转基因红鲤体细胞的核移植

以F4代转hGH基因红鲤体细胞（肾脏和尾鳍）及培养18代的F4代转hGH基因红鲤尾鳍细胞为核供体,泥鳅或黄河鲤成熟卵为受体,进行了核移植,以探讨外源F4代转基因鱼体外源基因的分布与存在形式,稳定性和克隆转基因鱼的可能性。F4代红鲁肾脏细胞核与泥鳅卵配合的核移植胚胎有12．4％发育到囊胚,0．33％发育到神经胚;F4代尾鳍细胞核移入泥鳅卵后的重组胚发育到囊胚,神经胚、肌节期和肌肉效应期的胚胎分别为24．5％、0．3％、0．2％和0．1％;对照卵无发育。F4代红鲤尾鳍培养细胞与黄河鲤卵子配合的重组胚胎有50．53％发育到囊胚,5．69％发育到原肠胚,0．53％发育到神经胚,0．4％发育到肌节期。说明由于同种细胞核与卵细胞的相容性高于异种核卵的相容性,早期发育率高;而由于培养细胞的异倍化,后期的发育率降低。用PCR技术对供体鱼不同个体及同一体不同组织外源基因检测,结果100％个体为阳性鱼,而且不同组织的阳性率也是100％,说明外源基因均匀分布在不同组织中。无论F4代转基因鱼的肾脏细胞、尾鳍细胞还是培养的尾鳍细胞作核移植供体,核移植胚胎中hGH基因的检出率为100％。说明F4代转基因红鲤个体不同细胞都存在hGH基因,而且经长期培养不会丢失。表明F4代转基因红鲤中的外源hGH基因已基本稳定,体细胞核移植可以作为获得同质化转基因鱼的有效手段,但核移植效率还很低。另外还讨论了核质的相容性、细胞周期的协调、染色体的变异等因素对核移植的影响。     

鱼类体细胞移核胚胎发育影响因素的探讨

将脱膜后的泥鳅 (Misgurnusanguillicaudatus)受精卵置于不同孵化液中孵化 ,结果表明 ,孵化液 1×Holtfreter中正常鱼苗和总鱼苗的孵化率最高 ,分别为 5 4 8%和 5 9 2 %。 1/ 2×Holtfreter、 1/ 10×Holtfreter、曝气冷开水和改变孵化液处理 ,正常鱼苗的孵化率差别不大 ,分别为 48 0 %、 49 6 %、 5 0 0 %和 48 8%。曝气冷开水畸形率最高 ,为 8 8%。PBS不适合用作孵化液。机械损伤对胚胎的孵化率无明显影响 (73 39%vs 75 70 % ) ,但对胚胎发育有明显的致畸作用 (8 0 6 %vs 0 )。以雌核发育鳙 (Aristichthysnobilis)尾鳍培养细胞作供体 ,泥鳅未受精卵作受体 ,微卫星标记分析表明 ,移核胚胎的核来源于供体核 ,受体卵中未除去的核被排斥。供体细胞培养代数严重影响移核胚胎的发育率。随着培养代数的增加 ,移核胚胎的发育率逐渐降低。继代核移植可提高移核胚胎的发育率 ,尤其是第 1次体细胞继代核移植 ,晚期囊胚的发育率急剧上升 (4 3 84%vs 7 6 9% ) ,说明继代核移植可促进受体卵对供体核的再程序化。泥鳅和大鳞副泥鳅 (Paramisgurnusdabryanus)未受精卵作受体 ,其移核胚胎发育率无明显区别 (7 6 9%vs 7 0 2 % )。     

银杏雌雄配子体发育及胚胎形成的研究进展

银杏(Ginkgo biloba)是现存最古老的裸子植物之一, 其生殖过程表现出许多原始特征和独特性状, 长期以来备受国内外专家的关注。经过近100年的研究取得了显著成果: (1) 银杏雄配子体发育周期长, 经历了从平周分裂到斜背式分裂,并最终垂周分裂形成带有鞭毛的游动精子; (2) 银杏雌配子体发育经历较长的游离核期和细胞化期, 分化形成颈卵器母细胞并经平周分裂、垂周分裂和斜向分裂形成成熟的颈卵器(包括有4个颈细胞和1个卵细胞); (3) 推测其精细胞中的液泡状结构为受精过程中的遗传物质载体; (4) 原胚的形成经历了游离核期和细胞化期。该文针对国内外最新银杏生殖生物学方面的研究进展, 对银杏雌雄配子体发育、受精过程以及胚胎形成等方面进行较为系统全面的分析和总结, 为进一步的银杏生殖生物学研究提供有价值的参考资料。     

奶山羊转基因供核细胞的再饥饿对核移植胚胎发育的影响

为提高转基因奶山羊体细胞核移植胚胎早期发育率,将经转染外源基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿培养(含0．5％FCS的DMEM)5天后分成两部分：第一部分细胞-80℃或液氮冻存,试验前复苏后直接用作供核细胞(试验组Ⅰ),或复苏后恢复培养(含10％FCS的DMEM)2-5天后再饥饿5天用作供核细胞(试验组Ⅱ);第二部分细胞作传代培养(含10％FCS的DMEM)2天后再饥饿5天用作供核细胞(试验组Ⅲ)。将上述不同处理的供核细胞进行细胞周期与存活率的检测,并将该供核细胞移入去除遗传物质的山羊MⅡ期卵母细胞的卵周隙内,经电融合、化学激活后,将核移植(NT)胚胎经0．8％琼脂糖包理后移入临时寄母输卵管内,培养6天后回收并观察NT胚胎的早期发育。结果,试验组Ⅱ所用供核细胞中G0／G1期细胞所占比例及其存活率分别为95．68％、99．9％,均显著地高于试验组Ⅰ(88、66％、80％);试验组Ⅱ的桑椹及囊胚期NT胚胎的发育率(66．09％)显著地高于试验组Ⅰ(22．00％)与试验组Ⅲ(50．5l％)。将以上发育的NT胚胎分别移入同步发情的受体后,35天作B超妊娠诊断,试验组Ⅱ的受体妊娠率为45．83％,显著地高于试验组Ⅰ(20．00％)与试验组Ⅲ(29．58％)。流式细胞仪分析结果表明,饥饿后的供核细胞经冷冻,复苏后恢复培养2-5天,再经饥饿处理,能显著地提高G0／G1期细胞的比例及细胞存活率;应用该细胞所组建的NT胚不仅具有较高的桑椹与囊胚期发育率,而且具有较高的受体妊娠率。     

同源四倍体萝卜雄配子体发育

利用爱氏苏木精染色-冬青油透明"技术,首次报道了同源四倍体萝卜(2n=4x=36)雄配子体的动态发育过程.结果表明:同源四倍体萝卜小孢子核经一次有丝分裂产生营养核与生殖核,生殖核再经一次有丝分裂形成两个精核,最终形成3-细胞型成熟花粉,与相应的二倍体雄配子体的整个发育过程相似;四倍体花粉具2个、3个或4个萌发孔,二倍体多为3孔花粉;四倍体雄配子体发育过程中异常频率为32%,比二倍体高20%,败育主要发生在四分体时期和单核期.     

竹节参雌配子体发育的研究

本文报道了竹节参(Panax japonicus C.A.Mey)雌配子体(胚囊)的发育过程。竹节参大孢子母细胞减数分裂产生线形排列的大孢子四分体。胚囊发育属蓼型,由合点端大孢子发育而成。游离核胚囊时期,胚囊珠孔端的细胞器种类和数量都较胚囊合点端多;胚囊合点端相邻的珠被细胞中有含淀粉粒的小质体,与胚囊珠孔端相邻的退化中的非功能大孢子中则有含淀粉粒的大质体和大类脂体。成熟胚囊中,反足细胞较早退化;极核融合成次生核;卵细胞高度液泡化,细胞器数量较少;助细胞则有丰富的细胞器和发达的丝状器。PAS反应表明,受精前的成熟胚囊中积累淀粉粒。次生核受精后,很快分裂产生胚乳游离核,到几十至数百个核时形成胚乳细胞。卵细胞受精后则要经过较长的休眠期。     

山羊(Capra hircus)重构胚与再重构胚早期发育的研究

选择山羊8细胞期到桑椹胚期的正常胚胎或重构胚的卵裂球,或选择胚泡期胚胎的内细胞团细胞作为供核,并以LRH注射后26—28h的去核成熟卵球作为受体,制备重构胚或再重构胚,琼脂糖包埋,植入山羊输卵管内,体内培养4—6天发育结果表明:不同发育时期(8细胞期至胚泡期)的正常胚胎细胞核或重构胚细胞核中,至少有部分细胞核均保留着发育的全能性,这些细胞核在母系基因表达产物的调控下,实现重新编程,启动并完成正常发育的全过程。     

鱼类染色体组操作的研究 Ⅱ.静水压处理和静水压与冷休克结合处理诱导水晶彩鲫四倍体

采用静水压处理和静水压与冷休克结合处理两种方法进行了抑制第一次卵裂诱导水晶彩鲫四倍体的研究。水晶彩鯽受精卵在受精后(发育水温14—15℃)50、54、55和60min时的静水压(650kg/cm~2)处理(3min)组中都出现了四倍化胚胎,而在受精后48和48min以前的相同处理组中都没有观察到四倍化胚胎。在受精后(发育水温16-18℃)48、50、52、55、56和60min时的静水压与冷休克结合处理组中,也都出现了四倍化胚胎,且四倍化率比仅用静水压处理高,但存活率更低。在经过处理而发育形成的胚胎中,既有四倍体、次四倍体和4n/2n嵌合体,也有二倍体和次二倍体,并在一些次二倍体和次四倍体中期相中还观察到休克处理致使染色体断裂的痕迹——染色体片段。在抑制卵裂诱发加倍的效应期内,可能存在瞬间对休克耐受性较强的时期,而在此前后,对休克更为敏感。在少数处理组中,已筛选出了数尾四倍体鱼。文中还对鱼类四倍体的诱导技术、抑制卵裂诱发染色体组加倍的效应期以及四倍化胚胎的存活率和生命力等有关问题进行了分析和讨论。     

开口箭大小孢子发生及雌雄配子体发育

利用石蜡切片技术,对百合科植物开口箭(Tupistra chinensis Baker)大小孢子发生及雌雄配子体发育进程进行胚胎学观察分析,以明确开口箭胚胎发育的特征,为百合科植物的研究提供生殖生物学依据。结果表明:(1)开口箭花药具有4个药室,花药壁的发育方式为基本型,由表皮、药室内壁、中层及绒毡层组成;绒毡层发育类型为分泌型,到四分体花药阶段绒毡层细胞开始解体退化,花药成熟时完全消失。(2)花粉母细胞减数分裂为连续型,依次形成二分体、四分体,四分体为左右对称形;成熟花粉为2-细胞花粉,具单萌发沟。(3)子房3室,倒生型胚珠6枚,双珠被,薄珠心;在花部的分化早期,由珠心顶端表皮下方分化出雌性孢原细胞,孢原细胞经过一次平周分裂形成周缘细胞和造孢细胞,造孢细胞发育为大孢子母细胞;大孢子母细胞第一次减数分裂后形成二分体,珠孔端的二分体孢子退化,合点端的二分体孢子继续第二次分裂,形成两个子细胞依次发育为二核胚囊、四核胚囊和八核胚囊;开口箭的胚囊发育类型为葱型。     

几种鱼类细胞对草鱼呼肠孤病毒敏感性的研究

比较研究了鲫鱼异倍体细胞系(CAB-80)、团头鲂尾鳍细胞系(BCC)、大鳞副泥鳅雌核发育单倍体胚胎细胞系(PHG)、草鱼胚胎细胞系(GCE)、草鱼尾鳍细胞系(GCRF-2)、草鱼肾细胞系(GCK-84)及其四个克隆对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的敏感性。证实了这些细胞(PHG除外)在不同程度上对GCRV敏感,其中以GCK-84的敏感性最强。这表明,在体外培养条件下,GCRV并无严格的种族特异性。用经GCK-84传代的病毒感染草鱼种,能复制出典型的出血病症状。用GCK-84检测了病毒在GCK-84、GCRF-2、CAB-80、BCC和PHG中的滴度(TCID_(50/ml)),其值分别为8.24,7.36,2.90,2.15和1.33。4个克隆与肾细胞系对病毒的敏感程度亦不尽相同,其滴度在6.3到9.32之间变化。上述结果对细胞工程抗病育种预示有较大的潜在意义。在电镜下可见GCRV对被感染的细胞造成了严重的破坏。病毒为平均直径58nm的球形颗粒,具有一个高度电子密度的核心,平均直径约为38nm。病毒在细胞中的分布方式有三种:即散布于细胞质中的、呈晶格状包于一膜状结构中的和整齐或不整齐地聚集在一起但无膜包裹的。     

几种鱼类细胞对草鱼呼肠孤病毒敏感性的研究

比较研究了鲫鱼异倍体细胞系(CAB-80)、团头鲂尾鳍细胞系(BCC)、大鳞副泥鳅雌核发育单倍体胚胎细胞系(PHC)、草鱼胚胎细胞系(GCE)、草鱼尾鳍细胞系(CCRF-2)、草鱼肾细胞系(CCK—S4)及其四个克隆对草鱼呼肠孤病毒(CCRV)的敏感性。证实了这些细胞(PHG除外)在不同程度上对GCRV敏感,其中以GCK-84的敏感性最强。这表明,在体外培养条件下,GCRV并无严格的种族特异性。用经GCK-84传代的病毒感染草鱼种,能复制出典型的出血病症状。用GCK-84检测了病毒在GCK-84、GCRF-2、CAB-80、BCC和PHG中的滴度(TCID50/mt),其值分别为8．24,7．36,2．90,2．15和1．33。4个克隆与肾细胞系对病毒的敏感程度亦不尽相同,其滴度在6．3到9．32之间变化。上述结果对细胞工程抗病育种预示有较大的潜在意义。在电镜下可见GCRV对被感染的细胞造成了严重的破坏。病毒为平均直径58nm的球形颗粒,具有一个高度电子密度的核心,平均直径约为38nm。病毒在细胞中的分布方式有三种-即散布于细胞质中的、呈晶格状包于一膜状结构中的和整齐或不整齐地聚集在一起但无膜包裹的。     

蒙古莸小孢子发生和雄配子体发育的研究

运用常规石蜡切片技术对蒙古莸小孢子发生和雄配子体发育进行了观察.结果表明:(1)花药4室,花药壁由4层细胞组成,由外向内分别为表皮、药室内壁、1层中层和绒毡层,花药壁发育方式为双子叶型.(2)花药壁表皮具多细胞腺体,药室内壁、药隔部分细胞发育后期均发生纤维性加厚.(3)绒毡层细胞有两种来源,外周部分来源于初生壁细胞,近药隔部分来源于药隔细胞.腺质绒毡层,发育后期为二核.(4)小孢子母细胞减数分裂过程胞质分裂为同时型,四分体多数为四面体型,偶有左右对称型.(5)成熟花粉为2细胞型,具3个萌发沟.     

体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响

为探讨体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响,实验采用电融合法将小鼠2—细胞胚胎卵裂球、胚胎干细胞(ES)、胎儿成纤维细胞、耳成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、睾丸支持细胞和精原细胞以及不同培养代次的胎儿成纤维细胞进行了核移植。结果显示：2—细胞胚胎卵裂球供核重构胚发育最好,囊胚率为7．4％;ES细胞重构胚虽然发育率低,但仍有囊胚出现,比例为0．7％;胎儿成纤维细胞重构胚最高发育阶段为桑椹胚,比例为0．2％;精原细胞重构胚只能发育到8-细胞阶段,比例为0．3％;其他几类细胞重构胚则仅能发育至4-细胞阶段。不同培养代数的胎儿成纤维细胞重构胚除第3代外都可发育到8-细胞阶段,且发育率差异不显著,但第一代细胞重构胚2-细胞发育率(40．7％)显著低于2、3和4代细胞重构胚。结果表明：不同分化程度的细胞核移植后,重新编程的难易程度是不一样的,分化程度越高则重新编程越难;未调整细胞周期的ES细胞由于多数处于S期,所以重构胚发育率很低;体外培养传代有利于体细胞核移植后重新编程。     

小鼠卵母细胞的冷冻—解冻及其体外发育的研究

试验比较四种防冻剂对小鼠核泡期(germinal vesicle stage)无卵丘细胞的卵母细胞(下称裸卵),在各种不同条件下冷冻-解冻的影响,并用乙二醇为防冻剂,冷冻-解冻后,形态正常的裸卵1137枚,经体外培养排出第一极体、发育达中期Ⅱ的成熟率为43.2％(491/1137)。用体外获能的小鼠附睾尾精子进行体外受精的受精率为25.4％(31/122)。继续培养进一步发育至2-细胞期的发育率为17.3％(55/318)。对照组(新鲜裸卵)的成熟率为48.6％(158/325),受精率为26.4％(388/144)。两者无显著差异(P<0.05)。     

人工诱导白鲫(♀)×红鲤(■)异源四倍体鱼的初步研究

人工诱导鱼类多倍体是动物染色体工程的重要课题。鉴于三倍体鱼的不育性和成活率高、生长快等特点,国内外采用理化手段直接诱导三倍体鱼已在三棘刺鱼(Gasterosleus aculeatus(L.))、鲽鱼(Pleuronectes platessa)、鲤鱼(Cyprinus carpio L.)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、草鱼(♀)×团头鲂(Megalobrama amblycephala)(♂)杂种,以及白鲢(Hypophthalmichthysmolitrix),等十多种鱼获得成功。有的已开始用于实践并取得较明显的经济效益。尽管如此,诱导三倍体鱼的技术毕竟不是一劳永逸的方法。理想的方法是人工诱导获得能育的异源四倍体(或同源四倍体),再与二倍体鱼杂交得三倍体鱼,从而为大规模生产三倍体鱼提供一条行之有效的捷径。陆仁后等(1982),用草鱼尾鳍细胞诱导成同源四倍体细胞并移至泥鳅去核卵得到心跳期     

灰花纹鹅膏菌(Amanita fuliginea)子实体发育及核相观察

采用石蜡切片、压片等方法对灰花纹鹅膏菌(Amanita fuliginea)子实体发育过程进行了观察,并用核荧光染料Hoechst 33258对灰花纹鹅膏菌子实体发育过程中的核相变化进行了观察。结果表明,灰花纹鹅膏菌子实体发育是典型的半被果型发育,菌褶是子实层同时发育类型,属于同型菌髓。在子实体发育过程中,单倍的二核担子核配后形成短暂的二倍体单核担子,经过减数分裂形成四核担子,有近40%的担子中核再进行一次有丝分裂形成8核担子,担子进一步发育产生担孢子,其中,二核担孢子约占95%,单核担孢子约2.4%,三核孢子2%左右,4核担孢子约0.4%。灰花纹鹅膏菌基因组中染色体数目2n=10条。     

玉米花粉植株的诱导和雄核发育的研究

本文报道了玉米花药培养的主要结果。品种之间诱导频率差异很显著。接种花药时,花粉单核中期诱导频率最高。培养基中加入500毫克/升酪朊水解物,0.5％活性炭,15％蔗糖能显著提高花粉胚状体和愈伤组织的诱导频率。在雄核发育的研究中,观察到有营养细胞发育途径,生殖细胞发育途径,营养细胞和生殖细胞混合发育途径,以及均等分裂发育途径等四种类型,并对这四种途径进行了讨论。     

两种蝇类精细胞发育过程中细胞核的变态

本文用透射电子显微镜研究了大头金蝇(hrysomyia megacephala)和肥须亚麻蝇(Parasarcophaga crassipalpis)精细胞发育过程中细胞核的变态过程.精细胞从球形细胞演变为线形精子,核要经历四个时期,即:球核期,细胞为球形,核亦为球形,核膜与一般体细胞核无异;棒核期,核拉长如棒,顶体形成,核膜孔聚集于一侧;染色质凝聚期,染色质与核质分开,经过一系列变化,再凝聚成致密的块状,多余核质从核孔聚集处开口排出核外;成熟期,核变成一团电子密度极大的腊肠形.精细胞抛弃绝大部分细胞质和多余的结构,变成线形精子.以上演变过程两种蝇类完全相似,但在染色质凝聚期的变化中差异却很大:大头金蝇凝聚程序为:细纤维—粗纤维—块状—致密团;肥须亚麻蝇则为:蚁蚕状—纵列薄片状—厚片状—块伙—致密团.     

扩张莫尼茨绦虫(绦虫纲:圆叶目)卵黄细胞发育的超微结构

用透射电镜观察了扩张莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)卵黄细胞发育的全过程。扩张莫尼茨绦虫卵黄细胞发育的规律为：(1)细胞体积不断增大;(2)质、核比不断增加而核体积几乎不发生改变,核表面从规则变为不规则,再由不规则变为规则,核内出现染色质浓缩成小块再分散的发育变化过程;(3)线粒体逐渐增多,发育不断完善;(4)粗面内质网及高尔基复合体出现由少到多,发育不断完善,再由多到少不断退化的变化;(5)由高尔基复合体组装的电子致密的小卵黄囊不断融合,至卵黄细胞成熟时仅有一卵黄囊,占据细胞大部分体积[动物学报49(2)：256—261,2003]。     

东北地区白桦雌配子体的形成与胚胎发育研究

以20年生白桦(Betula platyphylla)的雌花序为材料,研究了白桦的大孢子发生、雌配子体形成和胚胎发育过程.结果表明:1)大孢子母细胞经过减数分裂形成直线排列的4个大孢子,其中珠孔端的3个大孢子退化,合点端的大孢子进行3次有丝分裂,形成八核胚囊,8个核迅速细胞化,最终发育为成熟胚囊.胚囊发育类型为单孢子蓼型胚囊;2)胚的发育经过原胚、球形胚、心形胚和鱼雷胚等阶段发育为成熟胚;胚柄在球形胚时期最发达,但胚柄短小,只由3个扁平细胞组成,之后逐渐退化.本文同时对雌花的结构和发育特点在桦木科各属中的异同、白桦胚胎发生类型及胚胎发育进程的同步性进行了讨论.