昆虫杆状病毒载体的细胞培养和重组蛋白生产

利用杆状病毒载体和昆虫细胞生产重组蛋白的研究日益增多,本文就杆状病毒的宿主细胞种类、培养条件、大规模培养方法和虫体表达以及昆虫细胞对表达产物的翻译后修饰加工的研究现况进行了概述。     

BJ46a基因在昆虫细胞的转染、蛋白表达及超微结构观察

目的研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a在杆状病毒表达系统的表达及宿主细胞Sf9超微结构的变化。方法将构建的杆状病毒重组穿梭载体Bacmid BJ46a,经Cellfectin脂质体介导转染Sf9昆虫细胞,获重组杆状病毒颗粒;以高滴度病毒感染Sf9昆虫细胞,行Western blot观察BJ46a融合蛋白的表达。在病毒扩增、蛋白表达过程应用透射电镜和超薄切片技术观察Sf9细胞超微结构的变化。结果Western blot分析表明：在转染病毒的Sf9细胞出现BJ46a融合蛋白表达条带。电镜观察表明：Sf9细胞在病毒扩增过程,细胞核增大,病毒发生基质形成,杆状病毒在其周围装配。蛋白表达期间,杆状病毒量剧增,细胞核内外存在大量丝状纤维。结论BJ46a基因可在杆状病毒表达系统成功表达,并伴随着宿主细胞超微结构的显著变化,其结果为杆状病毒表达系统的研究奠定坚实的基础。     

昆虫杆状病毒应用于哺乳动物基因治疗的研究进展

杆状病毒是一类宿主特异性的昆虫病毒。昆虫杆状病毒表达系统是一个高效的真核表达系统,被广泛用于在昆虫细胞或昆虫幼虫中生产外源蛋白质。杆状病毒不能感染哺乳动物,却可以进入不同物种和组织来源的多种哺乳动物细胞,并在合适的哺乳动物启动子控制下表达外源基因。杆状病毒在哺乳动物细胞中不能复制,对细胞没有毒性,加上杆状病毒本身具有基因组大、可操作性好等优点,作为哺乳动物基因治疗的载体,将治疗基因传递给哺乳动物细胞已受到了广泛关注。在此就杆状病毒作为基因治疗载体的最新研究进展进行了阐述并探讨其发展趋势。     

杆状病毒载体及其在昆虫细胞中表达外源基因的研究进展

本文介绍了杆状病毒载体在昆虫细胞中表达外源基因的基本策略和发展趋势。杆状病毒载体系统近年来已被人们广泛用来表达人类、动物和植物等的一些重要蛋白质分子,在医学、农业等领域的基因工程研究中发挥了越来越大的作用。杆状病毒载体系统表达外源基因的效率高,表达产物的结构和活性与天然产物一致,为当今基因工程研究中最有发展前途的病毒载体表达系统。     

杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达的研究进展

杆状病毒(Baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒, 可用做生物杀虫剂或作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白, 制备疫苗。研究发现, 在哺乳动物细胞中携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细胞中增值, 对细胞毒性小, 转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因, 哺乳动物细胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰, 表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此, 杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体, 用于表达外源基因及作为一种基因治疗载体, 具有巨大潜力, 日益受到人们的关注。本文对杆状病毒作为一种表达载体在哺乳动物细胞中表达的研究进展进行了综述。     

杆状病毒载体的研究进展

重组杆状病毒目前代表了一种发展比较成熟的方法技术学。其中载体的发展,尤其是用于表达水平的调控方面已达到了一个相当的高度,但关于表达的其它方面,如多种蛋白产物在同一细胞中的产生,改进的蛋白产物的纯化方法以及充分的蛋白质翻译后加工方式,为新载体和宿主细胞的完善发展留下了广阔的空间和前景。     

以柞蚕NPV为载体在柞蚕蛹体内表达外源基因获得成功

辽宁省农科院大连生物技术研究所张春发等人利用柞蚕核型多角体病毒(ApNpV)组建成转移载体,并以此载体携带外源基因(人白细胞介素-4、DE糖蛋白)在草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞、柞蚕卵巢细胞以及柞蚕蛹活体中表达成功。实验表明,表达产物的确以非融合蛋白形式出现,从而建立了柞蚕NpV载体—柞蚕蛹活体宿主表达系统。这是继菌苜蓿纹夜蛾核多角体病毒(AcNpV)—Sf9细胞载体表达系统和家蚕核多角体病毒(BmNpV)——家蚕幼虫载体表达系统以后又一个昆虫杆状病毒载体达表系统。由于该系统是利用柞蚕蛹活体为宿主     

昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展

昆虫杆状病毒表达系统 (BEVS)因具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点 ,现已成功表达了近千种高价值蛋白。随着杆状病毒载体的不断改进 ,该系统获得重组病毒的几率已从最初的 0 1 %～ 1 %提高到现在的 80 %～ 90 %以上 ,并且出现了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体和高水平表达重组蛋白的昆虫细胞系。杆状病毒载体将在未来药物研发、疫苗生产、基因治疗、重组杆状病毒杀虫剂等领域得到广泛应用。但存在的一些问题如杆状病毒的基因组学研究相对薄弱 ,有关病毒晚期基因的高表达和调控机制等还不十分清楚 ,表达产物的纯化比较困难 ,多元表达等方面的技术还不够成熟等 ,均有待进一步解决。     

人细小病毒B19病毒样颗粒的制备

采用昆虫杆状病毒表达系统,制备人细小病毒B19病毒样颗粒(VLPs)。先通过PCR方法合成细小病毒B19衣壳蛋白基因VP2,将其克隆到pFastBac1质粒,然后转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBac-VP2。利用rBac-VP2感染Sf9细胞表达B19VP2蛋白,通过间接免疫荧光、Western blotting等方法鉴定目的蛋白表达。采用两次超速离心的方法对表达产物进行纯化,纯化产物在透射电镜下可见直径约22nm的VLPs。本研究成功制备了人细小病毒B19的VLPs,为B19感染血清学检测方法的建立提供了参考。     

杆状病毒表达系统研究进展

介绍了杆状病毒表达系统的构建策略,载体发展情况及其表达外源基因的影响因素.杆状病毒表达系统在基因工程、药物开发、疫苗生产等方面发挥了越来越重要的作用,其表达效率高,表达产物与天然产物有相似的结构和活性,且对人畜无害,为当今基因工程研究中最有发展前途的表达系统.     

杆状病毒经口感染及经口感染因子研究进展

杆状病毒(Baculovirus)是一类专一性感染节肢动物的病原微生物,其宿主主要为鳞翅目、双翅目及膜翅目昆虫。在自然界中,杆状病毒通过经口感染的方式在其宿主中建立感染,其中杆状病毒经口感染因子发挥着重要的作用。本文回顾了杆状病毒的基本特性,阐述杆状病毒建立经口感染在进化上的必要性以及在此过程中的主要事件,包括杆状病毒经口感染方式的进化、病毒粒子与昆虫中肠微绒毛细胞的结合和融合等,并着重介绍杆状病毒经口感染因子的鉴定和功能研究。这些研究对人类了解和利用杆状病毒进行生物防治和外源基因表达具有重要的指导意义。     

杆状病毒与昆虫宿主相互作用的研究进展

杆状病毒与昆虫宿主相互作用是一种基本的分子和生态问题, 不仅在农业上, 而且在真核表达系统、 基因治疗、 蛋白表面展示 系统以及基因工程疫苗等方面都有重要的实际应用。杆状病毒还是一种很有潜力的病毒杀虫剂, 而且对环境来说是安全的。研究这些相互 作用也产生了许多重要和有价值的发现。杆状病毒生命循环中存在两种不同形式的病毒, 即包埋型病毒粒子(occlusion derived virus, ODV) 和出芽型病毒粒子(budded virus, BV)。ODV包裹于多角体中, 主要负责宿主的原发感染; 而BV由感染的宿主细胞释放后引发继发 感染。病毒侵染起始于敏感的昆虫宿主食用了污染包涵体病毒的植物。在宿主中肠的碱性环境中, 多角体溶解释放ODV, ODV与宿主肠道 柱状上皮细胞细胞膜融合, 通过内吞体进入细胞。之后核衣壳从内吞体中逃脱并被转运到细胞核。病毒转录和复制在细胞核进行, 新生 的BV粒子从基底膜出芽引起全身感染。杆状病毒与宿主细胞相互作用包括从病毒结合和进入时的相互作用, 到宿主基因表达调节, 以及 修饰与调节细胞和机体所发生的生理和防御的相互作用的复杂和微妙的机制。本文主要以杆状病毒侵染昆虫宿主的过程为线索, 总结和评 述了杆状病毒与昆虫宿主相互作用方面研究的最新进展, 特别是杆状病毒基因在病毒入侵过程中所起的作用。     

杆状病毒凋亡抑制基因的研究进展

杆状病毒(bacu lovirus)感染昆虫细胞能引起细胞凋亡,但在长期进化过程中,杆状病毒可通过自身编码凋亡抑制基因的表达,抑制细胞凋亡以利于自己的增殖。目前在杆状病毒基因组中已发现两种不同类型的细胞凋亡抑制基因p35/p49和iap,这两类凋亡抑制基因分别作用于细胞凋亡途径的不同位点,以抑制细胞的凋亡。近年来人们对这两种基因的蛋白结构及作用机制等方面进行了大量的研究,这些为今后研究昆虫细胞凋亡,扩大杆状病毒宿主范围等方面奠定了基础。     

杆状病毒编码的内核膜分选模序研究进展

摘要:杆状病毒(Baculovirus)是一类在自然界中专一性感染节肢动物的病原微生物,其宿主主要为鳞翅目、双翅目及膜翅目昆虫。杆状病毒感染其宿主细胞时产生多种整合膜蛋白,通过细胞连续膜系统,从内质网、外核膜到内核膜,并最终定位到病毒粒子囊膜上。杆状病毒编码的内核膜分选模序作为一种蛋白分选信号序列,在此过程中发挥关键作用。本文对杆状病毒编码的内核膜分选模序研究进展进行综述,包括其作为一种新型蛋白定位信号的分子作用机理和分选作用模型,以及与杆状病毒经口感染之间的关系。这些研究不仅在分子水平上丰富和补充了人们对蛋白分选机制的认识,而且对于杆状病毒分子生物学研究和应用具有重要的推动意义。     

家蚕溶茧酶基因的真核表达及其产物的生物活性检测

为了研究家蚕 Bombyx mori 溶茧酶基因 （cocoonae）真核表达及其产物的生物活性,将溶茧酶基因（GenBank 登录号 EF428980）克隆至杆状病毒转移载体 pFastBac^TM 1 中获得 pFast-cocoonase,将其转化 DH10Bac 感受态细胞后,PCR 方法检测证实所分离的重组病毒 DNA 中含有目的片段溶茧酶基因。用脂质体法 转染家蚕 BmN 细胞,获得重组病毒。SDS-PAGE 分析显示,感染重组杆状病毒 Bac-cocoonase 的细胞表达产物在约为 27.6 kD 处出现特异性条带,这与预测的蛋白大小相符。用该表达产物与茧丝反应后,电镜下观察茧丝的形态,结果表明表达产物对茧丝的丝胶层有一定的水解作用。     

禽白血病病毒J亚群囊膜蛋白env基因的克隆和表达

禽白血病病毒J亚群（ALV－J）是90年代鉴定出的ALV的新亚群,其囊膜蛋白env基因序列别与ALV A－E亚群的有相当大的差别。为ALV－J env基因及春表达产物的特点,用PCR方法扩增出ADOL－4817毒株的env基因,并克隆进TA载体,经电泳鉴定大小为1.7kb。将克隆出的env基因与杆状病毒pBlue-Bac4表达质粒DNA连接,构建成转移性载体pBac4817env,通过与Bac-N-Blue杆状病毒DNA共转染,区得了重组病毒rBac4817env-2。该重组杆状病毒感染Sf9细胞,能高效表达env基因产物,免疫荧光分析结果证明,单克隆抗体G2或多价兔抗env gp37血清能识别Sf9细胞,能高效表达env基因表达的特异性抗原;Western blotting分析结果表明,表达的重组基因产物的分子量大小约为90kD-94kD。用这些重组基因产物免疫鸡可以诱导鸡导鸡产生出高滴度的抗ALV－J特异性抗体。这一结果提示,这种杆状病毒表达的重组基因产物有助于ALV－J env基因生物学特性的深入研究。     

重组杆状病毒：一种新型哺乳动物细胞基因转移载体

昆虫杆状病毒表达载体系统已广泛应用于表达重组蛋白。近年来研究显示,含有哺乳动物细胞启动子元件的重组杆状病毒可有效地转导多种哺乳动物原代和传代细胞。借助于杆状病毒载体,已成功实现了外源基因在哺乳动物细胞内的瞬时或稳定表达;而在体内,杆状病毒可被血清中的补体成份所灭活,从而抑制了转导效率,但是通过对杆状病毒进行修饰（如伪型杆状病毒）,可以抵抗补体的灭活作用。研究人员对杆状病毒转导机制进行了探索,但是至今尚未完全弄清。杆状病毒基因转移系统最大特点是,杆状病毒能在昆虫细胞内大量繁殖,而不能在哺乳动物细胞内复制,因而具有很高的生物安全性;同时,此系统还具有操作简便、插入外源基因容量大等优点,使得杆状病毒作为哺乳动物细胞的基因传递载体,具有广泛的应用前景。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,用于E2蛋白功能、开发CSF新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法采用RT-PCR扩增CSFV E2基因,将PCR产物克隆到pGEM-T-Easy载体,将该基因插入到pFast-BacHT A载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western-blot及免疫组化鉴定。结果成功克隆CSFVE2基因,其核苷酸序列为1119 bp。SDS-PAGE电泳结果显示表达E2蛋白相对分子质量约为43×103,Western-blot和免疫组化结果证实表达蛋白能够被CSFV标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的成功表达了CSFV E2蛋白,与CSFV标准阳性血清具有较好的反应性。     

杆状病毒基因工程进展

近年来,应用昆虫杆状病毒作载体在昆虫细胞或虫体中高效表达外源基因的技术已得到广泛的推广应用。这一基因工程系统安全、高效、容量大,表达产物具有生物活性,是很有潜力的系统之一,已有数百种动物、植物、微生物,病毒的基因在这一系统中成功表达,并有多篇综述文章和专著详细介绍这一载体表达系统。本文将概述杆状病毒分子生物学及基因工程的基本原理,主要介绍近几年来的研究与进展。     

VEGF受体KDR胞外区基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

VEGF(血管内皮细胞生长因子,Vascular Endothelial Growth Factor)是刺激内皮细胞增殖和新生血管形成的最重要因子,与多种实体瘤的生长和转移密切相关。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常有前景的课题。将VEGF受体KDR胞外区前三个Loop 969碱基对的cDNA片段克隆到杆状病毒表达载体pFastBacI,与杆状病毒表达载体Bacmid同源重组后,转染昆虫细胞SF9,获得重组杆状病毒并证明了目的基因的高效表达。经Western blot证实表达产物的特异性。经ELISA和体外生物学活性检测表明表达产物可阻断VEGF的生物学活性,抑制鸡胚CAM血管的生长。