cmv-3’LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响

为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3’端长末端重复序列(long-terminal repeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3’端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG-egfp和MFG-egfp-cmv表达载体。结果显示：利用cmv启动子替代MFG载体3’端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达。提示利用cmv启动子替代病毒载体的3’端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloney murineleukemi virus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示：在MoMLV逆转录病毒3’端LTR限的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列。     

核骨架基质结合区(S/MAR)提高逆转录病毒载体介导egfp在NIH3T3细胞中的表达

为减轻逆转录病毒介导的外源基因的沉默 ,进一步提高逆转录病毒MFG载体介导的转移基因的表达 ,将人 β INF基因上游 80 0bp的核骨架基质结合区 (S MAR)分别反向和正向克隆至MFG载体 3′LTR上游 ,以egfp为报告基因观察S MAR对egfp基因表达水平以及对病毒滴度的影响 .结果显示 :反向和正向的S MAR在瞬时表达的情况都不能提高egfp的表达 ,但在稳定整合的情况下反向S MAR可明显提高egfp在NIH3T3细胞内的表达 ,而正向的S MAR作用不明显 ,另外反向S MAR可明显提高MFG逆转录病毒载体的滴度约 5倍 ;因此改造后的MFG逆转录病毒载体将能更好地用来介导外源治疗基因的表达 .同时还观察到 ,同一个载体骨架在稳定表达的情况下 ,磷酸钙介导较逆转录病毒载体介导的表达水平高 .提示逆转录病毒的生活史可能参与其介导的外源基因的沉默     

自我失活型逆转录病毒载体在衰老基因转录调控中的应用

以自我失活型逆转录病毒载体pSIR为基础,构建了含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的载体pSIR-EGFP和含有870bp p16启动子载体pSIR-EGFP-870.将两种病毒载体转染至包装细胞包装成病毒颗粒.病毒感染2BS靶细胞,病毒5′LTR在逆转录过程中自我灭活.通过该系统观察到p16启动子在2BS细胞衰老过程中,转录活性明显增强.结果表明,自我失活型逆转录病毒载体能很好地用于衰老基因转录调控的研究.     

自我失活型逆转录病毒载体在衰老基因转录调控中的应用

以自我失活型逆转录病毒载体pSIR为基础，构建了含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的载体pSIR-EGFP和含有870bp p16启动子载体pSIR-EGFP-870.将两种病毒载体转染至包装细胞包装成病毒颗粒.病毒感染2BS靶细胞，病毒5′LTR在逆转录过程中自我灭活.通过该系统观察到p16启动子在2BS细胞衰老过程中，转录活性明显增强.结果表明，自我失活型逆转录病毒载体能很好地用于衰老基因转录调控的研究.     

用杆状病毒载体在昆虫细胞内大量合成Ⅰ型人T细胞白血病病毒功能性P40~x蛋白

人类Ⅰ型T细胞白血病病毒(HTLV-1)是嗜T淋巴细胞病毒,它与一种特殊形式的成人T细胞白血病有关,HTLA-1基因组3′端编码产物-p40~x是一种4万道尔顿的多肽,对HTLV-1长末端重复序列(LTR)内启动子的转录有强的反式激活作用(trans-activation),因而它为病毒复制所必需。 目前已知利用杆状病毒载体表达的外源基因产物有10多种。为了获得足量蛋白以研究p40~x的结构及作     

PI3KγmRNA 3′非翻译区可能存在基因表达负调控区

为探索人磷脂酰肌醇 3 激酶γ(phosphoinositide 3 kinasePI3Kγ)基因 3′端非翻译区内AU富含区是否在基因表达调控中起作用 ,首先通过生物信息学分析发现在其 3′端非翻译区 (UTR)内存在0 9kb的AU富含区 ,其中包括 4个AU富含元件 ,以及 1个与众多基因非翻译区高度同源的长 130个碱基的区域 .将AU富含区插入报告基因egfp的下游构建pcDNA3 egfp AUR表达载体 .将表达载体转导NIH 3T3,74 0 2及K5 6 2细胞 ,流式细胞检测egfp的表达情况 .PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区可显著降低egfp的表达 2～ 3倍 (P <0 0 1) .利用放线菌素D阻断RNA转录后 ,Northern印迹分析结果显示egfp AURmRNA较egfpmRNA不稳定 .实验结果提示 ,PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区内可能存在转录后水平的基因表达负调控区 ,该负调控区可在一定程度上加速mRNA的衰变     

PI3KγmRNA 3′非翻译区可能存在基因表达负调控区

为探索人磷脂酰肌醇 3 激酶γ(phosphoinositide 3 kinasePI3Kγ)基因 3′端非翻译区内AU富含区是否在基因表达调控中起作用 ,首先通过生物信息学分析发现在其 3′端非翻译区 (UTR)内存在0 9kb的AU富含区 ,其中包括 4个AU富含元件 ,以及 1个与众多基因非翻译区高度同源的长 130个碱基的区域 .将AU富含区插入报告基因egfp的下游构建pcDNA3 egfp AUR表达载体 .将表达载体转导NIH 3T3,74 0 2及K5 6 2细胞 ,流式细胞检测egfp的表达情况 .PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区可显著降低egfp的表达 2～ 3倍 (P <0 0 1) .利用放线菌素D阻断RNA转录后 ,Northern印迹分析结果显示egfp AURmRNA较egfpmRNA不稳定 .实验结果提示 ,PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区内可能存在转录后水平的基因表达负调控区 ,该负调控区可在一定程度上加速mRNA的衰变     

不同病变型J亚群禽白血病病毒LTR启动子序列分析及活性比较

从ALV-J中国地方分离株SCAU-HN06株(血管瘤病变型)、NX0101株和JS-nt株(骨髓瘤病变型)病毒的细胞培养物提取前病毒DNA,通过PCR扩增各毒株的LTR并克隆,随后进行测序分析。与国内外ALV-J参考毒株LTR序列比较发现:国内地方分离株与英国ALV-J原型株HPRS-103和美国ALV-J原型株ADOL-7501的LTR核苷酸序列相似性为88.0%~97.2%;LTR中的U5区及R区具有较高的保守性,而U3区内存在较大差异。将不同病变型ALV-J的LTR片段分别插入pCAT-basic载体CAT报告基因5'端。用所得的重组报告基因表达质粒转染DF-1细胞,48h后通过测定转染细胞中的CAT表达量来评价LTR启动子的活性。结果表明,SCAU-HN06株与骨髓瘤病变型ALV-J(JS-nt株,NX0101株)LTR启动子活性差异不显著。     

核基质结合区的位置对转基因表达的影响

为研究核基质结合区 (MAR）序列不同插入位置对转基因表达作用的影响,PCR扩增人β 珠蛋白MAR分别插入到含氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）报告基因真核表达载体pCATG表达盒两侧、5′端及3′端.酶切鉴定后,用阳离子聚合物转染CHO细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,ELISA分析CAT基因的表达水平,半定量PCR分析CAT基因相对拷贝数.结果表明,表达盒两侧含MAR序列的载体能提高介导的转基因表达水平平均提高10.4倍,5′端含MAR序列的载体表达水平平均提高3.9倍,3′端含MAR序列的载体反而降低转基因表达水平.5′端含MAR序列的表达载体其转基因相对拷贝数高于其它两组载体的基因拷贝数,转基因表达量与基因拷贝数不成正比.     

利用Ⅱ型启动子转录的U6 RNA提高植物病毒表达载体在植物中表达外源基因的水平

Ⅱ型启动子转录的外源短链RNA可以竞争性抑制细胞内源mRNA的核质转运,因而可能会提高植物RNA 病毒载体表达的外源基因在植物中的积累. 为了验证这一假说,利用OE-PCR技术合成拟南芥U6-1核内小RNA序列,并构建其Ⅱ型启动子转录的植物表达载体. 以农杆菌渗滤技术,与烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）表达载体共接种寄主植物本氏烟,通过对报告基因绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）的荧光观察,并以Western印迹和ELISA测定GFP在烟草中的表达情况,分析共表达Ⅱ型启动子转录的U6 RNA对外源基因在植物中表达的作用效果. 结果表明,共接种Ⅱ型启动子转录的U6 RNA对TMV病毒表达载体表达外源基因的水平有明显的增效作用,推测RNA核质转运干扰是提高外源基因表达的可能机制.     

甜瓜黄瓜素基因启动子表达载体的构建及分析

该研究构建了由黄瓜素基因5′端310bp启动子序列驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的植物表达载体pPZP-CGN,通过花粉管通道法将植物表达载体pPZP-CGN导入甜瓜,并采用荧光法定量测定转基因植株中GUS活性。结果显示,gus基因在果实中高表达,而在根、茎、叶等组织中表达活性很低,表明黄瓜素基因上游310bp启动子具有指导外源基因在果实中高效特异表达的特性。     

表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建

目的：构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法：将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒（HIV-1）的5′端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ包装信号、HIVRev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、AU3／3′LTR、牛生长激素（BGH）基因poly（A）依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果：酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论：为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。     

HIV-1 Gag蛋白的高效表达调控研究

LTR位于HIV前病毒同DNA基因组的两末端,Gag基因位于5′端LTR的下游。LTR对转录的调控作用主要是由5′端LTR进行的。LTR具有启动子的作用,在结构上具有真核启动子的典型特征。另外,HIV-1 Gag蛋白还有能够自我装配成病毒样粒子(virus like particle,VLP)并从细胞中释放出来的重要特性。 我们利用痘苗病毒表达系统,探索了在细胞质环境中LTR中的多种功能结构对Gag蛋     

用于靶向于NFAT的免疫抑制类小分子化合物筛选的细胞模型的建立

建立IL-2启动子以及NFAT-AP1增强子调控报告基因包括D2egfp或Luciferase在Jurkat细胞中瞬时表达的细胞模型。首先,利用三步连接将IL-2-promoter -255～+285处的序列插入到Pnf-Κb-D2egfp表达载体启动子上游,形成3个拷贝的前后串联的增强子序列;然后从人外周血钓取两条IL-2-promoter序列,包括-326～＋46以及-89～＋46两段基因组序列,分别替代上述重组表达载体中的TK minimal promoter, 构建所需的IL2 promoter以及NFAT-AP1 enhancer调控的报告基因表达质粒：3×NFAT-AP1-IL-2P/D2egfp和3×NFAT-AP1-TATA/D2egfp; 最后,分别将3×NFAT-AP1-IL-2P以及3×NFAT-AP1-TATA融合基因克隆到Pgl3-basic载体中,构建相应的Luciferase报告基因表达质粒。利用电转染方法将重组的报告基因表达载体瞬时转入Jurkat细胞后发现,未刺激以及PMA、离子霉素（Ionomycin）单刺激均不能激活下游报告基因的表达,只有PMA和离子霉素联合刺激才能启动D2egfp以及Luciferase的转录表达,并且5μg/Ml FK506预先作用1h能几乎完全阻断刺激剂诱导的无论是IL-2 promoter还是NFAT-AP1enhancer调控的报告基因的表达。实验结果提示,所构建的Jurkat细胞瞬时表达模型可用于靶向于NFAT信号通路的FK506类免疫抑制小分子化合物的初步筛选。     

核衣壳蛋白VP39融合TAT转导肽对杆状病毒转导哺乳动物细胞的影响

为了提高昆虫杆状病毒在哺乳动物细胞中转导基因的效率,构建了重组杆状病毒AcRed-tat和AcRed。两者都能在哺乳动物细胞内表达红色荧光蛋白作为报告基因。同时,AcRed-tat带有HIV-1Tat转导肽、病毒主要衣壳蛋白基因vp39及增强型绿色荧光蛋白(egfp)三者的融合基因,并由杆状病毒多角体启动子表达,能够在昆虫细胞中表达该Tat融合蛋白,并掺入子代病毒粒子。而AcRed作为相应的对照病毒,带有多角体启动子表达vp39和egfp的融合基因。2株病毒分别转导哺乳动物细胞后,利用流式细胞仪检测报告基因的表达水平,发现在CHO和Vero细胞中AcRed-Tat介导的报告基因表达水平明显高于AcRed,而在HEK293细胞中2株病毒介导的报告基因表达水平差异不显著。结果表明Tat转导肽可以提高杆状病毒对一部分哺乳动物细胞的转导效率,为改进杆状病毒-哺乳动物细胞转导载体提供了新的思路。     

增强型绿色荧光蛋白在集胞藻6803中的表达

利用聚球藻7942热休克基因groESL的启动子和报告基因egfp,构建了表达载体pUC-Tegfp并转化集胞藻6803,并通过所制备抗体对转基因藻进行蛋白免疫印迹检测.结果发现,在转基因藻株T-egfp的细胞粗提液中含有能与eGFP抗体特异结合的蛋白质,表明外源增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)在集胞藻6803中成功表达.     

竹节花黄斑驳病毒启动子的缺失分析及功能

竹节花黄斑驳病毒(CoYMV)是侵染单子叶植物竹节花的一 种双链环状DNA病毒,它的启动子可介导外源基因在烟草韧皮部特异表达。为了研究其组织 特异性表达的最佳启动子区域,对CoYMV启动子进行了5′端五种不同长度的缺失分析,用不同长度的启动子片段与GUS基因及NOS3′端转录中止序列构建了全长启动子及5 个缺失启动子序列的六个嵌合GUS基因植物表达载体。利用农杆菌将上述嵌合基因转化烟草 外植体后,每种表达载体都获得了一批转基因烟草植株。转化再生烟草植株的PCR分析、GUS 酶活测定及GUS组织染色的结果表明六种类型的嵌合基因已整合到烟草染色体中,并有五种 表达出GUS活性。缺失到870bp的启动子比全长启动子(1040bp)的活性约高78%,870bp比585bp启动子介导的GUS活性略高但差别不明显,缺失到447和232时GUS活性有明显下 降,但仍具有韧皮部特异表达的特性。当缺失到TATA box附近的44bp时启动子丧失组织特 异性,GUS活性也降低到测不出来的水平。以上结果表明CoYMV启动子从转录起始位点上游 870bp～230bp及232bp下游区分别与启动子的活性和韧皮部组织特异性密切相关,870bp上游可能存在一个负调控序列,所以该启动子的活性和组织特异性的最佳调控区应在87 0bp或585bp的下游区。CoYMV启动子与35S启动子驱动GUS基因在烟草中表达的活性相比, 前者为后者的70%左右,考虑到前者仅在韧皮部细胞表达而后者为组成型表达,所以CoYMV启 动子在韧皮部的活性可能与35S启动子相当或更高。CoYMV启动子在其它转基因植物中驱动外 源基因表达的特点正在研究中。     

创建可视化的家蚕杆状病毒表达系统表达家蚕二分浓核病毒非结构蛋白NS1

重组杆状病毒感染昆虫细胞是表达外源蛋白常用的一种方法。为有效鉴定转染的细胞中是否产生了重组病毒粒子,对质粒pFastBacI进行改造,构建了极早期基因ie1启动子控制的绿色荧光蛋白egfp基因表达盒,以及多角体基因启动子控制的外源DNA的一个通用型双表达载体;通过酶切、连接的方式,将家蚕二分浓核病毒ns1基因连接到多角体启动子下游;在转座酶的介导下,该供体质粒上部分序列可转座到穿梭载体Bm-Bacmid上,进而构建可同时表达egfp和ns1基因的重组杆粒。将构建的该重组杆粒DNA转染BmN细胞,通过观察可视化的绿色荧光信号,可迅速判定转染后的细胞中重组病毒粒子产生的情况,收集转染后的细胞培养上清,将其感染BmN细胞,对感染4 d后的细胞总蛋白进行Western blotting分析,结果表明能杂交到一条36 kDa大小的特异蛋白,表明NS1蛋白成功获得了表达,进而为深入研究ns1基因的功能奠定了基础。     

禽网状内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能

通过PCR方法,将禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)扩增并克隆进pUC-18质粒多克隆位点(MCS)的EcoR I和SacI之间,并以BGH基因的多聚腺苷酸序列作为终止子克隆到SphⅠ和Hind Ⅲ之间,构建成重组质粒pUC-LTR.将GFP基因和REV囊膜糖蛋白gp90基因分别克隆到pUC-LTR载体中,获得质粒pUC-LTR-GFP和质粒pUC-LTR-gp90.重组质粒经转染48h,能够检测到外源基因的表达.本研究提示,REV LTR能够作为启动子构建表达质粒.     

应用绿色荧光蛋白研究外源基因在造血细胞的表达调控

以增强型绿色荧光蛋白为报道分子,研究双基因逆转录病毒载体介导小鼠骨髓细胞的基因转移中,SV(simianvirus)40启动子和内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)对双基因共表达的影响。构建双基因中间序列分别为SV40启动子和IRES的载体pLESN和pLEIN。经包装获得较高滴度的病毒上清,以共培养的方式感染5-氟尿嘧啶预刺激的小鼠骨髓细胞。流式细胞仪检测表明转染效率约25%,PCR证明EGFP基因整合至骨髓细胞基因组。半固体培养转基因细胞7d,LEIN组获得具有G418抗性的集落中98%表达绿色荧光,而LESN组54%。结果表明:在双基因逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓细胞的基因转导中,IRES与内部SV40启动子相比,更能保证双基因的共同表达。