PCR方法检测食品中致病菌常用的靶基因及其引物

自从KARY MULLIS等人首次运用PCR方法至今,该技术不断得到了优化和发展．已被广泛应用于各个技术领域。在食品微生物检测方面PCR方法同样具有应用优势。首先能在很短的时间内获得用传统方法几天才能得出的结果;其次如果基因和引物选择适当则可能避免传统方法中的假阳性和假阴性结果;此外有文献报道当反应体系中有0．5个菌细胞就能检出,这足以体现该方法的灵敏性,因此该方法因其快速、特异、灵敏而备受青睐。由此,该文介绍PCR方法检测食品中常见致病菌的靶基因及其引物。     

通用引物双重PCR在节肢动物物种鉴定中的应用

【目的】本研究旨在使用基于线粒体基因通用引物的双重PCR技术同时扩增单一样本中两条标记基因,从而达到简化节肢动物物种鉴定流程的目的。【方法】在一次PCR实验中同时加入可扩增线粒体COI基因和16S rDNA两个不同分子标记的引物,对3纲8目14科的14种节肢动物物种标本的基因组DNA进行扩增;扩增产物经电泳和胶回收后测序,并BLAST在线搜索相似序列,验证基于通用引物的双重PCR在不同的动物类群中用于物种鉴定的有效性。【结果】应用基于COI和16S rDNA的引物从分属于3纲8目14科的14种节肢动物基因组DNA中均可成功扩增目的基因;扩增产物测序结果进一步证实了扩增的准确性。【结论】通过本方法进行物种的分子鉴定,不仅可以保证物种鉴定的高准确率,还可以明显减少时间与DNA样本量的消耗,这对需要快速准确鉴定物种或珍稀的材料样本十分重要。     

多种食源性致病菌检测的多重PCR 方法的研究

目的:利用多重PCR技术,建立可以同时检测多种食源性致病菌的多重PCR方法。方法:分别选择沙门氏菌invA基因,志贺氏菌的ipaH基因,单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因,大肠杆菌O157:H7的eaeA基因,副溶血弧菌的toxR基因,设计多重PCR引物,建立多重PCR检测体系,并对该体系进行特异性和灵敏度实验。结果:通过对19株菌株进行实验,所有的目标菌株均为阳性,而其余菌株为阴性。对多重PCR体系的灵敏度进行考察,沙门菌的灵敏度为5000 CFU/mL;志贺氏菌的灵敏度为5500CFU/mL;单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为5200 CFU/mL;O157:H7的灵敏度为5000CFU/mL;副溶血弧菌的灵敏度为6300CFU/mL。结论:建立的多重PCR体系能实现多种致病菌同时检测。     

类群特异性PCR引物设计与评估

本文以真核藻类18SrDNA类群特异性PCR引物的设计与评估为例,详细介绍了如何利用Primrose等一系列程序设计类群特异性PCR引物并评估其敏感性与特异性,并对这一方法的优势与应用类群特异性PCR引物进行群落多样性分析需要注意的问题进行了讨论。     

PCR和随机引物标记探针的方法比较

采用PCR标记法和随机引物标记法对小白鼠、欧洲田鼠(M icrotus arvalis和Pitymys duodecim costatus)的Sry基因保守区进行地高辛标记,结果显示PCR标记的探针灵敏度要高于随机引物法,同时对两种标记方法进行了比较,为进一步进行Southern杂交研究打下了基础。     

饮用水中5种致病菌多重PCR技术检测研究

沙门氏菌(Salmonella sp．)、志贺氏菌(Shigella sp．)、绿脓杆菌(Pseudonmnas aeruginosa)、肠出血型大肠杆菌O157(Eterohaemorrhagic O157)和副溶血弧菌(Vibrio rahaemolyticus)是5种饮用水中不得检出食源性致病菌,根据它们的毒素基因、高度保守基因及特异性基因,设计合成5对寡核苷酸引物,应用PCR技术对10个属的30株细菌进行引物特异性检测。通过对多重PCR反应体系、条件进行优化,显提高了检测灵敏度。初步应用于水样分析中,极大的缩短了检测时间、降低了成本。实验结果表明：5对寡核苷酸引物都具较高的特异性和专一性,多重PCR检测灵敏度达到10^1～10^2cfu,检测需5～6h,在水样检测的初步应用中得到了均一、稳定、清晰的结果,可推广应用于环境监测、水源检测、食品卫生监督、商品检验检疫等领域。     

多重PCR快速检测化妆品中三种致病菌的研究

利用多重PCR技术建立快速检测化妆品中三种致病菌的方法。根据已报道的大肠杆菌phoA基因、铜绿假单胞菌外膜蛋白基因oprL和金黄色葡萄球菌特异性序列SmaI选择特异性引物,对人工染菌化妆品进行多重PCR检测。结果显示,三种致病菌的基因组DNA均可与各自引物特异性结合,扩增产物大小分别为622 bp、504 bp和426 bp。该方法用于人工污染的化妆品中,大肠杆菌的检出限浓度为103 CFU/mL,铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检出限浓度为105 CFU/mL。作者建立的多重PCR方法可同时快速、特异地对化妆品中三种致病菌进行检测,在化妆品行业具有较大的应用价值。     

食源性致病菌多重PCR快速检测方法建立与应用

利用PCR技术,建立多组多重食源性致病菌PCR快速检测方法。设计受试菌特异性引物,反应体系中加入多对引物和多种DNA模板,采用正交试验优化PCR反应条件,进行特异性引物的PCR扩增。建立了多组多重食源性致病菌PCR快速检测方法,方法中所检测受试菌株和模拟样品均出现特异性扩增条带,结果与实际相符。所建立多组多重PCR快速检测体系符合设计要求,可以应用于食源性突发公共卫生事件的应急检测和日常样品检测工作。     

应用改进的通用荧光PCR引物进行多重STR分型

通过设计通用荧光PCR引物并结合DNA测序系统建立了小鼠的多重STR分型方案.实验针对小鼠基因组设计了两对不同的通用引物序列,标记了FAM荧光的通用序列和"加尾"的位点特异性引物共同用于小鼠的多重PCR的STR基因分型.本研究优化了通用引物和特异性引物间的比例,优化了多重STR-PCR的反应条件,并最终利用该技术方案实现了五重STR分型.实验验证了该方案在多重STR分型中的可行性.与传统的荧光检测PCR产物方案相比,应用通用方案完成多重PCR反应大大节省了实验时间与经费.     

用寡核苷酸本身作为PCR引物检测其重组DNA

以待检测的寡核苷酸本身作为一个引物,加上两个载体特异引物,组成两对PCR引物。含待检测寡核苷酸片段的重组DNA用这两对引物可分别扩增出两个大小不同的片段,而载体DNA只有一对引物（即载体特异引物）可扩增出一个较小的片段。     

Detection of Flaviviruses by Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction with the Universal Primer Set

Using a universal primer set designed to match the sequence of the NS1 gene of flaviviruses, the virus RNA of dengue (DEN), Japanese encephalitis (JEV), powassan and langat of Flaviviridae were successfully amplified by polymerase chain reaction (PCR) via cDNA; and with different internal primers, the serotypes of the dengue viruses were identified. Of the 78 clinically diagnosed dengue fever patients, 18 patients were positive for DEN 1, 48 patients for DEN 2 and 8 patients concurrently infected with DEN 4. Of the 52 patients admitted with Japanese encephalitis (JE), 45 were determined to be JEV infections. By nested PCR, we completed the identification of flaviviruses within 2 days. The results show that seven primers have a potential value for rapid clinical diagnosis of flavivirus infections.     

猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

用于聚合酶链式反应(PCR)引物设计的计算机程序

 本文报道了两个用于PCR引物设计的计算机程序PCRDESN和PCRDESNA。PCRDESN程序主要从以下4个方面评价用户自己设计的一对引物的质量:(1)引物内的碱基反向重复或发夹结构,(2)两个引物之间的碱基互补配对,(3)两个引物之间的同源性,(4)引物的碱基组成及特点和T_m值计算。通过用多例文献发表的及本院有关实验室提供的引物对序列的验证,确定了程序的运算参数,证明该程序能较好地检验引物对的质量和解释某些PCR实验失败的原因。PCRDESNA程序采用逐级优化的方法和比PCRDESN所选用的更严紧的引物选择参数对用户提供的核酸序列进行快速检索,以确定所有可能的和合适的引物对。     

提高PCR产物的几种有效方法

结合作者的工作实际 ,着重介绍了有效提高PCR产物的几种方法 :如怎样高效快速地设计PCR引物 ,怎样尽快确定PCR反应的最适退火温度 ,如何提高GC富集区的扩增效率等 ,为分子生物学工作者提供一些可以借鉴的方法及经验。     

A Universal Method for the Identification of Bacteria Based on General PCR Primers

The Universal Method (UM) described here will allow the detection of any bacterial rDNA leading to the identification of that bacterium. The method should allow prompt and accurate identification of bacteria. The principle of the method is simple; when a pure PCR product of the 16S gene is obtained, sequenced, and aligned against bacterial DNA data base, then the bacterium can be identified. Confirmation of identity may follow. In this work, several general 16S primers were designed, mixed and applied successfully against 101 different bacterial isolates. One mixture, the Golden mixture7 (G7) detected all tested isolates (67/67). Other golden mixtures; G11, G10, G12, and G5 were useful as well. The overall sensitivity of the UM was 100% since all 101 isolates were detected yielding intended PCR amplicons. A selected PCR band from each of 40 isolates was sequenced and the bacterium identified to species or genus level using BLAST. The results of the UM were consistent with bacterial identities as validated with other identification methods; cultural, API 20E, API 20NE, or genera and species specific PCR primers. Bacteria identified in the study, covered 34 species distributed among 24 genera. The UM should allow the identification of species, genus, novel species or genera, variations within species, and detection of bacterial DNA in otherwise sterile samples such as blood, cerebrospinal fluid, manufactured products, medical supplies, cosmetics, and other samples. Applicability of the method to identifying members of bacterial communities is discussed. The approach itself can be applied to other taxa such as protists and nematodes.     

用万能引物PCR法从YAC中分离制备荧光原位杂交探针的研究

报道了一种从微量且未知碱基顺序的YAC DNA中制备FISH探针的新方法——万能引物PCR(UP PCR),即把复性后的UP-Linker连接于PFGE分离后经Alu Ⅰ酶切的YAC DNA上,再用UP对其进行PCR扩增和标记。由于Alu Ⅰ的广谱性和UP与Linker长度不同等,使该法能根据PCR效率调节扩增产物的广泛性向特异性的转变,且产物能覆盖YAC嵌入DNA的全长。此法制备的人21号染色体FISH探针,特异性强,杂交信号明亮,21号染色体的检出率高。该法稳定简便。     

戊型肝炎病毒通用性PCR引物的设计及其基因分型的研究

针对戊型肝炎病毒(HEV)基因分型尚无统一标准的现状,本研究通过分析GenBank中现有的82株HEV基因组全序列,设计一组HEV通用性PCR引物(HEVuPrimer)用于扩增不同基因型HEV可测序长片段,分别基于全基因序列、HEVuPrimer扩增序列和较常用的MXJ引物扩增序列对82株HEV进行基因分型,再以HEVuPrimer扩增1～4型HEV参考株和HEVIg M抗体阳性的临床标本,进行HEV基因分型的研究。研究结果表明HE-VuPrimer扩增区段与全基因序列对82株HEV的基因分型结果完全一致;HEVuPrimer与HEV序列的匹配程度明显高于MXJ引物,且HEVuPrimer区段的基因分型结果较MXJ区段的更为准确。HEVuPrimer可同时扩增出不同基因型HEV基因片段。124份临床标本中,60份测出特异性HEV RNA,阳性率为48.4%,基因分型结果均为4型HEV,但分属于4个不同的基因亚型,核苷酸同源性为80.0%～99.9%,其中有6例近期分离的HEV毒株形成一新的基因亚型。因此,基于HEVuPrimer扩增区段的HEV基因分型方法具有较高的可靠性和可信度,为建立统一、可行的HEV基...     

Development of a genus specific primer set for detection of Leishmania parasites by polymerase chain reaction

Abstract We have compared the sequences of a major class of kinetoplast DNA (kDNA) minicircle (pLURkE3) of Leishmania strain UR6 with other minicircle sequences from different Leishmania species. Alignment of these sequences allowed the selection of a pair of oligonucleotides suitable as primers in polymerase chain reaction (PCR) which is specific for Leishmania parasites. PCR with this genus-specific primer set is capable of detecting 1 femtogram of kDNA. These primers have been tested with kDNAs from both old world and new world Leishmania species. The results indicate that the primers may be suitable for detection of any kind of leishmaniasis.