一种简单高效的5＇-突出末端平端化方法

目的：报道一种利用Pfu DNA聚合酶延伸法补平限制片段5’-突出末端的平端化方法。方法：Pfu DNA聚合酶是用于PCR扩增的常规高保真DNA聚合酶,可在DNA模板和dNTPs存在条件下,沿5’→3’方向催化寡聚核苷酸聚合。由于终产物为平末端,可利用这一特点进行限制片段5’-突出末端补平。本文采用这一方法消除pAN7-1潮霉素抗性标记末端的XbaⅠ位点,以便载体构建中能够利用这一常见位点。pAN7-1先用XbaⅠ酶切成线性化载体,产生的5’-突出末端再用Pfu DNA聚合酶延伸法补平,通过平端化载体自连后XbaⅠ位点的消除来评价Pfu DNA聚合酶的平端化效果。结果：随机挑取3个重组子提取质粒均不能再用XbaⅠ切开,表明XbaⅠ位点成功消除。结论：Pfu DNA聚合酶具有高效率及高保真特性,因此本法简单高效而且经济适用。     

高保真酶特异性检测大鼠SNP基因型新方法

目的应用高保真酶（Pfu）和3’末端修饰引物在单管双向等位基因特异性扩增（SB-ASA）中区分SNP基因型,建立高保真酶特异性检测SNP基因型的新方法。方法选取近交系大鼠SNP位点,以RS8149053为例,设计两个外部引物和两个等位基因特异性引物,四引物3’末端进行硫代磷酸化修饰,应用高保真聚合酶（Pfu）进行特异性扩增,扩增结果测序验证其可靠性。结果在RS8149053 SNP位点（C/T）上,等位基因型CC扩增出179 bp目的片段,基因型TT扩增出597 bp目的片段,基因型不同则扩增出分子量不同的片段,目的条带测序结果与Rat Genome Database数据库基因型结果一致,高保真酶扩增结果稳定且特异性强。结论高保真酶等位基因特异性扩增技术能有效降低假阳性率,是一种快速、特异的SNP基因分型新方法。     

Pfu DNA聚合酶的制备过程及其条件优化

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)可以方便、快捷、准确地大量复制目的基因片段,是分子生物学研究中不可或缺的技术手段。在PCR反应中,DNA聚合酶起着关键作用。Pfu酶(Pfu DNA polymerase)是DNA聚合酶的一种,具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性,可在聚合酶链式反应中纠正错误掺入的碱基,可以快速、高保真地扩增DNA片段,在分子克隆和DNA测序当中运用十分广泛。本研究建立了一套Pfu聚合酶表达与纯化的详尽方案,该方案利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)作为诱导剂,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达Pfu酶,然后利用Ni-NTA柱层析纯化制备。研究中对IPTG诱导时间、细胞破碎条件、缓冲液类型及其p H、粗酶液热处理温度与时间、洗脱液中最佳咪唑浓度等重要条件和参数分别进行了优化确定。实验结果表明,使用该方案可以成功制备高产量高纯度的Pfu聚合酶,完全满足常规PCR反应的要求。本研究建立的实验方法和技术参数,十分适用于研究者小规模自主制备Pfu酶,对于有大量分子克隆要求的课题组,利用该方案自主制备Pfu酶能够显著节省科研成本。     

利用高保真酶扩增特性调整基因读码框的方法

在基因工程研究中,经常要涉及到对目的基因读码框进行调整的研究。本文报道了利用高保真DNA聚合酶扩增DNA后产生平末端的特性,及限制性内切酶对一重组的原核表达载体pET28a-HA进行读码框调整的研究,测序结果显示读码框按照预期设计正确调整,表明高保真DNA聚合酶可以用于DNA 3'凹陷端的补平,在DNA 3'凹陷端平滑化时多了一个有效的选择。     

用载体pUR222分析乙型肝炎病毒基因片段的DNA顺序

将含有乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的基因片段用核酸外切酶BAL-31消化,加EeoR Ⅰ接头,插入载体pUR222的多克隆接头的EcoR Ⅰ位点,转化受体菌Ecoli K12 BMH 71-18,取3个产生HBcAg水平不一的克隆株重组子作DNA顺序分析,用Sal Ⅰ从接头当中靠近Pst Ⅰ位点一端将重组DNA切开,用(α-~(?)P)dCTP和DNA聚合酶Ⅰ klenow片段,标记3＇末端,并将粘性末端补平,再用pst Ⅰ从靠近此位点(~(?)P)标记的3＇末端切掉四个核苷酸,使只保留一个标记末端,采用Maxam和Gilbert的方法化学降解,由互补链3＇端阅读DNA顺序,发现HBcAg表达水平与mRNA的起始密码前保留发卡结构的长短有很大关系。     

利用优化的5′-RACE实验定位副溶血弧菌基因的转录起始位点

目的:优化5′-cDNA末端快速扩增(5′-RACE)实验平台,用于定位副溶血弧菌(VP)基因的转录起始位点。方法:提取VP的总RNA,用rDNaseⅠ消化去除可能污染的基因组DNA;利用T4 RNA连接酶将已知序列的寡核苷酸片段连接至RNA的5′端,进而将其逆转录成cDNA;以cDNA为模板,采用巢式PCR技术扩增目的基因DNA片段,并将其直接克隆入T载体;最后通过测序比对的方法确定靶基因的转录起始位点。利用引物延伸实验进一步研究VPA1027的转录起始位点,以检验5′-RACE实验结果的可靠性。结果:5′-RACE实验结果表明,VPA1027、scrG、scrA、cpsA及VPA0198的转录起始位点分别为G(-103)、G(-70)、T(-205)、C(-129)和G(-238)(翻译起始位点为+1);引物延伸结果显示,VPA1027的转录起始位点也为G(-103)。结论:优化后的5′-RACE实验可以精确定位VP基因的转录起始位点。     

Pfu DNA聚合酶的表达条件优化及纯化研究

Pfu DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的高保真DNA聚合酶之一。本研究对重组菌株的Pfu酶基因表达条件进行优化,以提高Pfu DNA聚合酶的表达效率。通过在菌液深度OD600=0.87时加入1.5 mmol/L的IPTG进行诱导培养,诱导培养时间为11.03 h,用酶溶法对重组菌株进行破胞提取粗酶液,经热变性法与盐析沉淀法对杂酶进行纯化,最后经过透析后得到纯酶。采用考马斯亮蓝G-250法对酶进行含量测定及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯度,最后使用PCR反应检测提纯后的Pfu酶的活性。结果表明优化处理后制备的Pfu DNA聚合酶,其纯度、酶活性和酶特异性均达到市售的Pfu DNA聚合酶水平。本研究为Pfu DNA聚合酶的开发和利用奠定了基础。     

GM-CSF PCR产物的克隆:一种快速克隆PCR产物方法的建立

由于Taq DNA聚合酶对腺苷A的优先聚合,PCR产物两单链3′端带有一非模板依赖的碱基,所加多余碱基几乎总是A,因此用克隆平端DNA片段的方法克隆这种PCR产物,很难得到阳性重组子。解决上述问题的方法有3种,一是利用T_4 DNA聚合酶的3′外切酶活性,将PCR产物的多余碱基切掉;二是利用3′端带有dT的T-载体进行克隆;另外还可以用Pfu等DNA聚合酶扩增出不带多余碱基的PCR产物,尔后进行平端克隆。我们利用T-载体克隆的原理,酶切、     

用于丝状真菌的苯菌灵标记基因benA表达载体的构建

为了构建适用于丝状真菌遗传转化的表达载体,在质粒pAN52-1的高效组成型三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA和色氨酸C基因终止子TtrpC之间加入内切酶NotⅠ和ClaⅠ两个位点,构成质粒pAN52-2;把质粒pAN52-2中从启动子PgpdA到终止子TtrpC的基因片段通过PstⅠ和XbaⅠ酶切位点导入到pUC19载体上,并且应用PCR的方法在启动子Pg-pdA的前端引入HindⅢ酶切位点,构成质粒pUCPT-2;通过PCR,在苯菌灵抗性基因benA两端分别加入内切酶NotⅠ和ClaⅠ酶切位点,并克隆到pGEM-T载体上,得到质粒pGEM-Ben;用NotⅠ分别酶切质粒pUCPT-2与pGEM-Ben,连接苯菌灵抗性基因benA到pUCPT-2上,得到了pUCPT-Ben载体。经PCR、酶切和核苷酸序列检测,证实了PgpdA-benA-TtrpC表达元件连接成功,即得到了苯菌灵抗性基因高效表达载体。     

家蝇抗菌肽Defensin基因同向串联表达载体的构建和鉴定

目的:构建家蝇抗菌肽Defensin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法:PCR法扩增家蝇抗菌肽Defensin基因成熟肽片断,目的片断的上游5′端带有EcoRⅠ和NheⅠ位点,下游5′端带有NotⅠ和XbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T载体,利用pMD18-T载体的NdeⅠ位点和目的片断上的一对同尾酶(NheⅠ和XbaⅠ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Defensin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果:PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明多拷贝基因重组质粒构建成功。结论:该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础。