伦敦白胶和茶：一种既快又安全的用于透射电子显微镜的细菌样品制备方法

【目的】检测乌龙茶提取物是否可作为电子染色剂取代醋酸双氧铀用于细菌细胞染色,使其能在透射电子显微镜下进行观察。【方法】利用伦敦白胶对细菌样品(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)进行胶块的制备,再在复染铅与不复染铅这两种情况下对超薄切片样品进行3种不同染色剂的电子染色,之后在透射电子显微镜下观察比较其不同之处。这3种不同的染色剂分别是醋酸双氧铀、0.05%乌龙茶提取物以及0.1%乌龙茶提取物。首先将带有超薄切片样品的铜网悬浮于不同的待比较染液中10?15 min,若需进一步用柠檬酸铅复染,则将经3次蒸馏水冲洗过后的铜网再次悬浮于柠檬酸铅染液中8?10 min。【结果】复染铅的情况下,在透射电子显微镜下无论是大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌,利用3种电子染色剂进行染色的结果均非常相似。【结论】实验结果表明,在观察细菌结构中,乌龙茶提取物可以替代醋酸双氧铀进行透射电子显微镜样品的电子染色。     

浮游病毒的电镜观察

直接用戊二醛固定水样中的浮游病毒,通过超速离心使已固定的浮游病毒沉淀到覆有Formvar膜和碳支持膜的铜网上,经醋酸双氧铀染色后,利用透射电镜对湖水中的浮游病毒进行观察．结果可观察到球形、杆状和蝌蚪状等形态各异的浮游病毒颗粒及球形病毒的囊膜子粒、杆状病毒的核衣壳、具有不同尾部的蝌蚪状病毒等的精细超微结构．从而建立了一种简便、快捷和高效研究浮游病毒的电镜方法．     

以消散场成像和单微粒跟踪技术揭示GLUT4囊泡和分泌囊泡的不同动态过程

葡萄糖转运子蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)在维持体内葡萄糖动态平衡的过程中起着至关重要的作用。GLUT4贮存囊泡(GLUT4 storage vesicle,GSV)和神经内分泌细胞中的分泌囊泡含有许多相同的蛋白。研究证明这些蛋白调节了分泌囊泡的胞内转运过程,但是GLUT4囊泡和分泌囊泡是否具有相同的胞内动态过程还未阐明。文章以3T3-L1纤维原细胞中的GSV和神经内分泌细胞PC12细胞中的分泌囊泡:致密核心大囊泡(large dense core vesicle,LDCV)为研究对象,使用消散场显微成像技术和单微粒跟踪技术直观观察了活体细胞内单个GSV和LDCV的三维运动轨迹。通过以适当方程拟合单个囊泡的均方位移曲线,发现两种囊泡都具有三种运动模式。定量分析显示作自由扩散运动和方向性扩散运动的GSV数量明显多于LDCV。对比GSV和LDCV的三维扩散系数,发现GSV的扩散系数中值为7.2×10-4μm2/s,而LDCV的扩散系数中值仅为1.94×10-4μm2/s。这一结果说明GSV的活动性远大于LDCV,提示GSV的胞内转运过程涉及不同的分子机制。     

一种酚氧化酶原组织定位的胶体金标记免疫电镜方法

以亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guenée5龄幼虫的中肠和体壁组织为材料,采用Epon812常规包埋方法,以作者实验室制备的酚氧化酶原多克隆抗体为一抗、胶体金标记的羊抗鼠IgG为二抗,采用醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色体系,建立一种胶体金标记的特异性强且超微结构保存较好的亚洲玉米螟幼虫体内中酚氧化酶原免疫电镜定位方法。     

香蕉根系丛枝菌根(AM)真菌染色方法比较

AM真菌侵染情况观察是AM真菌研究的重要基础。本研究比较了5种不同染色剂(5%醋酸墨水,酸性品红,苏丹红Ⅳ,台酚蓝,苯胺蓝)对香蕉根系AM真菌的染色效果。研究结果表明:5%醋酸墨水和台酚蓝染色液的染色效果最佳,根皮层细胞内的AM真菌的菌丝、丛枝、泡囊及内含物等结构清晰可见,且能够明确分辨出AM真菌与其他未知真菌。但综合考虑操作难易程度、价格成本和毒性等因素,5%醋酸墨水染色液更适用于香蕉根系AM真菌的染色和制片观察。     

PC12活细胞中单个分泌囊泡的动态成像

囊泡的荧光标记和动态显微成像观察是研究蛋白质和膜转运机制的重要手段。采用EGFP hpNPY融合荧光蛋白标记PC12细胞的致密大囊泡 ,用全内反射和宽场荧光显微镜对PC12细胞进行成像研究。结果发现 :普通的宽场荧光成像模糊不清 ,难以观察到单个囊泡 ;而全内反射荧光成像则可清晰地分辨出呈现为离散荧光点的单个囊泡 ;并且进一步利用全内反射荧光成像直接观察到了活的PC12细胞中单个囊泡的转运、锚定及与细胞膜的融合过程 ,证实了囊泡的锚定过程是可逆的。     

非洲狼尾草未受精无孢子生殖胚囊退化研究

为理解植物无孢子生殖胚囊未受精条件下的退化,对无孢子生殖植物非洲狼尾草未受精成熟胚囊中央细胞退化做了细胞形态学研究。没有受精的中央细胞退化时最显著的特点是细胞核产生核膜囊泡。核膜囊泡有两种类型:单层膜的囊泡和双层膜的囊泡,单层膜囊泡在细胞质中,双层膜囊泡在细胞核内。核膜囊泡有两种发生方式:1)核膜的外膜向细胞质一侧膨胀产生囊泡,囊泡进入细胞质;2)核膜向核内凹陷形成囊泡,囊泡进入细胞核。核膜囊泡类型与产生方式密切关联。核膜囊泡吞噬并消化包括线粒体在内的细胞质和核质。     

革兰氏阴性菌外膜囊泡作为亚单位疫苗的研究进展北大核心CSCD

外膜囊泡(OMVs,Outer membrane vesicles)是一种在革兰氏阴性菌甚至某些革兰氏阳性菌中普遍存在的包含生物学活性物质的囊泡状结构,其大小在20–250 nm之间。其组成成分包括脂多糖、外膜蛋白、磷脂、DNA以及在形成过程中被外膜包裹的周质成分等。由于外膜囊泡不能复制且含有大量的细菌抗原,并能有效激活免疫系统,所以被认为是极具潜力的疫苗候选。虽然外膜囊泡从发现至今有50多年的历史,但针对其作为疫苗的潜力探究最近几年才开始,中国关于这方面的文献报道还很少。本文从外膜囊泡诱导免疫应答的机制以及其作为疫苗的研究进展两个方面概述了外膜囊泡可以作为一种新颖的防控疾病的疫苗策略,为今后外膜囊泡疫苗的深入研究提供参考。     

2013年诺贝尔生理学或医学奖

三位2013年诺奖得主解开了细胞如何管理内部运输系统的秘密。每一个细胞都是一个生产和外运分子的工厂。例如,胰岛素被生产和释放入血,神经递质从一个神经细胞释放传递到另一个。这些分子以囊泡的形式被运输到细胞外部。这三位诺奖得主发现了控制这些细胞内囊泡被按时运输到目的地的分子机理。     

ESYT-2 在致密核心囊泡分泌中起到的作用

目的:研究秀丽隐杆线虫(简称线虫)中一种扩展的Synaptotagmin同源物ESYT-2在致密核心囊泡分泌过程中起到的作用。方法:以线虫为研究对象,运用线虫腔胞吸收ANF-GFP的基本原理来确定ESYT-2与分泌相关,之后又进一步使用全内反射荧光显微镜技术(TIRFM)来研究ESYT-2对致密核心囊泡的具体调控。结果:①ESYT-2功能缺失影响线虫神经细胞致密核心囊泡分泌。②ESYT-2影响致密核心囊泡分泌的栓系过程。结论:ESYT-2调控了致密核心囊泡的分泌过程。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

硅烷化氨基树脂用作电镜标本的水溶性包埋介质

氨基树脂可以在存在水的情况下固化,从而可以避免生物样品中的脂类因接触脱水用的有机溶剂而造成的流失。掺入少量的低分子量聚乙二醇(PEG-400)可以降低甲醛—戊二醛—尿素合成的氨基树脂固化块的脆性。固化后的标本用双三甲基硅基乙酰氨(BSA)处理,可降低树脂的亲水性,提高超薄切片的质量。蛙卵经过戊二醛固定、锇酸再固定、单宁酸媒染和醋酸铀整体染色(G-O-T-U处理),氨基树脂包埋和硅烷化反应(APE-Si处理);切片后用醋酸铀和/或柠檬酸铅复染,可以见到卵黄粒脂蛋白的晶格和边缘区中的小“脂泡”结构,后者是常规的Epon 812包埋法难以清楚显示的。硅烷化氨基树脂可以作为研究脂类超微形态的一种电镜标本的水溶性包埋介质。     

Exocyst在囊泡转运和细胞分泌过程中功能与结构的研究进展

Exocyst是由八个亚基蛋白组成的高度保守的复合物,目前被证实在细胞胞吐和囊泡转运,特别是囊泡与质膜的拴系阶段过程中发挥着十分重要的作用。本文综述了Exocyst在细胞中的定位、功能和结构方面的最新研究发现,以及复合物各亚基之间的相互作用和组装机制。当前的结晶学实验和电镜实验结果为Exocyst复合物的组装和解离机制提供了重要线索和证据。Exocyst功能与结构研究发现有助于我们进一步洞悉Exocyst复合物在囊泡转运和分泌过程中作用机制。     

囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维在大鼠三叉神经运动核内的分布

目的观察I、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维在大鼠三叉神经运动核内的分布。方法首先采用免疫荧光三重标记I、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体和神经元核蛋白以观察I、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维在大鼠三叉神经运动核内的分布;接着注射四甲基罗达明人下颌舌骨肌神经逆行标记三叉神经运动核开口神经元,再采用免疫荧光双重标记I型囊泡膜谷氨酸转运体和神经元核蛋白以观察I、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维在大鼠三叉神经运动核开口神经元区和闭口神经元区内的分布差异。结果I型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维仅在三叉神经运动核背外侧部分布,而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维在整个三叉神经运动核内分布;开口神经元区未观察到I型囊泡膜谷氨酸转运体阳性终末。结论闭口神经元接受I、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维支配,开口神经元仅仅接受Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维支配。     

囊泡运输调节机制的发现——2013年诺贝尔生理学或医学奖简介

细胞内特定蛋白质的靶向定位对于正常功能的发挥具有重要意义,而该过程由囊泡运输介导完成。谢克曼利用遗传学工具首先从酵母中筛选出多个囊泡运输相关基因;罗斯曼则用生物化学方法从哺乳动物细胞中鉴定出多个囊泡出芽和融合的相关分子并初步阐明其作用机制;苏德霍夫则发现钙离子调节突触囊泡释放神经递质的分子机制。这些研究拓展了对细胞内物质精确定位的理解,同时也更新了对部分疾病发生机制的认识。3位科学家由于"细胞内主要运输体系——囊泡运输调节机制的发现"而分享了2013年诺贝尔生理学或医学奖。     

细胞外囊泡研究进展

由细胞释放到细胞外环境中的来源于内体和细胞膜的多样化的膜性囊泡,统称为细胞外囊泡。这些细胞外囊泡作为细胞间转运膜和可溶性蛋白、脂质、RNA的载体,代表一种重要的细胞间通讯方式。虽然很多报道证明,多种细胞释放细胞外囊泡,并且具有一定的生理意义,但是我们目前缺乏对细胞外囊泡分子机制的深入理解,在细胞外囊泡研究的方法学以及人为调控细胞外囊泡的释放等方面也存在局限性,因此使得我们对它们在体内的生理学功能和细胞外囊泡作为疾病靶标的转化医学的研究进程缓慢。在这篇综述中,该文主要从细胞外囊泡的分类、分子细胞生物学研究、生理及病生理功能、细胞外囊泡的研究方法几个方面回顾当前细胞外囊泡领域的研究进展。     

完整人红细胞“发芽”释放无骨骼蛋白囊泡的观察

用Ca~2 -EDTA滴定法、加热法和室温静置法都能使人红细胞发芽并释放出囊泡,但发芽进程各不相同,囊泡大小也有差异。用微分干涉差显微镜和扫描电镜观察发现,发芽有时经芽胚红细胞这一中间阶段,但它决不是大多??数有关文献所提的棘细胞。又发现刚释放出来的囊泡具有“果蒂”样母体膜残留物。还发现发芽过程中常伴有细胞融合现象。据此认为芽胚红细胞极不稳定,它或者通过释放囊泡,或者通过细胞融合来达到稳定态。分析再次证明,发芽释放的囊泡缺失骨骼网络的主要成分,即收缩蛋白和肌动蛋白。     

聚合物囊泡在生物医学领域中的应用

聚合物囊泡是近年来新兴的一种自组装软性纳米材料。由于其优越的理化性质,聚合物囊泡已经受到了巨大的关注并且已经被利用在多个领域。文章综述了聚合物囊泡作为药物投递载体进行小分子化合物给药治疗肿瘤和反义核酸投递进行基因治疗;模拟细胞功能重建了ATP合成过程及模拟体内三酶偶联反应过程;作为近红外荧光探针在活体深层组织荧光成像技术等生物医学领域中的应用。     

细胞大型内吞囊泡快速标记方法的改进和应用

为了研究细胞内大型内吞囊泡的快速动态变化,本文借鉴了诱导神经元轴突诱导转向的方法,通过脉冲压力从微电极释放诱导因子,在细胞周围形成稳定的浓度梯度,诱导细胞产生胞饮泡,并通过局部染料释放进行快速标记和洗脱。同时利用活细胞成像技术,对胞饮泡标记过程以及标记后胞饮泡动态变化进行实时记录。该方法大大缩短了标记和洗脱的时间,从而实现了对细胞囊泡的快速标记和同步观察记录,可用于胞饮泡、溶酶体等细胞囊泡的动态标记和观察,是研究细胞大型内吞囊泡动态变化的一种实用且高效的手段。