PCR产物末端性质的分析研究

利用PCR、UT-PCR、克隆及测序等技术,对强直性肌营养不良基因（MT-PK）3′-非翻译区分别用Taq,Taq＋Pwo DNA聚合酶进行了扩增、克隆和测序,研究了PCR产物末端组成情况,并比较了上述两种DNA聚合酶对PCR产物末端的影响.结果在用Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物主要得到3′端突出1个A（占67.3％,35/52）;在Taq＋Pwo DNA聚合酶扩增的PCR产物末端中得到3′端+A的仅占17.4％,而－1的占34.8％,与前者显著不同.表明PCR扩增产物的末端是复杂多样的.     

一种高效克隆PCR产物的方法

利用TaqDNA聚合酶3′末端非模板依赖性加碱基的特性,制备了3′末端带T载体,与18种PCR产物进行连接反应。结果,阳性克隆率达40％—70％,而对照组小于10％。证明该方法是一种高效节省适用范围广的好方法。     

可直接克隆PCR产物的克隆载体的构建

本文描述一种构建与PCR产物直接连接的克隆载体的方法。以高拷贝克隆载体pUC118为骨架载体,在pUC118质粒氨苄抗性基因的Eam1105 I 酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam1105 I 酶切位点。经转化大肠杆菌JM109证实,该改造过的pUC118质粒,可使宿主细胞仍具有氨苄抗性。将一人工合成的具有两个Eam1105 I 酶切位点的互补寡聚核苷酸链（两端具有BamH I 接头）插入已封闭Eam1105 I 酶切位点的pUC118*载体的BamH I 位点,构成新的克隆载体,此质粒命名为pUC118E。该载体经Eam1105 I 酶切后,可产生3′末端突出一个T碱基的T-载体,能与PCR产物直接连接。 Abstract:A new method for construction of a cloning vector (T-vector) for direct ligation with PCR products was described.The T-vector derived from pUC118 in which the unique restriction site of Eam1105 I in the region of Ampr gene was deleted and an artificial DNA fragment flanking two Eam1105 I was introduced at the site of BamHI.The modified vector was named as pUC118E.A T-vector with 3′over hang end of a single T can be obtained via digesting of pUC118E with Eam1105I.PCR products can be easily cloned with this T-vector.     

改良法制备PCR产物克隆载体

将克隆载体平端切割后,向反应体系中加入ｄＴＴＰ,用ＴａｑＤＮＡ聚合酶处理载体,使其３－端带上一个凸出的单碱基Ｔ,修饰后的载体可直接与纯化的ＰＣＲ产物连接。     

两种pUC18高效T载体的构建

T载体是用于直接克隆PCR产物的线性载体.在此之前,克隆PCR片段时一般先用Klenow片段酶或T4DNA聚合酶削平PCR产物两端,克隆过程中又大都不能使用碱性磷酸酶为载体片段脱磷,因为绝大多数PCR引物5’端未磷酸化,T载体的诞生使分子生物学工作者摆脱了这一窘境,而且,T载体的3’端突出的T碱基与PCR产物3’端由于Taq酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的A碱基[1]互补,使载体与PCR产物的连接效率大大提高.由于具有上述优点,T载体从一产生就引起人们极大的兴趣,很多公司也相继推出了各自的T载体系统,并运用该技术改造了很多传统载体.本…     

利用PCR技术构建体外高效转录系统

设计并合成了一对 PCR 反应引物,其5′端引物除含有目的基因5′端序列外,还外加 T7 RNA 聚合酶启动子的17个核苷酸.3′端引物则按常规设计.以染色体 DNA为模板,通过 PCR,可扩增出带有 T7 RNA 聚合酶启动子的目的基因 DNA 片段.以此 PCR 产物为模板,在体外成功实现了高效转录.这是一种快速、简便构建体外高效转录系统的好方法.     

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体（毕赤酵母表达型T载体）。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片断的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因（cbh2）的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余的氨基酸。     

DNA片段的高效克隆

用Taq酶进行PCR扩增时,其PCR产物的3末端有一个附加的A碱基。因此,目前在克隆PCR产物时一般使用T－VCctor。但T—Vector的价格比较昂贵,而使用本试剂盒也可在短时间内使PCR产物与平滑末端载体进行高效连接。PCR产物与平滑末端的载体连接时,有必要除去3廉端的附加碱基,并使其5末端磷酸化。使用TaKaRaBKLKit（BllllltillgKillstiollLigstiollKit）可使这一连串的反应在短时间内完成。PCR产物的末端平滑化与磷酸化反应在一个反应体系内同时进行,一次反应后便可得到能够用于连接的DNA片段。用于连接反应的PCR产物无需进…     

限制性酶切片段的TA法直接克隆与测序

报道了一种粘性末端的限制性酶切片段的直接克隆和测序的方法。对限制性酶切片段的粘性末端先用T4洲A聚合酶处理,变为平末端,然后用Taq^TM DNA聚合酶在其3′末端加上A腺苷,即可利用T／A克隆载体进行直接克隆测序。利用这种简单而快速的方法,对2个RFLP探针Psr680的限制性酶切片段(1．65kb和0．65kb)进行了测序,表明这种方法可以替代利用相应载体进行相应酶切等处理的粘性末端连接克隆测序的方法。     

一种提高PCR产物定向克隆效率的新方法

介绍一种在对PCR产物进行定向克隆之前先用T4DNA聚合酶将PCR产物末端进行补齐,然后进行限制性酶切和克隆,能显著提高克隆效率的新方法。     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。     

人TIMP-1 cDNA克隆、真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

根据 Gen Bank中 TIMP- 1基因的碱基序列 ,用 RT- PCR方法从人的正常肾组织中克隆出包含信号肽在内的 TIMP- 1全长 c DNA序列 .采用 T- A克隆的方法将之插入 p CRR2 .1中间载体 ,DNA测序证实该片段序列与文献报告的完全一致 .利用亚克隆的方法将 TIMP- 1 c DNA片段克隆到 pc DNA3载体上 ,构建出 pc DNA3/ TIMP- 1的真核表达载体 ,通过脂质体 DOTAP转染至 COS-7细胞 ,Northern印迹及原位杂交证实在 COS- 7细胞上获得人 TIMP- 1的高效表达 ,细胞增殖实验表明 TIMP- 1的高产表达可促进 COS- 7细胞的增殖 ,证实了所转染人 TIMP- 1的生物活性     

通过PCR进行长片段DNA的合成

利用PCR合成DNA长片段(Synthesis Large Frament DNA using PCR,SLFD PCR)是一种有效的合成长片段DNA的方法。采用一段已知的500～600bp碱基的DNA片段为PCR模板,根据所要合成的DNA序列可以设计一系列的PCR引物,这些引物都位于模板DNA的5’端,长度为50～60bp,且从5’到3’方向顺序重叠,重叠碱基数目为12～15,全部引物叠加所得到的DNA正是自己所要合成的DNA。这组引物中最3’端的一条含有一个BamH Ⅰ酶切位点,在该位点后面有15碱基与模板DNA5’端一致的序列。另外还设计一条与该模板匹配的下游引物,引物内也含有一个BamH Ⅰ酶切位点。首先采用5’端最右侧的引物与下游引物进行PCR,在PCR进行10个循环后,以此次PCR的产物为下一轮PCR的模板,该轮PCR采用右侧倒数第二个引物为上游引物,下游引物保持不变。采用类似的方法,完成所有的PCR循环,就可以得到所需要合成的DNA长片段。该方法尤其适合100～200碱基左右的长片段DNA的快速合成与克隆。     

PCR产物克隆方法的新进展

ＰＣＲ产物克隆方法的新进展陈尚武,马涧泉（中山医科大学生化教研室．广州）随着ＰＣＲ技术的发展和普及,克隆ＰＣＲ产物已广泛应用于分子生物学的各个领域。通常ＰＣＲ产物不具有粘端,只能进行平端连接的克隆,由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性...     

《PCR:临床诊断和研究》

《PCR:临床诊断和研究》(PCR:clinical diagnosties and research)由A.Rolfs等人,1992年斯普林格出版社出版,271页。该书有下列章节:1.PCR:原理及反应成分;2.最佳策略;3.PCR普通应用;4.影响PCR物质:抑制或强化;5.PCR:污染和虚假的解释结果;6.可经PCR检验的生物物质;7.用PCR从细胞和组织中离析DNA;8.用PCR从细胞和组织中离析RNA;9.逆转录/PCR;10.鉴别扩增PCR产物方法;11.限制片段分析;12.多种PCR;13.用PCR检测单个碱基变化;14.用PCR对基因组DNA进行非放射性、直接、固相测序;15.应用PCR分析未知顺序;16.PCR产物定量化;17.PCR克隆方法;18.用PCR进行定位诱变;19.原位聚合酶链反应;     

一种有效回收短片段PCR产物的方法

目的:为了有效地回收小于200bp的短片段PCR产物。方法:研究了在-20℃条件下,用无水乙醇和3mol/l醋酸钠共沉淀短片段的PCR产物的方法。结果和结论:用这种共沉淀PCR产物的方法,它能够有效地回收小于200bp以下的DNA片段,并且回收到的片段能够有效的进行酶切反应和T-载体连接反应。这种方法也能够回收酶切后的短DNA片段,并对后来的连接反应没有影响。这种共沉淀回收短片段DNA方法相对于其他方法来不仅具有可行性,而且有经济和操作简单的优点。     

单分子PCR产物错误率分析

碱基错配致使PCR扩增产物中存在突变序列.大量模板PCR扩增时突变序列所占的比例较低,对随后进行的PCR产物分析影响不大,但当对微量甚至单个模板DNA扩增时,情况则完全不同.对单分子PCR产物的错误率进行了理论分析,结果表明：根据实验目的和条件,选择忠实性不同的聚合酶是十分关键的.     

超嗜热古菌Thermococcus eurythermalis A501编码B家族DNA聚合酶的生化特性及PCR应用

DNA聚合酶广泛应用于PCR技术,在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。但目前商业化DNA聚合酶仍不能完全满足科研需要,有必要寻求高性能DNA聚合酶。文中克隆表达了超嗜热古菌（Thermococcus eurythermalis）A501来源的B家族DNA聚合酶基因（NCBI数据库基因登录号为TEU＿RS04875）、表征该重组蛋白的生化特性、评价了其PCR应用。将删除intein蛋白序列的DNA聚合酶（Teu-PolB）进行体外重组表达,经亲和层析和离子交换层析纯化获得Teu-PolB蛋白;利用5′端带荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定Teu-PolB的生化特性;以噬菌体λDNA基因组为模板,探究Teu-PolB的PCR应用。结果显示,Teu-PolB具有DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性,该酶在98℃下的半衰期约为2 h,热稳定性高。使用Teu-PolB进行PCR扩增,最适PCR缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,2.5 mmol/L MgCl₂,60 mmol/L KCl,10 mmol/L （NH<...     

应用T/A策略克隆乙肝病毒pC/C及C基因

以克隆乙型肝炎病毒pC/C及C基因为例,报道了在DNA重组中,当目的基因与载体末端不匹配时可采取的一新方法.用内切酶切取的基因片段为平端时,可在含dATP的反应体系中,用Taq酶的末端转移酶活性在其3′末端加上单个碱基(dA)的突出尾;基因片段为3′凹端时,可在含4种dNTP的体系中,利用Taq酶的聚合酶活性先将其末端补平,再经末端转移酶活性在其3′末端加dA尾;末端经此修饰的基因片段可亚克隆至T载体中,再克隆于其他表达载体中.