随机扩增多态性DNA技术对结核分支杆菌菌株鉴别及其耐药相关性分析

用引物G1和L1扩增的16S-23SrDNA间隔区作为模板DNA,再用引物AP50进行随机扩增多态性DNA（Random Amplified PolymorphicDNA,RAPD)分棉线AP50扩增出的各菌株DNA片段,用1.2%的琼脂糖凝胶电泳EB染色,可获得1或2个大小不同的DNA片段（390-1031bp)。各株间差异明显,结果表明,不同菌株有不同的DNA多态性,药物敏感株与耐药株之间多态性差异明显,耐药株中耐药谱相似或相同的菌株间其多态性也相似,RAPD有助于简便,快速,有效地了解菌株间的克隆相关性及耐药性传播。     

DNA片段的高效克隆

用Taq酶进行PCR扩增时,其PCR产物的3末端有一个附加的A碱基。因此,目前在克隆PCR产物时一般使用T－VCctor。但T—Vector的价格比较昂贵,而使用本试剂盒也可在短时间内使PCR产物与平滑末端载体进行高效连接。PCR产物与平滑末端的载体连接时,有必要除去3廉端的附加碱基,并使其5末端磷酸化。使用TaKaRaBKLKit（BllllltillgKillstiollLigstiollKit）可使这一连串的反应在短时间内完成。PCR产物的末端平滑化与磷酸化反应在一个反应体系内同时进行,一次反应后便可得到能够用于连接的DNA片段。用于连接反应的PCR产物无需进…     

结核分支杆菌耐链霉素分子机制的研究进展

链霉素（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ,ＳＭ）是一线抗结核药物,本文概要地介绍了结核分支杆菌耐链霉素的分子机制。最近的研究认为大多数结核分支杆菌分离株耐ＳＭ是由于核糖体蛋白Ｓ１２编码基因（ｒｐｓＬ）和（或）１６ＳｒＲＮＡ编码基因（ｒｒｓ）突变所致,少数菌株的耐药机制尚需进一步研究     

单纯疱疹病毒2型特异性DNA片段的克隆和鉴定

用核酸限制性内切酶BamHI对单纯疱疹病毒2型(HSV—2)的DNA进行酶解,回收位于基因组中的反向重复序列区的Bam HIG片段,然后将其克隆在载体质粒PUC 8的Bam HI切点上,进一步用核酸限制性内切酶Eco RI和KPNI对这一重组质粒联合酶解,移去EcoRI—KPNI小片段,经末端修饰后,将其连接得到新的重组质粒pRC102,它含有一小段HSV—2的DNA序列。以此质粒为探针,分别与HSV—1、HSV—2及细胞DNA进行斑点杂交;与HSV—1和HSV—2酶解后的DNA片段进行Southern转印系交。两组实验结果显示,pRC102质粒DNA只与HSV—2 DNA特异性杂交,其HSV—2的型特异性良好。     

细胞壁缺陷结核分支杆菌致细胞病变作用的观察

目的：探讨细胞壁缺陷结核分支杆菌的致细胞病变作用。方法：用利福平诱导结核分支杆菌形成稳定L型后感染Vero细胞,直接在显微镜下和抗酸染色观察细胞病变情况以及结核分支杆菌同宿主细胞的关系。结果：Vero细胞受结核分支杆菌L型感染72h后形成空泡、变圆、脱落和裂解,结核分支杆菌稳定L型细胞粘附或侵入细胞内。结论：细胞壁缺陷结核分支杆菌仍然能够引起Vero细胞发生病变但致细胞病变的作用较其亲代细菌型明显减弱,L型能够粘附于宿主细胞表面或进入宿主细胞内生长繁殖,引起缓慢的细胞病变。     

利用甲基化特异性引物高通量检测DNA甲基化

建立一种基于甲基化特异性引物和SAGE技术的高通量DNA甲基化定量检测新方法（MSP-SAGE）,首先利用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行处理,使未甲基化的C转变为U,而甲基化的CpG不变.将处理和未处理的DNA双链变性后用随机引物PNNNNCG对存在含有CG的单链进行延伸,而无甲基化CG的单链处则不能延伸;将差异延伸的单链序列和频次信息经过系列分子操作后,引入PCR扩增模板;对中间带有未知序列的PCR扩增产物进行串连克隆测序.将来自于未处理组和处理组的某一CpG位点的序列出现的次数定义为［Tags］A和［Tags］B,将标准系列的实际甲基化水平和［Tags］B/［Tags］A之间建立线性回归方程.根据每一CpG位点的［Tags］B/［Tags］A比值可反推该位点的甲基化水平.MSP-SAGE具有良好的线性,基于标准系列的［Tags］B/［Tags］A与其实际甲基化水平的标准曲线方程为y＝1.455x（R²＝0.984,P<0.01）.MSP-SAGE的回收率在95%到110%之间,精确度位于4.2％和10.5%,检测限在3％左右,单次检测通量可达24个CpG位点.MSP-SAGE是一种很有应用前途的高通量DNA甲基化定量检测方法.     

扩增未知序列DNA片段的PCR技术研究进展

1985年,Mullis等人发明了PCR技术,短短十余年间,这一技术得到迅速发展和应用,已由扩增已知基因发展到扩增未知基因,本文旨在介绍利用PCR技术扩增未知序列DNA片段的最新进展及这些技术在基因克隆研究中的应用。     

一个新的泥鳅雄性特异DNA片段（简报）

世界上现存鱼类多达24000余种．是脊椎动物中分布最广,种类最多的类群．具有多种多样的生物学特性和重大的经济价值。与高等脊椎动物相比．其性别决定具有多样性和可塑性。大多数鱼类的性别决定机制很原始。性染色体的分化处于萌芽状态。在已进行细胞遗传学研究的1700多种鱼类中．大约有176种（占10．4％）发现有明显的异型性染色体。     

一种有效回收小分子DNA片段的方法

介绍了一种有效回收小于200bp DNA片段的方法。用改进的冻融-离心回收法对155bp的DNA片段进行回收,并且与常规冻融-离心回收、TaKaRa回收试剂盒的结果做对比,用琼脂糖凝胶电泳检测回收结果,紫外吸收法定量分析。结果证明:改进的方法是一种经济、方便、可靠的回收小分子DNA片段的方法。     

人结核分枝杆菌特异性核酸探针制备及结核病PCR检测技术的初步临床应用

采用人结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis TB)染色体DNA为模板,选择位于插入片段IS6110中884～865和568～588碱基对处的两个片段为引物,扩增出317bp的特异性片段．将其克隆进pUCl9载体。酶切图谱分析和DNA序列测定证实为目的片段。该片段经DIG标记,分别与11种分枝杆菌DNA进行Southern杂交,结果证明只与人型复合分枝杆菌发生杂交反应。利用该对引物建立的PcR检测拄术对74份结核病痰液标本进行检测,并与临床细菌快速培养结果相比较,发现48份临床阳性均为PcR阳性,在26份临床阴性标本中亦发现11份PCR检测阳性。将标本PCR产物与克隆探针进行杂交,显示两者结果完全一致。说明PCR检测体系结果可靠,其灵敏度明显高于目前临床所采用的方法,可作为一种常规技术用于结核病的临床检测。     

恶性肿瘤组织中结核杆菌DNA的检测

目的　探讨结核杆菌感染与恶性肿瘤的关系。方法　采用多聚酶链反应（ＰＣＲ） 技术检测两种恶性肿瘤组织中结核杆菌ＤＮＡ（ＴＢ－ ＤＮＡ） 。结果４１ 例恶性肿瘤组织中检出ＴＢ－ ＤＮＡ 阳性患者８ 例,占１９．５ ％ ,且ＴＢ－ＤＮＡ 阳性患者肿瘤发病部位基本与结核病的好发部位一致。结论 结核杆菌感染可能与一些恶性肿瘤存在特殊相关性。     

应用PCR技术检测结核分枝杆菌的临床分析

采用聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｎｓｅ Ｃｈｉａｎ Ｒｅａｔｉｏｎ,即ＰＣＲ）技术检测结核分枝杆菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ,一年多来共检测了１００例结核（肺、肾结核）患者的痰和尿液标本,结果ＰＣＲ检出阳性率为８１％,对照用储菌涂片抗酸染色法,阳性率为５８％,用常规培养法阳性率为２０％。而对５０例非结核患者的痰和尿液标本的检测,ＰＣＲ法仍有６％的阳性率,而用涂片或常规培     

PCR法快速检测临床标本中结核杆菌DNA

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）快速检测临床标本（脑脊液、胸水、腹水、血、痰液）中的结核杆菌ＤＮＡ,特异性扩增片段１２３ｂｐ,为结核杆菌的特异性重复序列ＩＳ６１１０部分基因。ＰＣＲ检测人型结核杆菌的敏感性达１０ｆｇＤＮＡ。临床标本的ＰＣＲ检测阳性率（２３．３％）明显高于抗酸染色涂片（２．９％）和细菌培养（５．７％）的阳性率（Ｐ〈０．０５）。通过设立对照系统及对扩增产物酶切分析,表明该法无假阴性结果（特异     

Detection of Mycobacterium immunogenum by real-time quantitative Taqman PCR

A quantitative real-time 5′-nuclease (Taqman) PCR technique was developed to specifically detect Mycobacterium immunogenum. rpoB-specific primers and Taqman probe were evaluated for detection of M. immunogenum DNA extracted from pure cultures and from industrial metal working fluids (MWFs). Specificity was confirmed and the sensitivity of detection of M. immunogenum genomic DNA was shown to be approximately 9 fg (2 cell equivalents). When tested on industrial metal working fluids from the UK and USA from which no M. immunogenum CFU were recovered, the assay detected between 3.4 × 10¹ and 1.9 × 10⁴ cell equivalents (CE) per ml, and increased the detection rate over culture to 37.5% (12 of 32 samples). This assay provides a specific, sensitive and rapid method for the detection of M. immunogenum and is applicable within industry for the early detection of this human pathogen and to the possible prevention of hypersensitivity pneumonitis (HP) in workers.     

新型Taq Man-MGB探针在结核分枝杆菌实时PCR检测中的应用

为建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的结核分枝杆菌DNA定性定量检测方法 ,以TaqMan探针技术为基础 ,运用TaqMan MGB探针 ,实时检测临床标本中的结核分枝杆菌DNA .用来自临床标本的DNA及克隆于载体的IS6 1 1 0序列检测所建立方法的有效性 .结果显示 ,所建立方法的最低检测限度为 1个基因拷贝 反应 ,在每反应 1 0 0 ～ 1 0 8拷贝范围内 ,Ct 值同DNA量的对数呈线性关系 .同一模板不同时间或同一时间不同管内扩增 ,所得Ct 值恒定 .用该方法检测 37例结核分枝杆菌培养阳性的痰液标本 ,敏感度为 1 0 0 % ;用该方法检测 1 6例TB系列阴性参考品 ,特异性为1 0 0 % .结果表明 ,所建立的方法是用于结核分枝杆菌定性定量检测较理想的方法     

Tuberculosis patients co-infected with Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis in an urban area of Brazil

In this cross-sectional study, mycobacteria specimens from 189 tuberculosis (TB) patients living in an urban area in Brazil were characterised from 2008-2010 using phenotypic and molecular speciation methods (pncA gene and oxyR pseudogene analysis). Of these samples, 174 isolates simultaneously grew on Löwenstein-Jensen (LJ) and Stonebrink (SB)-containing media and presented phenotypic and molecular profiles of Mycobacterium tuberculosis, whereas 12 had molecular profiles of M. tuberculosis based on the DNA analysis of formalin-fixed paraffin wax-embedded tissue samples (paraffin blocks). One patient produced two sputum isolates, the first of which simultaneously grew on LJ and SB media and presented phenotypic and molecular profiles of M. tuberculosis, and the second of which only grew on SB media and presented phenotypic profiles of Mycobacterium bovis. One patient provided a bronchial lavage isolate, which simultaneously grew on LJ and SB media and presented phenotypic and molecular profiles of M. tuberculosis, but had molecular profiles of M. bovis from paraffin block DNA analysis, and one sample had molecular profiles of M. tuberculosis and M. bovis identified from two distinct paraffin blocks. Moreover, we found a low prevalence (1.6%) of M. bovis among these isolates, which suggests that local health service procedures likely underestimate its real frequency and that it deserves more attention from public health officials.     

结核分枝杆菌蛋白抗原的研究进展

结核病当今世界人类致死的主要疾病之一,早期诊断发现病人、选择敏感的抗结核药物进行有效治疗是控制结核病的关键。而临床上对结核病患者检出率低,漏诊率和误诊率高,结果导致结核耐药的情况越来越严重。简便、快速、准确的免疫学检测方法在诊断结核病中起到了重要的作用。本文对用于免疫学检测的蛋白抗原作一综述。     

荧光定量PCR检测结核分枝杆菌Meta分析

目的系统评价荧光定量PCR(FQ-PCR)方法检测结核分枝杆菌的效果。方法按照系统评价的要求检索CBM、VIP、CNKI以及万方数据库等,获得20篇符合纳入标准的文献,对其进行Meta分析,并评价Meta分析结果的稳定性和发表偏倚。结果 FQ-PCR对照涂片染色、培养鉴定以及总数据的异质性检验P0.00001,采用随机效应模型进行Meta分析,其余的采用固定效应模型分析。FQ-PCR与涂片染色、培养鉴定、抗体检测等的总体效应Z值分别为7.76、5.00和7.34,P值均小于0.00001,差异具有统计学意义。总数据分析结果的合并OR=2.78,95%CI为1.93-4.01,总体效应检验,Z=5.49,P0.00001,差异具有统计学意义,固定效应模型OR值和95%CI(2.52[2.35-2.70])与随机效应模型比较接近,剔除小样本报道后的合并OR=2.93,95%CI为1.98-4.31,与剔除前的结果也比较接近。结论从现有的临床证据来看,FQ-PCR是检测结核分枝杆菌的有效方法,可推广应用与临床结核病辅助检测。     

A Study of Unusual Pacemaker Infection by Mycobacterium Tuberculosis in Indian Patients

Background

The expanding clinical indications of cardiac rhythm management have led to an increased use of pacemaker implantation which is associated with increased incidence of pacemaker infections. Staphylococcus aureus and epidermidis account for the vast majority of pacemaker infections. Pacemaker infection due to Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) is very rare, only few cases having been reported till date.

Methods

We describe here a study of three patients of pacemaker pocket infection with M. tuberculosis.

Conclusion

The possibility of mycobacterial pacemaker infection should always be kept in mind in patients with delayed pacemaker infection.