梭梭肌动蛋白基因HaACT1全长的克隆与表达分析

根据本实验已克隆得到的梭梭肌动蛋白基因Ha ACT1部分序列,通过5'RACE技术获得HaA CT1的cDNA全长序列。序列分析表明,该基因c DNA全长序列1 534 bp,其中5'UTR序列为75 bp,3'UTR序列为325 bp,开放阅读框序列为1 134 bp,编码376个氨基酸。该序列与Gen Bank中收录的其它植物Actin基因核苷酸序列的相似性均在84%以上,并且它们的氨基酸序列的相似性达95%以上,Gen Bank登录号为KM886609。根据得到的c DNA序列设计全长引物,进一步克隆了Ha ACT1的基因组DNA序列,由4个外显子和3个内含子组成。利用半定量和绝对荧光定量PCR对Ha ACT1的表达进行分析,发现该基因在梭梭的不同组织及各种非生物胁迫下均能稳定表达,适合作为梭梭中其它功能基因表达研究中的内参基因。     

大螟HSC70基因克隆及表达模式分析

【目的】近年来,大螟Sesamia inferens (Walker)对水稻的为害逐渐加重并成为水稻的重要害虫之一。随着全球气候变暖,大螟的分布区域也在逐渐向北延伸。HSP70家族作为分子伴侣参与生物生长发育并对外界刺激产生响应,对生物功能蛋白质的正确折叠及其转运有着重要意义。本研究旨在明确HSP70家族HSC70基因在大螟不同组织、不同发育阶段以及低温胁迫下的表达差异,初步探讨大螟对环境适应的分子机理。【方法】应用RT-PCR及RACE技术从大螟5龄幼虫中克隆得到HSC70基因;进行基因组验证,得到其基因组序列,分析内含子的位置及大小;应用实时定量PCR技术分析大螟HSC70基因的表达模式。【结果】大螟HSC70基因长2 160 bp,命名为Sihsc70（GenBank登录号：KJ639908）,开放阅读框长1 962 bp,编码653个氨基酸,推测分子量为71.6 kDa。其氨基酸序列中含有3个HSP70家族保守序列,在C-末端存在细胞质定位信号,说明大螟HSC70是细胞质热激蛋白家族成员。大螟HSC70基因组序列长度为3 522 bp（GenBank登录号：KJ639909）,含有2个内含子,长度分别为685 bp（位于编码区上游）和803 bp（位于编码区内）。在大螟5龄幼虫的不同组织中Sihsc70表达量差异不显著（P＞0.05）,其中在中肠、后肠和体壁中的表达量较高,在唾腺中的表达量最低;在大螟不同发育阶段中,Sihsc70的表达量在雌成虫最低,较高的3个阶段依次为卵、2龄幼虫和5龄幼虫,分别为雌成虫表达量的6.33,3.21和1.86倍;相对于对照组（27℃）,低温胁迫对大螟5龄幼虫HSC70基因表达的影响差异不显著（P＞0.05）。【结论】结果说明,大螟HSC70基因在不同发育阶段和幼虫不同组织中具有不同的表达水平,而低温胁迫不能诱导该基因大量表达。     

甜瓜CmERFIII-1转录因子基因cDNA的克隆与表达分析

根据甜瓜ERF亚家族成员聚类结果,选取第三亚群的Cm ERFIII-1(甜瓜基因组数据库登录号MELO3C005465)基因为研究对象,根据其c DNA序列设计基因特异引物,应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜果实的总RNA中克隆得到Cm ERFIII-1基因c DNA,序列长711 bp,编码236个氨基酸组成的多肽。序列比对及系统发育分析表明,Cm ERFIII-1 c DNA编码的蛋白质氨基酸序列与黄瓜中ERF亚家族两个成员的序列(Gen Bank登录号:XP_004143677.1、XP_004158119.1)亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甜瓜根、茎、叶和授粉后不同时期果实中均有不同程度表达,在叶片中表达量最高。     

一种新的昆虫热诱导型HSP70基因的克隆与表达分析

【目的】西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是一种重要的外来有害生物,已在我国多个省份发现危害,且有向南北两端继续扩张的趋势。HSP70是热激蛋白家族中最重要的一类成员,在昆虫温度耐受性中发挥重要的作用。本研究旨在明确不同性别的西花蓟马成虫在受到高低温胁迫时其HSP70家族的表达差异,进一步探讨西花蓟马对环境适应的分子机理,为其防控提供理论依据。【方法】首先,应用RT-PCR及RACE技术从西花蓟马中克隆得到HSP70基因;其次,对该基因组进行验证,得到基因组序列,并分析内含子的位置及大小;最后,通过实时定量PCR技术分析得到的西花蓟马HSP70的表达模式。【结果】本研究克隆得到的西花蓟马HSP70基因命名为Fohsp703(GenBank登录号:KY914546),该基因全长2106bp,开放阅读框2040bp,编码679个氨基酸,推测分子量为73.6ku。FoHSP703的氨基酸序列中含有3个HSP70家族签名序列,说明它是热激蛋白家族成员;但是,FoHSP703的蛋白序列以APAA结尾,而且多序列比对与系统发育分析均表明,FoHSP703不同于现在已鉴定出的其它昆虫的HSP70。基因组结构分析发现,Fohsp703不含有内含子,在高低温胁迫下能够被诱导并且显著表达,而且雌虫的表达量高于雄虫,分别在37℃和-12℃达到最大值。【结论】本研究的西花蓟马HSP70(FoHSP703)是一种新的昆虫热诱导型HSP70,在西花蓟马温度耐受性中起着重要的作用。     

烟草胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆及表达分析

采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,首次从烟草(Nicotiana tabacum)中克隆到1个胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)基因的c DNA序列,命名为Nt6PGDH(Gen Bank登录号:KM211534)。该基因c DNA全长1 932bp,开放阅读框1 455 bp,编码484个氨基酸,与番茄(Solanum lycopersicum)和马铃薯(Solanum tuberosum)的6PGDH氨基酸序列一致性最高,为95%。生物信息学分析表明,Nt6PGDH氨基酸序列不存在信号肽和转运肽,无跨膜结构域,定位于细胞质。对烟草不同发育时期Nt6PGDH基因的表达情况分析发现,Nt6PGDH基因在烟草旺长期根、茎、叶中的表达量均高于苗期,并且在同一发育时期,烟草根中表达量最强,茎次之,叶片最弱。     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-HSP60的克隆、序列分析及温度胁迫下的表达

【目的】马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种世界性检疫害虫,对温度胁迫具有极强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子机制,研究了热激蛋白HSP60在马铃薯甲虫温度胁迫应答过程中的作用。【方法】采用RT-PCR及RACE技术克隆马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因的cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR技术分析该基因在温度胁迫下的表达模式。【结果】克隆得到马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因,命名为Ld-HSP60(Gen Bank登录号:KC556801),其cDNA全长2 234 bp,开放阅读框(ORF)长1 731 bp,编码576个氨基酸,相对分子量约为61.27 kD,理论等电点为5.51,5'端非翻译区(UTR)长101 bp,3'UTR长402 bp。氨基酸序列中含有HSP60家族典型的特征序列。实时荧光定量PCR结果表明,低温胁迫(-10和0℃)下未检测到马铃薯甲虫雌雄成虫中Ld-HSP60的诱导表达;高温胁迫(38和44℃)诱导马铃薯甲虫雄成虫Ld-HSP60上调表达,随着胁迫温度的升高LdHSP60表达量呈现先升高后降低的趋势,38℃高温胁迫下表达量最高,胁迫时间越长Ld-HSP60表达量也越高。【结论】相比其他热激蛋白,HSP60对温度敏感性较低,推测HSP60可能在马铃薯甲虫雄成虫抵御高温胁迫中发挥作用。     

甘蔗SoNIN1基因结构及其内含子信息分析

根据前期克隆得到的So NIN1基因的全长c DNA和部分启动子序列设计引物,应用PCR技术从甘蔗叶片g DNA中克隆So NIN1基因,并利用生物信息学方法分析基因的结构。结果表明,So NIN1基因的DNA序列长4 938 bp,包含6个外显子和5个内含子,Gen Bank登录号KF563902。在该基因5'非翻译区存在一个268 bp内含子序列,同时5个内含子序列中含有与低温、干旱和激素等胁迫响应相关的作用元件,这些可能对So NIN1基因转录表达起调控作用。依据So NIN1蛋白聚类和外显子-内含子基因结构可以将植物NINs分为两类。     

大蜡螟气味受体基因Gmel/Orco的克隆与序列分析

为进一步研究大蜡螟嗅觉通讯分子机制和寻求新的大蜡螟防治技术,本研究克隆了大蜡螟Galleria mellonella L.的气味受体基因Gmel/Orco,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中已发表的鳞翅目昆虫非典型气味受体家族基因的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆至T载体并测序。克隆获得大蜡螟气味受体Orco的cDNA序列,命名为Gmel/Orco(GenBank登录号:KT020861),序列分析结果显示,Gmel/Orco开放阅读框长1425 bp,编码474个氨基酸,分子量为53.36 k D,等电点为8.44,序列中有7个跨膜区,N-端在细胞膜内,C-端在细胞膜外。通过在Gen Bank中进行序列的同源性比较,该基因与已公布的鳞翅目螟蛾科、夜蛾科昆虫的非典型气味受体基因序列有较高的同源性。克隆所获得的基因属于非典型气味受体家族基因。     

朱砂叶螨几丁质合成酶基因1全长cDNA的克隆与表达分析

【目的】克隆朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质合成过程中的关键酶几丁质合成酶基因,并检测该基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【方法】本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及c DNA末端快速扩增(RACE)技术首次克隆获得朱砂叶螨几丁质合成酶基因1的全长c DNA序列(命名为Tc CHS1,Gen Bank登录号为KM242062),并使用实时荧光定量PCR技术首次检测了Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【结果】朱砂叶螨Tc CHS1基因的c DNA全长为4 881 bp,包括198 bp的5'非翻译区(5'-UTR),4 425 bp的开放阅读框(ORF),258 bp的3'非翻译区(3'-UTR),开放阅读框编码1 474个氨基酸,预测其蛋白质分子质量约为168.35 ku,理论等电点为6.26。其包含EDR和QRRRW这2个几丁质合成酶基因的标签序列。氨基酸序列同源性分析结果表明:Tc CHS1与其他昆虫该基因编码蛋白的氨基酸序列相似度在50%左右,与二斑叶螨Tetranychus urticae的氨基酸相似度最高(98%),与西方盲走螨Metaseiulus occidentalis的相似度为55%。分子系统进化的结果也表明Tc CHS1与其他昆虫的CHS1聚在一起,并且和二斑叶螨具有最近的亲缘关系。荧光定量分析表明Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育的不同阶段(卵、幼螨、第1若螨、第2若螨、雌成螨和雄成螨)均有表达,在卵和雌成螨中的表达量较高,在第2若螨的表达量最低。【结论】Tc CHS1基因可能在朱砂叶螨生长发育过程中具有重要作用。     

离腹寡毛果实蝇性别决定基因transformer 2及其在昆虫中的进化

对离腹寡毛果实蝇性别决定基因transformer 2(tra-2)进行多角度的进化分析,为研究离腹寡毛果实蝇性别决定分子机制奠定基础。通过PCR结合RACE技术克隆瓜实蝇Bactrocera cucurbitae同源transformer 2基因的c DNA全长和内含子序列,并对该基因进行序列和进化分析。克隆得到瓜实蝇tra-2基因c DNA全长1467 bp,开放读码框753 bp,编码250个氨基酸残基,Gen Bank登录号为KR056217。瓜实蝇tra-2基因与其他6种离腹寡毛果实蝇的基因结构相似,均包含8个外显子和7个内含子。7种离腹寡毛果实蝇与实蝇科的地中海实蝇和按实蝇、蝇科的家蝇和丽蝇科的铜绿蝇为单一起源,而果蝇Tra-2表现出明显的分异。分子进化分析结果表明tra-2基因核苷酸变异主要来源于同义变异,接受净化选择压力。本研究明确了瓜实蝇tra-2的c DNA和基因组DNA结构特征,离腹寡毛果实蝇tra-2蛋白高度保守,主要接受净化选择压力。