一种直接用于蛋白质测序的快速电印渍技术

蛋白质印渍是指在一定的驱动力作用下将蛋白从凝胶上转移至某种印渍膜上的方法,有扩散印渍、真空印渍和电印渍三种。其中电印渍应用最为广泛,在理想条件下可将90％以上的蛋白质转移至印渍膜上。印渍膜有多种多样,如硝酸纤维素膜、阳离子化尼龙膜、DBM（diazo－benzy－loxymethy）、DPT（diazo－phenylthioether）、SGF（siliconnedglassfiber）和PVDF（polyvinylidenedifluoride）膜等“‘。近年来,又在此基础上发展了一种微量蛋白质N一端序列分析技术［’j。如果把蛋白质数据库资料与计算机结合起来,人们就有可能根据N一端序列…     

关于阳离子诱导光合激发能分配改变的机理研究:23—25KD多肽在Mg~(2+)诱导Chla荧光及类囊体膜表面电荷变化中的作用

暗中培养的黄化大麦苗在25℃用连续光照射48小时,其转绿质体明显地呈现出Mg~(2+)诱导Chla低温荧光F_(685)/F_(736)比值增高和类囊体膜电泳迁移率下降,而且这两种效应具有良好的相关性.此外,利用在照光开始时,加入蛋白质合成抑制剂CAP处理所得到的转绿质体,进行了同样的实验观察,发现这种转绿质体无Mg~(2+)诱导Chla荧光及膜表面电荷改变的效应.用常规的SDS—PAGE进行类囊体膜的多肽分析表明,这种转绿质体亦缺少LHC—PSⅡ23—25KD多肽成分.这些实验结果证明,LHC—PSⅡ23—25KD多肽成分是阳离子结合的特异性部位.文中讨论了Mg~2+)对LHC—PSⅡ的静电中和作用所引起的膜空间或构型的改变,可能是阳离子诱导激发能在两个光系统之间分配变化的重要原因.     

重复DNA顺序pRRD9在稻属中的拷贝数测定

本文应用狭缝印渍杂交方法,把水稻基因组总DNA和含水稻中度重复顺序片段的质粒(pRRD9)DNA分别转移到尼龙膜上形成狭缝印渍、然后用~(32)P标记的 pRRD9插入片段进行杂交、根据各狭缝印渍的放射性强度,测定水稻(Oryza)一些栽培种和野生种基因组中重复DNA顺序的拷贝数,并就拷贝数与水稻进化关系及基因组型的联系进行讨论.     

重复DNA顺序pRRD9在稻属中的拷贝数测定

本文应用狭缝印渍杂交方法,把水稻基因组总DNA和含水稻中度重复顺序片段的质粒(pRRD9)DNA分别转移到尼龙膜上形成狭缝印渍、然后用³²P标记的 pRRD9插入片段进行杂交、根据各狭缝印渍的放射性强度,测定水稻(Oryza)一些栽培种和野生种基因组中重复DNA顺序的拷贝数,并就拷贝数与水稻进化关系及基因组型的联系进行讨论.     

加热洗脱硝酸纤维膜上保存的尿蛋白质

用膜保存尿蛋白质对于生物标志物的研发意义重大,从保存尿蛋白质的硝酸纤维膜上洗脱蛋白质的有效性,决定着保存方法被接受的程度和应用的范围。加热洗脱蛋白质的方法,通过提高硝酸纤维膜溶解时的温度等方式;并运用SDS-PAGE和LC-MS/MS分析加热洗脱方法所制备的尿蛋白质样品,将其与强烈涡旋洗脱方法和直接丙酮沉淀方法所制备的尿蛋白质样品比较。结果显示,加热洗脱方法比强烈涡旋洗脱方法获得更多的蛋白质(P0.05),且蛋白质无降解;加热洗脱方法和直接丙酮沉淀方法制备的蛋白质样品,质谱所鉴定到蛋白质重叠率无明显差异(分别是92.6%、96.8%),蛋白质丰度CV值20%的蛋白质占总蛋白质的比例均很高(分别是85.2%、94.4%)。加热洗脱法具有很好的技术重复性,操作更加高效、简单,有利于用膜保存尿蛋白质方法的推广应用。     

鼠肝质膜蛋白质组研究的方法评估

细胞质膜是细胞中重要的细胞器, 在肝功能的发挥中具有非常重要的作用. 使用蔗糖密度梯度离心纯化细胞质膜, 通过电子显微镜观察和免疫印迹法检验膜的纯度. 结果显示, 与组织匀浆成分相比, 质膜富集了20倍, 线粒体的污染减少了约50%. 提取的蛋白质用二/一维凝胶电泳(2DE/1DE)分离、胰酶酶解、电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定, 或者提取的蛋白质直接进行溶液内酶解、液相色谱串联电喷雾离子阱质谱(LC-LTQ)(鸟枪法)鉴定. 一共鉴定了547个非冗余蛋白质, 其中34%为质膜或质膜相关蛋白质. 优化和评估了质膜蛋白质组研究的方法, 且对鼠肝质膜蛋白质组进行了系统的分析.     

鼠肝质膜蛋白质组研究的方法评估

细胞质膜是细胞中重要的细胞器, 在肝功能的发挥中具有非常重要的作用. 使用蔗糖密度梯度离心纯化细胞质膜, 通过电子显微镜观察和免疫印迹法检验膜的纯度. 结果显示, 与组织匀浆成分相比, 质膜富集了20倍, 线粒体的污染减少了约50%. 提取的蛋白质用二/一维凝胶电泳(2DE/1DE)分离、胰酶酶解、电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定, 或者提取的蛋白质直接进行溶液内酶解、液相色谱串联电喷雾离子阱质谱(LC-LTQ)(鸟枪法)鉴定. 一共鉴定了547个非冗余蛋白质, 其中34%为质膜或质膜相关蛋白质. 优化和评估了质膜蛋白质组研究的方法, 且对鼠肝质膜蛋白质组进行了系统的分析.     

转C4光合酶基因水稻株系的抗光氧化特性

用经转入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)、NADP-苹果酸酶(NADP-ME)、PEPC+PPDK等酶的基因的水稻株系及原种为材料,研究了光氧化条件下的叶绿素荧光特性和膜脂过氧化.光氧化处理后,与原种相比,转C4光合酶基因特别是转PEPC和转PEPC+PPDK基因水稻株系的PSⅡ原初光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ在照光下的实际光化学效率(ФPSⅡ)和光化学猝灭(qp)下降的比原种少,而非光化学猝灭(qN)增加的比原种多,说明在光氧化条件下,转C4光合酶基因水稻株系吸收的光能中有较多的光能转化为化学能,过剩的光能通过热耗散而减轻光破坏;同时转C4光合酶基因水稻株系诱导产生的的内源活性氧清除酶系超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性比原种高,从而有效清除水稻叶片内的活性氧(O-2、H2O2),使活性氧积累比原种少,因而膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)产生较少.表明转C4光合酶基因特别是转PEPC和转PEPC+PPDK基因水稻株系耐光氧化能力较强.在光氧化条件下,它们的叶绿素和蛋白质含量下降较少,表现出耐光氧化特性.这些结果为应用生物技术创造耐光氧化种质提供了实验依据.     

成熟前后蟾蜍卵母细胞质膜、透明带和卵黄膜蛋白质组份的比较分析

手工分离激素体外诱发成熟的中华大蟾蜍长足卵母细胞质膜和卵黄膜,以及未经激素处理的卵母细胞质膜和透明带,通过SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳,进行膜蛋白质组份比较分析。考马斯蓝染色显示:未经激素处理的卵母细胞,其质膜主要有六条蛋白带子,分子量范围为25K—250K道尔顿;透明带有四条主要蛋白质带,分子量范围为43K—250K道尔顿。激素作用后的成熟卵球质膜蛋白质组份与处理前相同;由透明带衍生形成的卵黄膜,显著增加一种分子量为20K道尔顿的蛋白质组份。卵母细胞膜表面的碘(~(125)I)化反应和电泳分析结果清楚地表明,不论透明带还是质膜,它们的不同分子量蛋白质带都能强烈地标记上~(125)I;去膜卵球部分的蛋白质成份,没有测出任何~(125)I标记峰。证明以上分析的蛋白质组份确是存在于膜的表面。     

用有限酶切法分析蛋白质的氨基酸序列

报道了一个通过有限酶切蛋白质产生多肽片段的方法.蛋白质经单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离和用考马斯亮蓝短暂染色后,切下所需的蛋白质带,将其放入另一个SDS-PAGE凝胶的样品槽内,在电泳过程中该蛋白质被蛋白酶如蛋白酶V8降解,所产生的多肽片段随之被分离.电泳结束后,将多肽片段电印迹至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上.这些多肽片段从PVDF膜上切下后可以直接被用于分析氨基酸序列.该方法能广泛适用于分析一般蛋白质和N端被修饰蛋白质的氨基酸序列.     

冷激条件下预形成副溶血性弧菌生物被膜的发展变化

【目的】生物被膜可附着在食品或医药生物材料表面引起持续性的感染,而现今极少有关于温度变化对预形成生物被膜影响的研究。本文分析了冷激条件下副溶血性弧菌预形成生物被膜的发展变化。【方法】以改进的结晶紫染色法检测生物被膜总量,以改进的超声法和Lowry法量化胞外多糖和蛋白质,以RNA试剂盒提取并纯化生物被膜形成的相关基因。同时,激光共聚焦扫描显微镜直观显示了冷激条件下预形成生物被膜形态结构的变化,并深入分析了生物被膜结构的变化,以及生物被膜结构参数和基因转录的相关性。【结果】在冷激条件下,副溶血性弧菌生物被膜总量增加,同时,副溶血性弧菌预形成的生物被膜胞外多聚物的主要成分胞外多糖和蛋白质也逐渐增加,被膜形成相关鞭毛基因和毒力基因的转录活跃。生物被膜的平均厚度(MT)、平均扩散距离(ADD)、孔隙率(P)、生物被膜粗糙度(BR)和均匀性(H)在冷激过程中也发生了变化,同时这些参数之间存在显著相关性(P<0.01),而生物被膜结构参数与生物被膜相关基因转录的相关性较弱(P<0.05)。【结论】因此,4°C和10°C冷激不能完全抑制副溶血性弧菌预形成生物被膜的生长,风险评估人员在制定控制食源性感染风险的战略时应考虑到这一因素。     

TMD2前断裂CFTR翻译后的连接及氯离子通道功能

CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化(CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因,旨在研究翻译后水平CFTR的连接,以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域(TMD2)前的Glu838密码子后将其cDNA断裂为N端和C端两部分,与具有蛋白质反式剪接作用的split Ssp DnaB intein编码序列融合,分别插入到载体pEGFP-N1和pEYFP-N1,构建一对真核表达载体pEGFP-NInt和pEYFP-IntC。用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞(BHK),瞬时表达实验用Western blotting观察CFTR蛋白质的连接,并用膜片钳技术记录Cl-通道电流。结果显示,基因共转染细胞呈现完整的CFTR蛋白条带,膜片钳记录到全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性。结果表明split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术可用于双载体共转移CFTR基因,为CF基因治疗应用双腺相关病毒载体(AAV)转运CFTR基因,克服AAV的容量限制提供了依据。     

蛋白质跨膜运送研究的新进展

本文对(1)分泌蛋白质、线粒体蛋白质跨膜运送的新进展,(2)蛋白质跨膜运送过程中的解折叠、重折叠与分子伴侣以及(3)蛋白质跨膜运送的机理研究概况作了扼要的介绍。     

细胞内蛋白质运输及神经递质释放的分子机理

细胞内蛋白质及神经递质等生物活性物质的运输,分泌和释放都是以运输囊泡作为载体,经过运转囊泡的出芽,形成,移位,入坞等步骤,最终与靶膜融合将内容物排出,这些过程都是以动转囊泡膜,胞浆和靶膜的多种不同功能的蛋白质相互作用的结果。     

向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用

目的评价向下转膜法在乙肝病毒(HBV)Southern杂交中的应用效果。方法用带有1.3倍HBV基因的真核表达载体转染HepG2细胞,使其产生瞬时HBV表达,72小时收集细胞并提取细胞总DNA,琼脂糖凝胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交,判断产生明显HBV杂交条带所需的细胞总DNA量,从而验证向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用效果。结果发现向下转膜后,检测HBV表达所需的细胞总DNA量极少,灵敏度高,0.5μg细胞总DNA电泳后转膜,即可检测出HBVDNA的表达,凝胶中仅有8%的DNA残留;而向上转膜所需的总DNA量大,灵敏度低,25μg的细胞总DNA电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论向下转膜法是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的Southern杂交,值得推广应用。     

用于免疫印迹法的生物素化标准分子量蛋白质的制备

免疫印迹技术目前已被广泛应用。确定抗原分子量通常使用标准分子量蛋白平行电泳并转移至NC膜,切下相应条带用氨基黑等染料染色,不但费时,敏感性低,而且在染色和脱色时易引起NC膜的皱缩。1986年Della-Penna等报告用生物素化蛋白作为蛋白质印迹(Western blots)的分子量标准品。目前国外已有商品出售,但价格较贵。本文利用国产低分子量标准蛋白质和自制N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯制备生物素化蛋白取得满意结果。     

棉铃虫围食膜的蛋白质组鉴定

【目的】围食膜(peritrophic membrane, PM)是昆虫抵御随食物摄入的病原微生物入侵的第一道天然屏障。本研究旨在鉴定出农业重大害虫棉铃虫Helicoverpa armigera围食膜的总蛋白成分,为进一步揭示昆虫围食膜的形成机制及研发新颖的害虫控制策略奠定基础。【方法】剥离棉铃虫5龄幼虫PM,用三氟甲磺酸(trifluoromethane sulfonic acid, TFMS)处理,采用液质联用技术(LC-MS/MS)鉴定围食膜蛋白质组,然后对鉴定结果进行生物信息学分析。【结果】本研究共鉴定出棉铃虫幼虫围食膜蛋白质169个,是目前鉴定最多的棉铃虫围食膜蛋白。通过GO分析,可以将这些鉴定的蛋白分为细胞组分、分子功能和生物学过程三大类;KEGG富集结果显示,鉴定蛋白可以富集在12条代谢通路中;蛋白互作分析(protein protein interaction, PPI)结果表明,以ACC和CG3011等蛋白为核心可以形成蛋白互作网络。【结论】本研究鉴定了169个棉铃虫幼虫围食膜蛋白质,并对其进行了GO, KEGG和PPI分析,结果有助于人们全面理解昆虫围食膜的分子结构和功能。     

谷氨酰胺转胺酶—理化性质、生产方法及其在食品工业中的应用

谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ谷氨酰胺转移酶EC2.3.2.13)催化体外大多数食品蛋白质的交联反应,如:酪蛋白,大豆蛋白,肌球蛋白,肌动蛋白,谷蛋白,禽蛋蛋白等等。通过催化肽键谷酰胺基残基的酰基转移反应,在各种蛋白质分子之间或之内形成ε-(γ-谷胺酰)赖氨酸键,从而改善各种蛋白质的功能性质。如:营养价值、质地结构、口感、贮存期等等。目前,商业化谷氨酰胺转胺酶主要从动物组织中提取,但由于其分离和纯化过程较复杂,且来源稀少,因而价格昂贵,近年来,人们开始转向于研究利用微生物发酵来生产谷氨酰胺转胺酶,并使之应用于食品工业,经过微生物谷氨酰胺转胺酶处理后的食品,其功能性质明显改善。本文就谷氨酰胺转胺酶的国内外研究现状作一综述,主要包括理化性质、生产及其应用。     

湿地植物根表铁膜研究进展

为了适应渍水环境,许多湿地植物都具有根系泌氧、形成铁膜的能力。因铁膜具有特殊的物理或化学结构,可以通过吸附和共沉淀作用影响元素在土壤中的化学行为和生物有效性,在植物吸收营养元素和重金属中起重要作用。综述了湿地植物根表铁膜的形成、影响因素以及根表铁膜对营养元素和重金属的生态环境效应,从表征技术方面阐述了根表铁膜的作用机制。对今后的研究方向给出如下建议:(1)扩大研究领域;(2)铁膜形成的动态变化过程;(3)铁膜对植物生理形态的影响;(4)利用先进的表征技术以确定铁膜的作用机制。     

利用核糖体展示技术筛选功能性蛋白质方法的建立

核糖体展示(ribosomedisplay)是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具.利用体外转录和翻译偶联系统可以方便而快捷地完成核糖体展示.筛选系统利用一对能够紧密结合的蛋白质:人锚蛋白(ankyrin)和红血球膜带3蛋白细胞质区域(cytoplasmicdomainoferythrocytemembraneproteinBand3,Cdb3)作为模式分子,希望利用cdb3蛋白通过核糖体展示亲和选择得到锚蛋白基因.用于核糖体展示的人锚蛋白基因结构由组装PCR构建,通过PCR技术引入核糖体展示所需的结构元件.在亲和筛选步骤后,只能利用红血球膜带3蛋白筛选得到锚蛋白基因,而不能利用对照牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)筛选得到,从而说明建立的核糖体展示技术能够正常发挥作用.