOS m RNA水平以及TLR2、TLR4、TLR9蛋白质水平和细胞凋亡率均较未处理对照细胞显著增加(P0.05),RAW264.7和RAW264.7-Cor.Plus细胞的Ca N水平较未处理对照细胞显著降低(P0.05);cyt D作用后,与未处理对照细胞相比,iNOS m RNA水平及细胞凋亡率无显著性差异(P0.05),但TLRs的表达显著降低(P0.05);经鬼笔环肽染色后,RAW264.7-Cor.Plus细胞F-actin重排率显著高于RAW264.7细胞(P0.05)。以上结果表明,冠蛋白-1过表达不仅促进了巨噬细胞F-actin重排,而且下调了iNOS、TLRs水平并且抑制细胞凋亡,其分子机制与冠蛋白-1促进钙调磷酸酶调控的Ca~(2+)信号通路有关。     

果蝇凋亡蛋白Strica的原核表达、多克隆抗体的制备及在放线菌酮诱导下的激活状态检测

【目的】细胞凋亡是真核生物中保守的细胞程序化死亡,由蛋白酶caspase介导。Strica是果蝇Drosophila中一个特殊的caspase,至今未有其商品化抗体且生化功能未知。本研究旨在通过克隆、原核表达纯化果蝇Strica蛋白并制备其多克隆抗体来初步研究其功能。【方法】根据果蝇Strica的基因序列构建原核表达载体并转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞,表达Strica蛋白;将表达纯化后的Strica蛋白免疫家兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA和Western blot分别测定抗体效价和灵敏度;利用前期构建的过表达载体pAc5-V5-Strica进行转染果蝇S2细胞,设计合成siRNA进行RNAi验证该抗体的特异性;利用该抗体通过免疫荧光实验检测Strica在果蝇S2细胞中的亚细胞定位;利用该抗体通过Western blot实验探究放线菌酮(10 μg/mL)处理后果蝇S2细胞中Strica蛋白的激活状态。【结果】获得了果蝇Strica重组蛋白;ELISA检测Strica抗体的效价大于1∶25 600;Western blot鉴定该抗体在1∶10 000的稀释度下能与重组蛋白反应;该抗体可以检测到S2细胞中过表达以及内源性Strica蛋白;Strica蛋白在S2细胞质中呈现散点分布;放线菌酮介导Strica蛋白的切割激活。【结论】成功制备了兔抗果蝇Strica多克隆抗体。Strica响应凋亡刺激物放线菌酮激活,推测Strica参与果蝇的细胞凋亡过程。本研究为进一步深入研究Strica的功能奠定了实验基础。     

miR-155 通过p53/p21 调控前列腺癌细胞周期

目的:探讨miR-155对前列腺癌细胞周期的影响及其分子机制。方法:通过转染anti-miR-155抑制前列腺癌DU145和PC-3细胞中miR-155水平后,采用流式细胞术观察细胞周期的变化,western blot和RT-PCR观察p53和p21蛋白及CDK2和cyclin蛋白和m RNA表达的变化。结果:与对照组相比,DU145和PC-3细胞转染anti-miR-155后,G2/M期细胞阻滞,S期细胞数比例显著增加(P0.05),p53和p21蛋白和m RNA表达水平显著增加(P0.01),CDK2和cyclin E蛋白和m RNA表达均显著降低(P0.01)。结论:miR-155可影响人前列腺癌细胞的周期,可能与其调节p53、p21及其下游的CDK2和cyclin E的表达相关。