外显子组测序技术在人类疾病研究中的应用

外显子组测序是针对基因组中的蛋白质编码区,靶向富集外显子区域测序,以发现疾病相关遗传变异的技术。该技术近年越来越多地应用于发现人类基因组低频变异、鉴定单基因遗传病致病基因和肿瘤等复杂疾病易感基因研究,成为人类疾病相关变异研究的重要工具。综述了外显子组测序技术的基本原理及其在人类疾病相关基因研究中的应用。     

外显子组测序在人类疾病中的应用

据估计,约85%的人类遗传变异集中在蛋白编码区,因此对全部的蛋白编码区（外显子组）进行重测序,可以快速、有效地鉴定人类疾病遗传变异。以往鉴定孟德尔遗传病的致病基因多采用连锁分析结合候选定位克隆的方法,不仅耗时长,而且成功率低。2009年,科学家第一次应用外显子组测序在4名弗里曼谢尔登综合征（常染色体显性遗传病）中发现了位于MYH3中的点突变,显示出外显子组测序在孟德尔遗传病致病基因鉴定中的强大功效。就复杂疾病而言,传统的关联研究,包括全基因组关联研究（GWAS）,虽然鉴定了大量的常见变异,但对低频变异和罕见变异的检测能力十分有限;深度测序的发展为解决上述问题提供了良好的契机。本文就外显子组测序在人类疾病中的应用作一简要综述。     

全基因组外显子测序及其应用

近年来,众多研究小组开展了大量的全基因组关联研究(Genome-wide association studies,GWAS),发现并鉴定了许多与复杂疾病/性状相关联的遗传变异,为复杂疾病发病机制的研究提供了重要线索。由于GWAS的结果存在假阳性、假阴性、检测到的单核苷酸多态性很少位于功能区以及对稀有变异和结构变异不敏感等问题,导致了其应用的局限性。而新一代测序技术的进步,促进了全基因组测序和全基因组外显子测序的快速发展,为解决上述问题提供了契机。全基因组外显子测序是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。由于其具有对常见和罕见变异高灵敏度,能发现外显子区绝大部分疾病相关变异以及仅需要对约1%的基因组进行测序等优点,促使全基因组外显子测序成为鉴定孟德尔疾病的致病基因最有效的策略,也被运用于复杂疾病易感基因的研究和临床诊断中。     

利用外显子测序在高度近视家系中鉴定一个新的NYX基因错义突变

高度近视是一种常见的眼科遗传性疾病,是导致患者视力丧失甚至失明的主要原因,其高患病率和高致盲率给广大患者的生活、工作、学习造成了极大的痛苦。在本研究中,我们收集到一个来自广西地区的三代高度近视家系,收集家系中17个成员的临床资料,抽取外周血,提取基因组DNA,应用外显子测序的方法分析所有外显子序列,运用Sanger测序在该家系中验证外显子测序的结果,发现NYX基因一个新的错义突变c.790A>T(p.N264Y)在该家系中与疾病表型共分离,在1000Genomes、ESP6500和ExAc等数据库及100例对照中,均排除该罕见突变。已有研究显示,NYX基因c.792C>G(p.N264K)突变与先天性静止性夜盲有关,表明NYX基因第264位氨基酸的不同变异可能导致不同的表型。我们的发现扩大了NYX基因的突变谱,为阐明其基因型-表型关系提供了有价值的信息。     

Nature系列期刊导读

<正>探讨大规模基因组研究随着新一代基因组测序技术的发展,近十年来大规模基因组测序研究越来越多,由此积累出了庞大的数据群。该文从以下三方面探讨了大规模基因组研究中的大数据问题:全基因组关联研究以及外显子组测序研究中的显著性检验,以及如何使研究更具有统计学意义;外显子组突变研究对于理解和预测当前和未来人类疾病和进化的模式具有重要意义;基于基因的稀有突变研究,及其与已知疾病的     

定位于5q31-5q32的DFNA52的20个候选基因的突变筛查

为了克隆定位于5号染色体微卫星标记D5S2056和D5S638之间约8.8 cM的区间内的非综合征性常染色体显性遗传性耳聋 DFNA52 (OMIM: 607683)的致病基因, 文章根据基因在耳蜗组织的表达情况, 筛选出20个候选基因, 设计合成了扩增20个基因外显子及外显子与内含子交界的引物, 用DNA直接测序法进行序列变异分析。结果显示, 在基因外显子及侧翼区共发现了45个单核苷酸多态, 其中42个变异在多态数据库已报道, 其余3个为新发现的单核苷酸多态, 序列变异与疾病表型无共分离现象, 排除了这些基因外显子突变导致遗传性耳聋的可能性。     

利用转录组数据鉴定和分析小鼠非编码RNA

基因转录表达是一个复杂、精确并具有时空特异性的过程.目前对转录组的研究主要集中在蛋白编码基因上.近几年,一个新的转录组研究工具—大规模并行c DNA测序技术(RNA-seq)为更深入地研究转录组带来了希望.利用RNA-seq数据,鉴定出大量的非编码RNA,特别是lincRNA,并且发现这些非编码RNA是多个生物学过程中重要的调控因子.利用深度测序获得的15个小鼠组织RNA-seq数据探索非编码RNA在小鼠不同组织中的多样性和动态变化.依据自定的标准,在这15个组织中共鉴定出16249个非编码基因(对应21569个非编码RNA).研究这些非编码RNA的多种特征,可以发现与蛋白编码基因相比,非编码RNA通常比较短,外显子个数少,表达量低,组织特异性强.而且,这些非编码RNA有明显的转录起始和转录延伸信号(H3K4me3,H3K27me3,H3K36me3修饰,RNAPⅡ结合位点以及CAGE)的富集.基因集富集分析结果表明,lincRNA与多个生物学过程相关,如免疫反应、肌肉发育和有性生殖等.本研究提供了更加全面的对小鼠非编码RNA的注释信息,为小鼠非编码RNA的功能和进化研究奠定了基础.     

新一代测序的拷贝数变异检测算法研究与设计

基于不同的测序技术,基因拷贝数变异的检测方法有多种,但时间复杂度较高,而新一代测序技术的发展为基因拷贝数变异检测的研究开辟了新领域。通过仿真实验、置换检验设计出一种新的基于新一代测序的拷贝数变异检测算法。不同于其它算法,本算法无需参考样本,通过直接研究比对后的序列以及reads与拷贝数的关系,来研究检测拷贝数变异,实验结果表明在时间复杂度上能提高50%以上的运算速度,这对今后拷贝数与疾病的研究具有重要意义。     

血脂异常遗传性疾病的研究现状

血脂异常(Dyslipidemia)是指血浆中胆固醇和(或)甘油三酯水平升高, 可导致严重的心血管疾病, 常以冠心病和脑中风为首发表现, 该类疾病严重危害着人们的健康。一些血脂异常疾病具有遗传性, 主要包括孟德尔遗传和多基因遗传。传统检测血脂异常相关基因的方法主要有DNA测序和连锁分析, 适合于孟德尔遗传性血脂异常疾病。最近几年兴起的新一代测序技术(Next-generation sequencing)不仅适用于孟德尔遗传性血脂异常疾病的研究, 同样适用于复杂性血脂异常疾病。2006年至今, 运用全基因组关联分析(Genome wide association study, GWAS)筛出许多与血脂异常疾病相关的基因, 这些基因和早期孟德尔遗传家系确定的基因多数相同。GWAS频谱分析发现, 复杂性疾病相关的基因变异频率存在差异, 并且几乎所有筛查出的与血脂异常疾病相关的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)变异均位于非编码区, 使得人们逐渐对非编码区基因变异展开了研究。血脂异常致病基因的发现和基因变异致病机制的阐明, 为血脂异常疾病提供新的治疗靶点, 并为新一代药物筛选提供新思路。文章对血脂异常遗传性疾病的研究现状进行了综述。     

Nature:外显子测序发现促心肌梗死风险基因

<正>近日,来自美国的科学家在著名国际期刊Nature发表了他们的最新研究成果,他们通过对心肌梗死病人进行外显子测序发现两个蛋白编码基因的罕见突变可能会导致心肌梗死患病高风险。这项研究对临床预测心肌梗死发病,针对性开发治疗药物具有重要意义。研究人员指出,心肌梗死(MI)是全世界范围内致死率非常高的一种疾病,具有复杂的遗传模式。对于早发性MI,基因遗传是一个主要的风险因素。之前已有研究证明LDL基因中的罕见突变能够增加个别家庭发生MI的风险,同时有超过45个位点的常见突变与人群的MI发生风险具     

长链非编码RAN的研究进展

人类基因组计划完成证实,人类共有3-3.5万个编码基因,这些基因所涵盖的编码信息仅占人类30亿个碱基对中携带遗传信息的1.5%,其余超过98%的遗传信息并不直接编码蛋白质。近些年来由于测序技术的飞速发展,人们发现这部分遗传信息与调控、剪切、转录等生物过程密切相关,其中长链非编码RNA具有表观遗传学调控、转录调控、疾病调控、细胞分化和个体发育等重要的生命过程的调控等过程,因此如何寻找RAN的功能单元和预测新的长链非编码RNA成为很重要的问题。就非编码RNA的起源与进化进行阐述,综述了长链非编码RNA在癌症上的功能,综合了长链非编码RNA一些常见的数据库及使用最新的生物信息学手段和相关技术预测长链非编码RNA,并进行进一步的功能研究。     

猪apoC3基因的遗传变异分析

目的:探究猪apoC3基因多态性,为进一步探讨其对脂肪沉积的影响和表达调控等研究提供依据。方法:选取具有不同脂肪沉积特点的3个猪种(可乐猪、贵州白香猪和大约克猪)构建品种DNA池并进行测序,结合各SNP位点测序峰高比值估算等位基因频率,并利用在线软件对不同基因型的转录结合位点及mRNA二级结构进行预测。结果:在3个猪种的apoC3基因中共发现17个SNPs(2个位于5’侧翼区;1个位于外显子3中,为同义突变;1个位于3’非翻译区,其它13个分别位于3个不同内含子中),其中C813G变异增加了一个转录因子GATA-2结合位点,G2280A变异导致mRNA二级结构最小自由能增加0.4kkal/mol。结论:不同猪种间apoC3基因SNPs位点等位基因频率差异较大,而apoC3基因编码区相对保守。     

合作猪SLA-DQA基因外显子2多态性分析

旨在研究合作猪DQA基因外显子2多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、氨基酸多态位点及各个等位基因之间的遗传关系,分析其进化意义。选用PCR-SSCP对439只合作猪SLA-DQA基因外显子2的多态性进行检测;测序群体内因变异而产生的各等位基因序列,并分析序列数据。结果显示,在合作猪SLA-DQA外显子2中发现了7个新等位基因,共18个核苷酸多态位点,10个氨基酸多态位点。合作猪SLA-DQA外显子2具有较丰富的多态性,群体内可能蕴藏着更加丰富的遗传资源;合作猪SLA-DQA外显子2基因最初可能由一个等位基因突变分化成一大类基因;合作猪SLA-DQA外显子2序列与各个猪种的SLA-DQA外显子2序列具有较高的同源性,预示着这些猪种的SLA-DQA外显子2基因最早可能来源于其分歧之前的共同祖先原始序列;新发现的7个SLA-DQA外显子2等位基因,可能由遗传关系较近的两个等位基因突变产生。     

豚鹿MHC-DOA基因克隆及其外显子2遗传多样性研究

主要组织相容性复合物(MHC)在脊椎动物的免疫系统中起着重要的作用,MHC-DOA基因是MHCⅡ类的非经典基因,其外显子2多态性丰富。豚鹿Axis porcinus是我国极度濒危的动物。本研究以成都动物园圈养的38头豚鹿为研究对象,提取豚鹿血液总RNA,反转录合成cDNA为模板,利用PCR方法克隆到豚鹿MHC-DOA序列;同时利用PCR方法扩增38头豚鹿的MHC-DOA基因外显子2基因并测序,再进行多态性分析。结果显示:豚鹿MHC-DOA基因开放阅读框长753 bp,编码250个氨基酸残基;蛋白质同源性分析表明,豚鹿MHC-DOA基因与东欧马鹿Cervus elaphus hippelaphus的同源性最高(98.4%);38头豚鹿的MHC-DOA外显子2共有10种单倍型,整体遗传多样性水平中等;MHC-DOA外显子2部分序列中发生了核苷酸的缺失和插入,进而引起DOA蛋白序列发生改变。豚鹿MHC-DOA多态性的研究对豚鹿种群遗传结构调查、遗传资源的保护具有重要意义。     

FSHR基因复合杂合新变异导致高促性腺激素闭经而不孕

为探讨1例高促性腺激素闭经同时卵巢功能正常的不孕患者的遗传学病因,同时也为遗传咨询以及生育指导提供依据,应用全外显子组测序技术对患者临床表征相关的基因进行生物信息学分析及诊断,对患者及其姐姐、弟弟与父母的FSHR基因进行变异位点Sanger测序.结果检出,患者FSHR基因第5外显子c.392G>A(p.Gly131As...     

一例CYP11B基因突变导致11β-羟化酶缺乏症的诊疗和基因检测分析

先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia,CAH)是一种常染色体隐性遗传病,在不同类型的CAH发病率中,11β-羟化酶缺乏症排第二位,该疾病的发生与人8号常染色体上CYP11B基因突变有关。本研究采集了1名14岁患者的外周血,通过提取基因组DNA,应用全外显子测序对其进行了基因检测,对疑似变异进行Sanger测序验证,并分析其特点。结果发现,患者CYP11B1基因第8外显子存在c.1226C>T纯合错义突变,导致其编码蛋白第409位丝氨酸突变为苯丙氨酸(p.Ser409Phe),从而影响血红素与酶的结合,最终导致CYP11B1酶活性丧失,引起一系列临床症状。这一突变目前尚未见国内外有相关报道。本研究丰富了CYP11B1基因变异谱,为进一步研究11β-羟化酶缺乏症的致病机制提供了临床资料和遗传资源。     

恒河猴PPARgamma基因的生物信息学分析

恒河猴 Macaca mulatta是继黑猩猩Pan troglodytes 后第2个完成基因组测序的非人类灵长类动物,在生命科学领域中具有重要意义.本文利用生物信息学方法寻找与人类肥胖密切相关的 PPARg 基因在恒河候中的同源基因,对该基因的序列、外显子信息、编码蛋白及其理化性质进行分析,并预测其编码蛋白的结构与功能,构建其同源基因的系统进化树,旨在为今后人类肥胖的相关研究提供一定的依据.     

一例ZMPSTE24基因复合杂合突变导致颅骨下颌骨皮肤发育不全B型的诊断和基因检测分析

颅骨下颌骨皮肤发育不全(mandibuloacral dysplasia,MAD)是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病,主要与LMNA及ZMPSTE24基因发生变异有关。本文报道了国内首例颅骨下颌骨皮肤发育不全B型患者,主要表现为特殊面容、喂养困难、体格生长明显落后、全面的发育迟缓伴牙齿和骨骼发育异常。全外显子组家系测序结果显示患者携带ZMPSTE24基因c.743C>T (p.Pro248Leu)(dbSNP:rs121908095)与1～10号外显子缺失的复合杂合突变,经Sanger测序与定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)实验检测显示,两个突变分别遗传自其表型正常的母亲与父亲。通过总结分析该例病例特点及其家系遗传规律,对于临床上难以进行明确诊断的疾病,建议进行全外显子组家系测序,辅助疾病的诊断。该病例的发现提高了临床医师对MAD疾病的认识,也为该疾病后续的遗传学研究提供新的临床资料。     

PCR－SSCP检测肺癌细胞p53基因点突变

应用溴化乙锭(EB)染色的PCR-SSCP技术对10例非小细胞性肺癌组织标本p53基因外显子5～8进行分析,其中1例在外显子5～6;1例在外显子7;2例在外显子8发现异常电泳带.对1例经SSCP检测异常的p53基因进行核酸序列分析,发现第280位密码子由AGA变成ACA,其编码的氨基酸由丝氨酸变成半胱氨酸.结果证实:非小细胞性肺癌与p53基因突变有关;EB法PCR-SSCP技术是一种简便、可靠的点突变检测法.     

全基因组测序及其在遗传性疾病研究及诊断中的应用

最近,随着测序成本的不断降低,数据分析策略的不断提升,全基因组测序（whole-genome sequencing,WGS）已经在癌症、孟德尔遗传病、复杂疾病的致病基因检测中得到了一定运用,并逐步走向了临床诊断。全基因组测序不但可以检测编码区和非编码区的点突变（SNVs）和插入缺失（InDels）,还可以在全基因组范围内检测拷贝数变异（copy number variation,CNV）以及结构变异（structure variation,SV）。本文详细地介绍了全基因组测序的标准生物信息分析流程与方法,及其在疾病研究、临床诊断中的应用,并对全基因组测序在医学遗传学中的应用与研究进展,以及数据分析方面面临的挑战进行了概述。