肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLRs的表达及细胞凋亡的影响

在肺癌等的癌细胞中,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等致炎因子介导的促瘤效应涉及Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)/纤维型肌动蛋白(fibrous actin, F-actin)通路。该研究探讨了外源性松胞菌素D(cytochalasin D, cytD)和细胞内源过表达的重组肌动蛋白解聚因子丝切蛋白(Cofilin-1)所诱导的肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLR2、TLR4和TLR9的表达和细胞凋亡水平的影响。分别用6种不同浓度的cytD处理RAW264.7小鼠巨噬细胞48 h,用Western blot检测6组细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达水平。构建重组pEGFP-N1-Cofilin-1质粒并转染RAW264.7细胞,设置空质粒对照和空白细胞对照组。用Real-time PCR法和Western blot检测细胞转染前后Cofilin-1表达水平;Western blot检测巨噬细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达情况;用流式细胞术检测3组细胞的凋亡水平。结果显示,终浓度≥1.5μmol/L的cytD处理细胞后, RAW264.7细胞表达TLR2明显降低(P0.05);终浓度≥1.0μmol/L的cytD处理细胞后,巨噬细胞表达TLR4、TLR9明显降低(P0.05)。重组质粒转染组细胞的cofilin-1 mRNA及Cofilin-1蛋白水平均高于空质粒对照组和空白细胞对照组(P0.05),且其TLR2、TLR4、TLR9蛋白表达水平和细胞凋亡水平均显著低于空质粒对照组和空白细胞对照组(P0.05)。结果表明,外源性cytD和巨噬细胞内源性高表达的Cofilin-1蛋白均可下调巨噬细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达,其中,细胞高表达的Cofilin-1蛋白还显著降低了细胞凋亡率。该文通过揭示肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLRs的表达及细胞凋亡的抑制,为进一步研究炎症与肿瘤的关系及分子机制奠定了基础。     

巨噬细胞冠蛋白-1 siRNA对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

巨噬细胞冠蛋白-1(Coronin-1)与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)逃逸免疫杀伤有关。该研究探讨了p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒靶向抑制巨噬细胞Coronin-1表达后对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响。用该质粒转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,采用RT-PCR法和Western blot检测质粒转染前后细胞Coronin-1的表达水平。以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)分别感染转染质粒组细胞和对照组细胞,通过细胞内细菌菌落计数和细胞爬片抗酸染色法评估巨噬细胞转染质粒前后对细菌的吞噬能力;利用流式细胞术检测转染质粒组细胞及对照组细胞吞噬耻垢分枝杆菌后不同时段的细胞凋亡水平。结果显示,该质粒能显著抑制RAW264.7细胞Coronin-1的m RNA水平及蛋白表达水平;感染耻垢分枝杆菌6 h后,转染质粒组细胞内细菌数显著高于对照组细胞(P0.05);感染耻垢分枝杆菌48 h后,转染质粒组细胞凋亡水平显著高于对照组细胞(P0.05)。以上结果表明,p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒能显著抑制巨噬细胞Coronin-1的表达,并可显著促进巨噬细胞吞噬细菌和凋亡杀菌,为开发靶向巨噬细胞Coronin-1的抗结核基因治疗措施奠定基础。     

氧化苦参碱下调免疫细胞TLR7mRNA的表达

为了探讨氧化苦参碱对免疫细胞Toll-like receptor7( TLR7) mRNA表达的影响,使用CCK-8试剂盒检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞的生长抑制作用.应用荧光定量PCR方法检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞TLR7 mRNA及其下游因子TNF-α mRNA表达的影响;检测氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞TLR7 mRNA及其下游因子MyD88、TRAF-6 mRNA表达的影响.结果显示,氧化苦参碱对RAW264.7细胞的半数抑制率为5.9 mg/mL.氧化苦参碱下调RAW264.7细胞TLR7、TNF-α mRNA表达;下调小鼠脾脏淋巴细胞TLR7、MyD88、TRAF-6 mRNA表达.由此得出,氧化苦参碱可下调免疫细胞TLR7mRNA的表达.     

Daxx通过上调caveolin-1的表达介导Ox-LDL诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡

为探讨Daxx对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡的介导作用及其可能的分子机制,用高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,油红O染色观察细胞内脂滴的形成情况,流式细胞术和吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法研究Ox-LDL对细胞凋亡的影响,Real time RT-PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达水平,Western blot检测caveolin-1蛋白的表达,用特异性siRNA沉默Daxx在RAW264.7 细胞中的表达．Ox-LDL上调Daxx mRNA和caveolin-1的表达、增加细胞内胆固醇含量、促使RAW264.7细胞凋亡,用特异性siRNA干扰Daxx在RAW264.7细胞中的表达能降低caveolin-1的表达、减少细胞内胆固醇含量、以及抑制细胞凋亡．上述结果表明,Daxx对Ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡具有介导作用,这一作用可能与Daxx上调caveolin -1的表达有关．     

灵芝菌丝体冻干粉对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞相关因子分泌及蛋白表达的影响

通过体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,脂多糖(LPS)诱导刺激,考察了不同浓度灵芝菌丝体冻干粉(FDPGLM)处理后细胞活力、NO和IL‐6水平、Toll样受体4(TLR4)和i NOS m RNA表达、IκBa和磷酸化核转录因子κB(NF‐κB)p65蛋白表达之间的差异。结果显示:相对于LPS诱导来说,FDPGLM能以剂量依赖的方式显著抑制LPS诱导引起的NO和IL‐6水平上升(P0.01),显著下调TLR4 mRNA表达(P0.01),并显著抑制IκBa蛋白降解和NF‐κB p65蛋白磷酸化(P0.01),由此推测在LPS诱导的RAW264.7细胞中,FDPGLM可能经由TLR4/NF‐κB信号途径抑制促炎基因的激活并抑制促炎细胞因子比如IL‐6的分泌,提示FDPGLM在抗炎药理作用上的应用前景。     

艾拉莫德(T-614)对巨噬细胞M1型极化的影响

[目的]研究艾拉莫德(T-614)对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)M1型极化的影响。[方法]细胞毒性实验观察3个浓度(400 g/L,800 g/L,1 200 g/L)的T-614对RAW264.7的影响,使用LPS/IFN-γ诱导RAW264.7发生M1型分化,同时进行T-614干预。流式细胞术检测RAW264.7表面F4/80+CD86+与MHCⅡ+的比例,ELISA检测细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,RT-PCR检测细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、CD86和iNOS基因的表达,Western Blot检测细胞中MCP-1、CD86和iNOS蛋白表达水平。[结果]3个浓度T-614对未分化的巨噬细胞没有毒性;高浓度T-614降低M1巨噬细胞表面的F4/80+CD86+与MHCⅡ+比例(P<0.05),降低MCP-1、CD86和iNOS的基因表达水平与蛋白表达水平(P<0.05),降低IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达与减少IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(P<0.05)。[结论]T-614能抑制RAW264.7进行M1型极化,抑制MCP-1、CD86和iNOS的表达,减少IL-1β、IL-6、TNF-α的形成与分泌。     

红毛五加多糖单一组分AHP-Ⅲ对巨噬细胞的免疫调节作用及其机制

探讨红毛五加多糖(Acanthopanax giraldii Hams polysaccharide)单一组分AHP-Ⅲ(Acanthopanax giraldii Hams polysaccharideⅢ)对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的激活作用及机制。不同浓度AHP-Ⅲ作用RAW 264.7细胞,中性红试验检测细胞吞噬能力;ELISA和Griess法检测其IL-6、TNF-α和NO的释放量;RT-qPCR检测iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平;Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白磷酸化水平。在实验浓度范围内,AHP-Ⅲ可显著增强RAW 264.7细胞的吞噬能力(P<0.05);促进RAW 264.7分泌NO、TNF-α和IL-6(P<0.05或P<0.001);并显著增加RAW 264.7细胞中IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达量,呈剂量依赖性;Western blot结果表明,AHP-Ⅲ作用RAW 264.7细胞后,NF-κB中的p65、IKKβ、IκBα磷酸化水平明显升高。结果显示红毛五加多糖AHP-Ⅲ对小鼠巨噬细胞RAW 264.7具有显著激活作用。     

RAW264.7小鼠巨噬细胞与阿萨希毛孢子菌相互作用后TNF-α、IL-1β和CCL3的表达变化

目的研究RAW264.7小鼠巨噬细胞与T.asahii相互作用后TNF-α,IL-1β和CCL3的表达水平变化。方法RAW264.7细胞与T.asahii菌液共孵育3 h、6 h、9 h、12 h,对照组不加菌液。在各孵育时间点取上清液,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测上清液中TNF-α、IL-1β和CCL3的含量。台盼蓝拒染法计各孵育时间点RAW264.7细胞的活细胞数。结果 RAW264.7细胞与T.asahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后,TNF-α、IL-1β、CCL3的表达水平均明显高于对照组,有显著性差异(P0.05)。3种细胞因子的表达水平随共孵育时间延长而增高,共孵育9 h的表达水平最高。RAW264.7细胞的活细胞数随共孵育时间延长而逐渐下降,共孵育12 h后的活细胞数量与其他各时间点有统计学差异(P0.05)。结论 RAW264.7小鼠巨噬细胞面临T.asahii感染时可分泌TNF-α、IL-1β、CCL3等细胞因子,这些炎性细胞因子可能参与了抗T.asahii感染的免疫反应。     

胰岛素在巨噬细胞泡沫化过程中对Toll样受体4表达的影响及其机制

目的:观察胰岛素对巨噬细胞破泡沫化过程中Toll样受体4(TLR4)表达及IL-6、TNF-α分泌的影响.方法:采用体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导建立泡沫细胞模型,分为对照组、ox-LDL组、用胰岛素组、PI3K-AKT抑制剂组.油红O染色观察泡沫细胞模型的建立,取细胞上清用ELISA法检测白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平;流式细胞术检测膜蛋白TLR4表达量,Western-blot检测TLR4、核因子-κB (NF-κB)的表达水平.结果:与对照组相比,ox-LDL处理过的巨噬细胞可向泡沫细胞转换,同时TLR4、NF-κB蛋白表达水平以及IL-6、TNF-α水平显著增加(P＜0.05);而使用胰岛素干预后ox-LDL的作用显著减弱,TLR4、NF-κB蛋白表达水平以及IL-6、TNF-α水平显著降低(P ＜0.05 vs ox-LDLgroup);而使用PI3K-AKT抑制剂干预后,抑制剂显著降低胰岛素的作用,TLR4、NF-κB蛋白表达水平以及IL-6、TNF-α水平显著升高(P ＜0.05 vs ox-LDL+ insulin).结论:ox-LDL可诱导巨噬细胞向泡沫细胞转化,同时上调TLR4及NF-κB蛋白表达,增加炎性因子分泌,促进了AS进程,而胰岛素可使ox-LDL的作用显减弱,减少TLR4、NF-κB蛋白表达及炎性因子分泌,从而减轻AS进程,其机制可能与胰岛素通过PI3K-AKT抑制TLR4-NF-κB通路有关.     

IFITM3在脓毒症模型及胆碱能抗炎模型中的表达

目的:探讨干扰素诱导的跨膜转运蛋白3(IFITM3)在LPS刺激的RAW264.7细胞系的脓毒症模型中的表达以及胆碱能抗炎模型中的表达。方法:用1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞24、48、72 h后,用Western-Blot法检测各组细胞IFITM3蛋白表达水平。用1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞后,给予50μM胆碱能受体激动剂GTS-21以及同时给予100 n M胆碱能受体拮抗剂α-BGT刺激细胞24 h后,用Western-Blot法检测各组细胞IFITM3蛋白表达水平。用ELISA法检测IL-1β的方法验证脓毒症模型和胆碱能抗炎模型的建立。结果:(1)1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞后,IFITM3蛋白表达明显降低(P0.01)。(2)1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞后再给予50μM GTS-21,IFITM3蛋白表达明显升高(P0.001);而给予100 nMα-BGT后,IFITM3蛋白表达明显降低(P0.001)。结论:LPS刺激的RAW264.7细胞IFITM3蛋白表达降低。给予胆碱能激动剂GTS-21后能够逆转LPS诱导的IFITM3表达的降低,给予胆碱能受体拮抗剂α-BGT则能阻断这种现象。IFITM3有可能在脓毒症中发挥保护作用,并且参与了胆碱能抗炎通路抗炎过程的调节。     

分枝菌酸诱导巨噬细胞泡沫细胞化对细胞自噬的影响

研究分枝菌酸(mycolic acid,MA)诱导的巨噬细胞泡沫细胞化对巨噬细胞自噬的影响,探讨MA促巨噬细胞泡沫细胞化的机制。构建LC3真核表达质粒(p EGFP-LC3B),转染RAW264.7细胞后获得其稳定转染细胞株(RAW264.7/p EGFP-LC3B);用MA诱导RAW264.7/p EGFP-LC3B获得RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞。实验分为三组:RAW264.7细胞组、RAW264.7/p EGFP-LC3B细胞组及MA诱导的RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组。通过RT-PCR法检测各组细胞中自噬相关基因Becn1、LC3B的转录水平,Western blot法检测各组细胞自噬标志蛋白LC3B II/I的表达水平。RTPCR检测结果显示,RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组的Becn1基因及LC3B基因的转录水平明显较其他两组低(P0.05)。Western blot检测结果显示,RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组LC3B II/I比值明显较其他两组低(P0.05)。由此可见,当巨噬细胞被MA诱导成为泡沫巨噬细胞后,其自噬功能显著降低。该研究证明,MA可能通过抑制巨噬细胞自噬,引起脂代谢失衡,进而发生巨噬细胞泡沫细胞化。     

广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用受体TLR4和TLR2的影响

确定广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用受体,探索广叶绣球菌β-D-葡聚糖的免疫调节机制。采用MTT法测定不同浓度广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7增殖活力的影响,筛选出促进巨噬细胞增殖能力最强的浓度。用筛选出的β-D-葡聚糖浓度作用巨噬细胞RAW264.7;TLR4抗体和TLR2抗体分别作用巨噬细胞RAW264.7 1h,再用含有β-D-葡聚糖的细胞培养液培养。收集细胞培养上清和细胞,检测细胞培养上清中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量;提取细胞内总RNA,采用RT-PCR测定巨噬细胞TLR4 mRNA表达量;提取巨噬细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹western blot测定TLR4的蛋白表达。广叶绣球菌β-D-葡聚糖能够促进巨噬细胞RAW264.7增殖,增加NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量,提高TLR4 mRNA表达和蛋白表达,差异极显著（P<0.01）。TLR4抗体作用细胞后,NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量明显下降,差异极显著（P<0.01）。TLR2抗体作用细胞后,NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量下降,但差异不显著。广叶绣球菌β-D-葡聚糖可以通过细胞表面受体TLR4激活信号转导通路,增强下游细胞因子的释放,从而调节巨噬细胞RAW264.7的免疫功能。TLR2可能不是广叶绣球菌β-D-葡聚糖的免疫受体。     

人羊膜上皮细胞对脂多糖刺激下的RAW264.7 细胞向M1 极化的预防作 用及其初步作用机制

目的:本实验探讨人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,h AECs)预防RAW264.7细胞在脂多糖(LPS)刺激后向M1极化的作用以及可能机制。方法:采用流式细胞仪检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移,ELISA检测细胞释放NO浓度,Real-time PCR检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、精氨酸酶1(arginase-1,Agr-1)及甘露糖受体(mannose receptor,MR又称CD206)等基因表达情况,Western blotting检测RAW264.7胞质蛋白p-IκBα以及胞核蛋白NF-κB的表达。结果:RAW264.7培养基组与h AECs条件培养基干预组的凋亡率分别为5.68%±2.3%、6.68%±2.1%(p0.05)。LPS刺激组与h AECs条件培养基干预组两组的迁移率分别为42.03±0.07%、14.71±0.04%(p0.05);LPS刺激组与h AECs干预组两组NO释放量分别为27.73±10μM、13.33±6.43μM(p0.05);Real Time-PCR结果显示,h AECs干预组M1型巨噬细胞相关基因如IL-1β、TNF-α、iNOS以及INF-β的表达显著下调,M2型巨噬细胞相关基因如Arg-1、CD206、CD36等表达上调(p0.01)。Western blotting结果显示,hAECs干预组RAW264.7中胞质蛋白p-IκBа以及胞核蛋白NF-κB的蛋白含量降低。结论:h AECs与RAW264.7预培养能有效预防LPS刺激下RAW264.7向M1极化,其机制可能是通过抑制IκBα蛋白磷酸化来降低核内NF-κB的含量,从而抑制了M1型相关基因的表达。     

斗米虫蛋白体外抗肿瘤活性及其对小鼠巨噬细胞免疫调节作用

该文主要为了研究斗米虫蛋白的体外抗肿瘤活性及其免疫调节作用。提取斗米虫总蛋白,逐级盐析分为3个部分,透析除盐后得到不同蛋白部位,并采用SDS-PAGE检测斗米虫不同蛋白部位的分子量;利用MTT法、流式细胞术等方法研究斗米虫蛋白对人胃癌细胞MFC和小鼠乳腺癌细胞4T1增殖、迁移和凋亡的作用。MTT法研究斗米虫蛋白对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和人脐静脉内皮细胞HUEVC增殖的影响;荧光微球吞噬实验检测斗米虫蛋白对RAW264.7细胞吞噬能力的影响;Griess法检测对RAW264.7细胞释放NO能力的影响;ELISA法检测对RAW264.7细胞的IL-6、TNF-α和IL-1β分泌量;RT-PCR法检测不同浓度的斗米虫蛋白作用后RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1、TLR4、MIR-7、IFN-γ、TRL-4、IL-6以及4T1细胞中MMP2、MMP9、STAT3、c-Myc和Sdf1 mRNA水平变化。结果显示,斗米虫蛋白主要分子量集中于63 kDa,斗米虫蛋白对人胃癌细胞MFC及小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖表现出较好抑制作用,并呈现出一定剂量依赖关系(P<0.05),对HUEVC细胞没有细胞毒性,对RAW264.7细胞表现出较好的促进增殖的作用(P<0.05)。斗米虫蛋白实验组与正常组细胞相比可以抑制4T1细胞的迁移(P<0.01),可诱导MFC和4T1细胞凋亡(P<0.05);斗米虫蛋白能够提高RAW264.7细胞的吞噬活性、NO释放量、TNF-α、1L-1β和IL-6分泌量及TNF-α、IL-1、TLR4、MIR-7、IFN-γ和IL-6细胞因子的mRNA水平以及能显著下调4T1细胞中MMP2、MMP9、STAT3、c-Myc和Sdf1 mRNA水平(P<0.05,P<0.01)。由此推论,斗米虫蛋白具有较好的体外抗肿瘤活性并且具有潜在的免疫调节作用。     

S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺对RAW264.7巨噬细胞亚型分化的影响

目的:探讨S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺(SNAP)对巨噬细胞亚型分化的影响及其机制。方法:以RAW264.7巨噬细胞为研究对象,分为空白对照组、SNAP组、SNAP+PBA(4-苯基丁酸)组,采用不同浓度(30、100、300、400、500μmol/L)的SNAP或300μmol/L SNAP+20 mmol/L PBA对巨噬细胞进行干预24 h,应用RT-PCR法检测RAW264.7巨噬细胞亚型分化标志物M1(iNOS,CD86)、M2(Arg-I,MR)及CHOP mRNA的表达,应用Western blot技术检测iNOS及ERS通路中相关蛋白CHOP、P-PERK的表达。结果:与空白对照组比较,SNAP组iNOS、CD86、CHOPmRNA的表达均明显降低(P0.05),Arg-ImRNA表达明显升高(P0.05),而MR mRNA表达升高,但差异无统计学意义(P0.05);与300μmol/L SNAP组比较,300μmol/L+PBA组iNOS、CHOP mRNA均无明显变化(P0.05),CD86 mRNA升高,Arg-I、MR mRNA均明显降低(P0.05)。SNAP组CHOP、iNOS、p-PERK蛋白表达均明显低于对照组(P0.05),300μmol/LSNAP+20 mmol/LPBA组与300μmol/LSNAP组比较iNOS蛋白、p-PERK、CHOP蛋白表达升高(P0.05)。结论:NO可能通过内质网应激机制抑制巨噬细胞向M1亚型分化。     

甘草酸对巨噬细胞抗绵羊肺炎支原体感染的调控作用研究

为观察甘草酸在小鼠巨噬细胞系RAW264.7抗绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)感染中的作用,实验利用CCK-8细胞活性检测找到最佳甘草酸处理浓度;检测甘草酸对受MO感染的巨噬细胞活性的影响。流式细胞仪检测甘草酸对RAW264.7巨噬细胞生长周期的影响;ELISA检测甘草酸对受MO感染的巨噬细胞分泌TNF-α的影响;Western blot检测细胞凋亡因子Bax、Bad的表达情况。RT-PCR检测凋亡和自噬相关基因的表达情况。结果显示,浓度为12μmol/L的甘草酸显著升高RAW264.7的活性(P=0.012 9),且处于G1期的细胞数减少,G2期的细胞数增加。甘草酸(12μmol/L)可提高受MO感染的RAW264.7的增殖率(P=0.034 0),培养上清中TNF-α含量升高(P=0.015 2),巨噬细胞中促凋亡蛋白Bax表达量增加,但基因caspase 3和caspase 9的表达量显著下调(P<0.000 1),自噬相关基因Atg 7和Beclin 1表达量显著升高(P<0.000 1)。结果提示在MO感染巨噬细胞引起免疫抑制的情况下,甘草酸可通过促增殖、抑凋亡、促进TNF-α的表达、增加自噬来起到免疫调控作用。     

磷酸鞘胺醇对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的调控及机制研究

采用Western blot、免疫荧光和PCR检测小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7中S1P受体1-3(S1PR1-3)的表达,然后应用吞噬实验和免疫荧光的方法检测磷酸鞘胺醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)对其吞噬功能的调节。分别应用药理学工具和小干扰RNA的方法研究S1P调节其吞噬活性的作用机制。结果显示,小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7表达S1PR1-3;S1P剂量依赖地增强小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的吞噬功能,应用S1PR2或S1PR3的拮抗剂和si RNAs可抑制S1P增强的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的吞噬活性;而应用S1PR1的拮抗剂和si S1PR1并不影响S1P增强的RAW264.7的吞噬作用;且S1P可以显著上调RAW264.7中S1PR2和S1PR3的表达,但是不改变S1PR1的表达,提示S1P通过正反馈机制增强其介导的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的吞噬功能。结果表明,S1P/S1PR2/3信号通路增强小鼠单核巨噬细胞吞噬活性,为单核巨噬细胞吞噬作用的分子机制调控研究提供了新线索。     

对氧磷降低RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达和胆固醇流出

三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)是体内胆固醇逆向转运的关键环节.对氧磷是广泛使用的有机磷农药的活性代谢产物.研究发现,对氧磷能增加巨噬细胞中胆固醇的堆积,但具体机制还不清楚.以RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,观察对氧磷对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达和胆固醇流出的影响并探讨其机制.结果显示,对氧磷以时间和剂量依赖的方式增加RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞中总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯水平,降低ABCA1表达和胆固醇流出,同时对氧磷降低细胞中环磷酸腺苷(cAMP)的水平及腺苷酸环化酶(AC)的活性和增加磷酸二酯酶(PDE)的活性,而cAMP的类似物双丁酰环腺苷酸(dBcAMP)能够阻断对氧磷降低ABCA1表达和部分阻断对氧磷降低胆固醇流出,对氧磷导致的cAMP水平的降低也可被AC激动剂福斯高林(Forskolin)和PDE抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)所阻断.以上结果表明,对氧磷通过cAMP信号通路下调RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达,降低细胞内胆固醇流出和增加细胞内胆固醇堆积.     

Toll样受体对肠道病毒71型基因组RNA的识别分析

目的分析Toll样受体(TLRs)对肠道病毒71型(EV71)基因组RNA的识别。方法用荧光定量RT-PCR方法检测与EV71基因组RNA作用24、48和72 h后人结肠癌SW620细胞的TLR3、TLR7和白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、IL-12 m RNA表达。结果细胞的TLR3、TLR7 m RNA和IL-6、IL-12 m RNA在作用72 h后表达增加,IL-8 m RNA各时间点表达无变化。结论 TLR3、TLR7可与EV71基因组RNA识别,并诱导细胞因子IL-6、IL-12活化表达。     

EV-A71感染小鼠巨噬细胞诱导促炎细胞因子和趋化因子反应

为初步探索EV-A71在小鼠巨噬细胞中的复制情况和抗病毒的固有免疫应答,本文以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型,通过建立EV-A71绝对定量qPCR方法检测EV-A71病毒载量;EV-A71和紫外灭活的EV-A71感染RAW264.7,不同时间点提取总RNA,RT-qPCR检测促炎细胞因子、趋化因子和模式识别受体的mRNA表达变化水平。本研究成功建立了EV-A71的绝对定量qPCR检测方法,并发现EV-A71感染RAW264.7后随着感染时间的延长,EV-A71病毒载量呈递减趋势;EV-A71和紫外灭活的EV-A71可以引起IL-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子和IP-10、MCP-1、MIP-1α趋化因子反应,上调TLR2、TLR1、TLR6、MDA5和RIG-I mRNA表达。研究结果显示,EV-A71在小鼠巨噬细胞中具有较低水平的复制,同时产生促炎细胞因子和趋化因子反应。