γ- 分泌酶抑制剂对糖基化终产物作用下心肌微血管 内皮细胞的影响

目的:探讨Notch信号特异性阻断剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对AGEs作用下的心肌微血管内皮细胞的增殖、迁移、管样结构的影响。方法:SD大鼠心肌微血管内皮细胞体外分离培养后,以不同浓度DAPT(0.25、0.5、1.0、5.0、10μmol/L)干预200mg/LAGEs作用下的CMECs24h,或者与DAPT(5μmol/L)孵育不同时间(24h、48h、72h、96h、120h),采用MTT比色法检测细胞的增值能力;用Transwell法检测细胞的迁移能力;用毛细血管管样结构形成实验检测DAPT对血管新生的影响。结果:DAPT显著抑制AGEs作用下的心肌微血管内皮细胞的存活,同时浓度越高、时间越长,其抑制效果越明显。结论:DAPT通过阻断Notch信号通路,能抑制AGEs作用下的心肌微血管内皮细胞的增殖及血管新生,促进细胞凋亡。     

miR-939-5p对糖尿病视性网膜病变和视网膜微血管内皮细胞的调控作用

摘要 目的：探究miR-939-5p对糖尿病性视网膜病变和人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）的调控作用。方法：将miR-939-5p模拟物（miR-939-5p-mimic）或miR-939-5p抑制剂（miR-939-5p-inhibitor）转染到HRMEC中,并将细胞用高糖（HG组,25 mM）或低糖（LG组,5 mM）处理24 h。通过细胞计数试剂盒8（CCK-8）来检测细胞活力,EdU法检测细胞DNA的复制能力,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,使用双荧光素酶试剂盒E2920验证miR-939-5p与NOS2 3''-UTR之间的结合关系。对大鼠腹腔注射65 mg/kg的链脲佐菌素（STZ）诱导DR模型,通过RT-qPCR检测miR-939-5p水平,Western Blot检测诱导型一氧化氮合酶（NOS2）水平,苏木精伊红（HE）染色检查大鼠视网膜形态,免疫组织化学染色检测视网膜Claudin-5和Occludin的表达,伊文思蓝染色检测大鼠血视网膜屏障（BRB）通透性,ELISA法检测大鼠房水中白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。结果：与LG组的HRMEC相比,HG组的miR-939-5p显著降低,而NOS2蛋白水平显著升高（P<0.05）。荧光素酶活性测定显示,与NC-mimic组相比,miR-939-5p-mimic与pGL3-NOS2-WT共转染组的荧光素酶活性显著降低（P<0.05）。与HG+NC-mimic组相比,HG+miR-939-5p-mimic组的miR-939-5p水平和细胞活力显著升高,而NOS2蛋白水平和细胞凋亡率显著降低（P<0.05）。与DR组相比,miR-939-5p-Agomir组大鼠视网膜组织病变减轻,Claudin-5和Occludin的表达水平明显升高,伊文思蓝浓度显著降低（P<0.05）;与DR组相比,miR-939-5p-Agomir组大鼠房水中IL-1β和TNF-α的水平均显著降低（P<0.05）。结论：在高糖培养的HRMEC中和DR大鼠视网膜中,miR-939-5p为低表达模式,NOS2为高表达模式。上调miR-939-5p通过靶向抑制NOS2对DR大鼠视网膜和HRMEC提供保护作用。     

CCL2促进大鼠原代心肌微血管内皮细胞血管形成

本文旨在探讨趋化因子CCL2在成年大鼠原代心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cell, CMEC)血管形成中的作用。分离原代大鼠CMEC,用CD31和VIII因子免疫染色鉴定,观察不同时间点基质胶(Matrigel)上CMEC血管形成情况,用real-time RT-PCR和ELISA分别检测在血管形成过程中CCL2的表达和分泌情况。结果显示:(1)大鼠原代CMEC分离成功,该细胞具有形成血管能力,成网数和节点数在Matrigel处理后4 h显著增加;(2) CMEC血管形成过程中CCL2和CCR2的表达量显著上调,并且CCL2的分泌量明显增加;(3) CCL2阻断抗体和CCR2拮抗剂均可显著降低CMEC血管形成能力。上述结果提示,大鼠原代CMEC在血管形成过程中可分泌CCL2,并且CCL2-CCR2信号通路促进了CMEC血管形成。     

组胺对肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响

本实验研究了组胺对原代培养的肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶(nitric oxidCsynthase,NOS)基因表达的影响及分子机制。采用RT-PCR和免疫印迹技术分别检测mRNA和蛋白质的表达水平,用荧光素酶报告基因实验检测eNOS基因转录起始点上游长1.6-kb的启动子活性,用硝酸还原酶法检测NO的产量。结果发现,组胺增强eNOS表达,呈浓度和时间依赖性,10μmol/L组胺处理肺动脉内皮细胞24h可使eNOS mRNA和蛋白质的表达达到高峰,eNOS mRNA水平为正常对照组的160.8±12.2%(P<0.05),蛋白质水平为正常对照组的136.2±11.2%(P<0.05)。特异性CaMK Ⅱ抑制剂KN-93可抑制组胺的这一效应,表明组胺可通过激活CaMK Ⅱ增强肺动脉内皮细胞eNOS基因的表达。报告基因实验表明,10μmol/L组胺处理24h后肺动脉内皮细胞eNOS基因启动子的活性增强,为正常对照组的148.2±33.7%(P<0.05)。组胺可使肺动脉内皮细胞产生NO增加。这些结果表明组胺在转录水平增强肺动脉内皮细胞eNOS基因的表达,并使细胞产生NO增加,这可能是组胺调节肺血管张力的机制之一。CaMK Ⅱ可能是组胺增强肺动脉内皮细胞eNOS基因表达的途径之一。     

低频脉冲磁场对大鼠心肌微血管内皮细胞迁移和NO分泌能力的影响

目的:研究在固定时间和频率下,矩形波形低频脉冲磁场(LF-PMF)对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)迁移和NO分泌能力的影响。方法:实验分为4组(对照组,1.0MT组,1.4MT组,1.8MT组)。对照组不加磁场干预,其余各组分别在频率为15Hz,磁场强度分别为1.0MT、1.4MT和1.8MT,时间为4h/d,连续照射3d的条件下,用三角波形作用离体培养的大鼠CMECs。利用transwell检测细胞迁移能力,硝酸还原酶法检测CMECs培养液中NO含量的变化。结果:1.0MT组,1.4MT组和1.8MT组LF-PMF迁移能力与对照组相比均有不同程度提高[(24.40±5.12)(个/视野)vs(22.00±3.87)(个/视野),P<0.05;(31.40±3.81)(个/视野)vs(22.00±3.87)(个/视野),P<0.05;(37.40±4.01)(个/视野)vs(22.00±3.87)(个/视野),P<0.01]。1.0MT组,1.4MT组和1.8MT组LF-PMF的NO分泌能力与对照组相比均有提高[(25.26±1.06)(μmol/L)vs(19.18±2.88)(μmol/L),P<0...     

剪切力对脑微血管内皮细胞骨架蛋白的影响

利用自行研制的细胞流动小室对大鼠脑微血管内皮细胞在剪切力作用下细胞骨架蛋白的结构改变进行了初步研究,结果提示脑微血管内皮细胞在剪切力作用下,细胞形态学发生明显改变,细胞间隙增大、皱缩、脱落,细胞骨架蛋白的结构也有类似的变化,骨架蛋白沿流动方向重新排列,微丝中Ｆ－Ａｃｔｉｎ的数量增加、变粗。这些改变的直接后果是内皮细胞通透性的增加。该工作为进一步开展剪切力对微血管内皮细胞功能、代谢等方面的影响提供了实验数据     

波动性高胰岛素对内皮细胞一氧化氮合酶信使核糖核酸的影响

目的:对比研究波动性高浓度胰岛素与恒定性高浓度胰岛素对体外培养的人脐静脉内皮细胞eNOS mRNA转录水平的影响,从而探究波动性高浓度胰岛素血症在糖尿病动脉粥样硬化形成中的致病机制.方法:采用体外培养的人脐静脉内皮细胞为对象,研究波动性高胰岛素对血管内皮细胞eNOS mRNA转录水平的影响.实验分为4组,即对照组(不含胰岛素)、正常浓度胰岛素组(含胰岛素1 nmol/L)、恒定性高胰岛素组(含胰岛素100 nmol/L)与波动性高胰岛素组(含胰岛素1 nmol/L及含胰岛素100nmol/L两种条件培养液,每8小时轮换一次),每间隔8小时更换新鲜条件培养液一次,一共作用72小时.应用应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮细胞eNOS基因mRNA转录水平.结果:经不同浓度的胰岛素作用72小时后,正常浓度组、恒定性高胰岛素组与波动性高胰岛素组内皮细胞eNOS mRNA转录水平均不同程度上调,分别为对照组的2.25倍(p<0.001)、6.00倍(p<0.001)和6.88倍(p<0.001),其中以波动性高胰岛素组上调尤为明显,且明显高于恒定性高胰岛素组(p<0.05).结论:波动性高胰岛素相对于恒定性高胰岛素能增强人脐静脉内皮细胞eNOS mRNA的转录.     

尾加压素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞iNOS表达的影响

目的：探讨尾加压素Ⅱ（UⅡ）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）诱导型一氧化氮舍酶（iNOS）mRNA表达及一氧化氮（NO）合成的影响。方法：用不同浓度的UⅡ（10^-9～10^-7mol／L）干预体外培养的HUVEC,用硝酸酶还原法及比色法检测细胞培养上清液中NO的水平及iNOS的活性,半定量逆转录一聚合酶联反应（RT—PCR）法检测内皮细胞iNOSmRNA的表达。结果：UⅡ干预24h后,与空白对照组相比,UⅡ呈浓度依赖性显著刺激NO的合成（P〈0．05）,增加iNOS的活性（P〈0．05）,上调iNOSmRNA的表达（P〈0．05）。结论：UⅡ能刺激HUVEC的iN—OSmRNA的表达和NO的合成,提示UⅡ可能通过激活iNOS／NO途径而发挥舒张血管的作用。     

不同尿素氮水平尿毒血清对人脐静脉内皮细胞的影响

目的:观察不同BUN水平尿毒血清对体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的影响,并探讨尿毒症患者动脉粥样硬化发病的可能机制.方法:比色法测定HUVEC上清液NO、MDA的水平;免疫细胞化学法测定胞浆iNOS表达;酶联免疫吸附法(ELISA)测定上清液iNOS蛋白水平.结果:尿毒血清各组均可上调HUVEC的MDA生成,且以BUN≥50 mmol/L的尿毒血清组对MDA上调最明显(P<0.01);尿毒血清各组可下调HUVEC的NO生成,呈BUN浓度依赖性关系(P<0.01);尿毒血清各组可激活HUVEC的iNOS,诱导细胞生成大量NO,但随着BUN水平的升高,NO、iNOS呈下降趋势,BUN≥50 mmol/L尿毒血清组下降显著(P<0.01).结论:尿毒血清对HUVEC有毒性作用,呈BUN浓度依赖性关系,尤其是BUN≥50 mmol/L时,细胞损伤更为加重.     

线粒体分裂抑制剂Mdivi-1对大鼠心肌微血管内皮细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨Mdivi-1对缺血再灌注损伤后大鼠心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)的保护作用.方法:分离培养大鼠CMECs,建立缺血再灌注(SI/R)模型,随机分为对照组、SI/R组、和SI/R+Mdivi-1组.采用MTT法检测细胞增殖能力;Transwell法检测细胞迁移能力;Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测CMECs凋亡率;western blot法检测各组细胞Drp1,Fis1水平;活性氧检测试剂盒测细胞ROS水平.结果:与对照组比较,SI/R组和SI/R+Mdivi-1组细胞增殖和迁移能力明显降低,凋亡明显增加,Drp1,Fis1表达增高,ROS水平明显升高,结果具有统计学意义(P＜0.05);与SI/R组比较,SI/R+Mdivi-1组细胞增殖和迁移能力明显增加,凋亡明显降低,ROS水平明显降低,结果具有统计学意义(P＜0.05),而Drp1,Fis1表达则无明显改变.结论:Mdivi-1可减轻CMECs的缺血再灌注损伤,这种保护作用可能是通过抗氧化应激来实现的.     

Trx通过Sirt3-P53通路促进自噬并改善高糖诱发的CMECs损伤

目的:明确硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)通过自噬调节对大鼠心脏微血管内皮细胞损伤的保护作用及相关机制。方法:分离成年大鼠心脏微血管内皮细胞并分为:(1)正常对照组;(2)高糖组;(3)高糖+Trx组;(4)高糖+Trx+Ad-sh Sirt3组;(5)高糖+Trx+Ad-sh P53组;(6)高糖+DMSO空载组。通过In Vitro Vascular Permeability Assay Kit检测单层心脏微血管内皮细胞通透性,TUNEL染色检测细胞凋亡,Western blot法检测Sirt3、P53、Atg5、LC3BI/II等相关自噬相关信号通路关键蛋白的表达水平。结果:与正常对照组相比,高糖引起单层心脏微血管内皮细胞通透功能损伤,增加细胞凋亡,抑制自噬,且Sirt3、Atg5、LC3BI/II表达下降而P53表达上升;给予Trx可以上调Sirt3、Atg5、LC3BI/II蛋白表达水平,抑制P53表达,并显著减轻上述高糖引起的细胞损伤;但是,分别干扰Sirt3和P53表达后,Trx的作用明显减弱。结论:Trx通过Sirt3-P53信号通路促进心脏微血管内皮细胞自噬,降低细胞凋亡,改善高糖诱发的大鼠心脏微血管内皮细胞损伤。     

运用植块法培养脑微血管内皮细胞

探讨简易可行的脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs培)养方法,为研究BMECs细胞在脑血管疾病中的重要作用提供技术支持。分离出生后1~7天内的SD乳鼠大脑皮质区,植块法培养BMECs细胞。用倒置显微镜观察BMECs细胞的形态以及从皮质块迁出的过程;MTT比色法检测BMECs细胞的生长曲线;采用免疫组化染色检测VIII因子相关抗原和CD34抗原,以鉴定内皮细胞。结果发现,大脑皮质块植块法培养的大鼠BMECs细胞呈单层贴壁生长,细胞形态以长梭形、多角形三角形、四边形为主,呈典型的“铺路石”样征象,经鉴定为内皮细胞,第三代纯度达95%以上。提示该方法具有经济、简便、要求条件不高,易于纯化的优点,可作为大鼠BMECs细胞体外培养的良好模型。     

AIBP基因表达下调促进心肌微血管内皮细胞血管新生

目的:探讨阻断载脂蛋白A-I结合蛋白(AIBP)的表达后对心肌微血管内皮细胞(CMECs)血管新生的作用。方法:消化法分离SD大鼠CMECs,通过慢病毒介导的siRNA转染CMECs下调AIBP基因表达,并设立空白对照组及阴性转染组。RT-PCR法检测AIBP基因的表达;CCK-8比色法检测细胞增殖;Transwell小室评价细胞迁移能力;成管实验评价血管新生能力。结果:RT-PCR结果显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs中AIBP表达显著降低(P0.01);CCK-8结果显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs增值水平显著增高(P0.01);Transwell法结果显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs迁移能力显著增高(P0.01);成管实验显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs成管能力显著增高(P0.01)。结论:抑制AIBP表达可以明显促进CMECs增殖,促进其迁移和成管。     

大鼠脑微血管内皮细胞培养及其药物转运体Oatp2和P-gp的表达

贴块法培养脑微血管内皮细胞(BMECs),倒置显微镜动态观察细胞生长及形态,Ⅷ因子相关抗原、CD34免疫细胞化学联合鉴定细胞并确定纯度。免疫细胞化学和Western印迹法检测药物转运体有机阴离子转运多肽亚型2(Oatp2)及P-糖蛋白(P-gp)在培养内皮细胞上的表达。结果显示,获得的BMECs呈多角形或铺路石形,单层贴壁生长;培养细胞Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学、CD34免疫荧光染色均为阳性,细胞纯度90%;培养细胞有Oatp2及P-gp表达,且二者均主要表达于BMECs细胞膜。提示贴块法可获得原代培养BMECs,方法简便易行,细胞纯度较高。原代培养的BMECs上有药物转运体Oatp2及P-gp的表达,为血脑屏障上药物转运体的体外研究提供了可能途径。     

辛伐他汀通过上调sirt1抵抗氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞衰老

目的:探讨辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞衰老的作用及其可能机制.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,给予不同浓度(0、25、50、100 μg/ml)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)培养24小时,观察细胞β-半乳糖苷酶染色及SIRT1蛋白表达的变化;给予不同浓度辛伐他汀(1、5、10 μmol/L)预处理内皮细胞l小时后加入100μg/ml ox-LDL培养人脐静脉内皮细胞23小时,检测细胞β-半乳糖苷酶染色及SIRT1蛋白表达的变化.结果:随着ox-LDL作用浓度的增加,细胞内β-半乳糖苷酶染色的阳性细胞百分率逐渐升高,与空白对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05),在ox-LDL(100 μg/mll)组达到最高,显著高于ox-LDL(25 μg/ml)组(P＜0.001).而不同浓度ox-LDL处理的细胞内SIRT1的表达较空白对照组相比逐渐下降,ox-LDL(50、100 μg/ml)组SIRT1的表达显著低于ox-LDL(25 μg/ml)组(P＜0.05).10 μmol/L辛伐他汀预处理能明显降低100μg/ml ox-LDL处理的内皮细胞内β-半乳糖苷酶染色的阳性细胞百分率(P＜0.001),并显著抑制细胞内SIRT1的蛋白表达(P＜0.001).结论:辛伐他汀可以抵抗ox-LDL诱导的内皮细胞衰老,可能与增加内皮细胞内SIRT1的表达有关.     

miR-29a通过调控PTEN表达对脂多糖诱导人肺微血管内皮细胞损伤的保护作用研究*

目的:探讨miR-29a在脂多糖(LPS)诱导人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)损伤中的作用及机制。方法:构建LPS损伤HPMVECs模型。RT-qPCR检测miR-29a表达变化;试剂盒测乳酸脱氢酶(LDH)释放量;MTT和流式细胞术分别检测细胞存活率及凋亡率;Western blot测蛋白质表达水平;Microcosm、starBase、Pictar、TargetScan软件预测 miR-29a的可能靶基因,双萤光素酶实验验证miR-29a和PTEN的靶向关系。结果:使用LPS处理HPMVECs,显著降低细胞中miR-29a的表达和细胞存活率,诱导LDH释放量和HPMVECs凋亡率增加,上调细胞中PTEN、Bim蛋白表达,下调p-Akt/Akt、p-FOXO3a/FOXO3a表达 (P<0.05);过表达miR-29a逆转LPS对HPMVECs的损伤作用。萤光素酶报告基因实验证实miR-29a 靶向PTEN,转染miR-29a mimics显著下调PTEN蛋白表达,转染miR-29a inhibitors明显上调PTEN蛋白表达 (P<0.05),但PTEN mRNA表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:过表达miR-29a可能通过抑制PTEN蛋白的表达水平、激活Akt/FOXO3a/Bim信号通路对LPS致HUVECs的损伤发挥保护作用。     

Macrophages Aggravate Hypoxia-Induced Cardiac Microvascular Endothelial Cell Injury via Peroxynitrite: Protection by Tongxinluo

Abstract

Activated macrophages contribute to endothelial dysfunction; however, it is unclear how peroxynitrite contributes to macrophage-mediated human cardiac microvascular endothelial cell (HCMEC) injury in hypoxia. In macrophage-HCMEC co-cultures subjected to hypoxia, there was an increase in hypoxia-inducible factor (HIF)-1α, HIF-2α, inducible nitric oxide synthase (iNOS), endothelin-converting enzyme (ECE)-1 and cyclooxygenase-2 (COX-2), and concomitant decrease in prostacyclin synthase (PGIS). This was mimicked by a peroxynitrite donor and attenuated by its decomposition catalyst. Tongxinluo (TXL) could decrease HIF-2α, iNOS, ECE-1 and COX-2 and increase PGIS in a dose-dependent manner, with increase of vascular endothelial growth factor. The protein alterations verified the remarkably affected mRNAs, indicating that the effects of TXL were similar to but better than that of peroxynitrite decomposition catalyst. Furthermore, TXL inhibited macrophage-mediated nitrotyrosine accumulation and attenuated HCMEC injury. The results suggest that peroxynitrite contributes to macrophage-mediated HCMEC injury in hypoxia, and TXL attenuates HCMEC injury mainly by inhibiting peroxynitrite.     

A Novel Brain Neurovascular Unit Model with Neurons,Astrocytes and Microvascular Endothelial Cells of Rat

A novel triple cell neurovascular unit (NVU) model co-culturing with neurons, brain microvascular endothelial cells (BMECs) and astrocytes was established in this study for investigating the cerebral diseases and screening the candidates of therapeutic drug. We have first performed the cell identification and morphological characterization, analyzed the specific protein expression and determined the blood-brain barrier (BBB) function of the co-culture model under normal condition. Then, we further determined the BBB function, inflammation, cell injury and the variation of neuroprotective factor in this model after anoxia-reoxygenation. The results suggest that this model exhibited a better BBB function and significantly increased expression of P-glycoprotein (Pg-P) and ZO-1 compared with BMECs only or co-culture with astrocytes or neurons. After anoxia-reoxygenation, the pathological changes of this model were basically resemblance to the pathological changes of brain cells and BBB in vivo. And nimodipine, an antagonist of calcium, could reverse those changes as well. According to our observations, we deduce that this triple cell co-culture model exhibits the basic structure, function and cell-cell interaction of NVU, which may offer a more proper in vitro system of NVU for the further investigation of cerebral diseases and drug screening.     

大肠杆菌yijP侵袭蛋白诱导人脑微血管内皮细胞凋亡

为研究大肠杆菌的脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的功能,将yijP基因（1．04kb）克隆到pQE30表达载体,构建表达产物为N末端带有6个组氨酸（His）序列的yijP汇合蛋白,以M15（pREP4）为受体菌,大量表达（His）6-yijP汇合蛋白,利用Ni—NTA亲和层析纯化汇合蛋白,将经透析法复性的一定浓度的（His）6-yijP蛋白加入到体外培养的人脑微血管内皮细胞中,结果显示yijP蛋白对人脑微血管内皮细胞有较强的细胞毒作用：在相差显微镜下可观察到细胞皱缩、胞膜呈泡状膨出,随着时间延长细胞逐渐脱落;荧光显微镜下可见细胞核呈现为致密团块状或圆形浓染颗粒状,呈凋亡样改变：DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA阶梯状条带;流式细胞仪显示在正常二倍体峰之前出现一个亚二倍体峰;Western印迹可检测到caspase-3的活性片段。这些现象均出现在yijP蛋白作用于人脑微血管内皮细胞的16h之后,提示在大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞过程中,yijP蛋白可能起到诱导脑微血管内皮细胞迟发性凋亡的毒素作用。