抗肿瘤药物对造血干细胞和肿瘤干细胞作用的定量研究

干细胞是指能无限自我复制的原始细胞。本文综合介绍了目前有关造血干细胞和肿瘤干细胞的定量研究方法,概述了采用脾集落形成法、体外软琼脂集落形成法和扩散盒及琼脂扩散盒方法获得的常用抗肿瘤药物对两类干细胞作用的资料。     

昆明白小鼠胚胎干细胞分离与体外培养

为探索昆明白小鼠胚胎干细胞建系方法,将受孕4.5天的昆明白小鼠囊胚用免疫手术法去除滋胚层,然后将内细胞团(ICM)接种于胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,形成的胚胎干细胞样集落用胰蛋白酶-EDTA消化法传代,培养后进行相差显微镜观察及碱性磷酸酶染色。结果饲养层上生长的ICM细胞呈典型的ES样细胞集落,传至第8代碱性磷酸酶染色呈强阳性。实验表明免疫手术法适用于昆明白小鼠ES细胞建系,获得的细胞集落具有ES细胞的主要生物学性状。     

体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞的生长特点和诱导条件下的成骨能力。方法通过密度梯度离心和贴壁培养法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、p甘油磷酸纳和维生素c的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化并检测碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。结果原代培养基质干细胞首先形成细胞集落,14d时集落间接近融合;传代细胞体积变大,约5～7d传代一次。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,成骨能力肯定,可作为骨组织工程的种子细胞。     

多因素对昆明小鼠胚胎干细胞原代集落形成和后期增殖的影响

目的：研究细胞因子LIF、EGF、bFGF和肝素钠,以及氧分压、温度等多因素对昆明系小鼠胚胎干细胞（KM-ESC）原代集落形成和后期增殖的影响。方法：本研究选择LIF、EGF、bFGF、肝素钠、5%O2,20%O2和37℃、39℃作为研究条件。并检测不同情况下小鼠胚胎干细胞原代集落形成和后期增殖情况。结果：LIF对KM-ESC原代集落形成和后期增殖具有显著促进作用,极显著高于EGF、bFGF和肝素钠组（P〈0.01）。温度对KM-ESC原代集落形成和增殖具有显著影响,39℃条件下,原代集落形成率、直径和后期增殖显著高于37℃（P〈0.05）;而氧分压对KM-ESC原代集落形成无显著作用（P〉0.05）,但是对原代集落直径和后期增殖有一定促进作用,20%O2组显著高于5%O2组（P〈0.05）。结论：LIF、EGF、bFGF、肝素钠、39℃、20%O2对小鼠胚胎干细胞原代集落形成和后期增殖具有显著促进作用。     

多因素对昆明小鼠胚胎干细胞原代集落形成和后期增殖的影响

目的:研究细胞因子LIF、EGF、bFGF和肝素钠,以及氧分压、温度等多因素对昆明系小鼠胚胎干细胞(KM-ESC)原代集落形成和后期增殖的影响。方法:本研究选择LIF、EGF、bFGF、肝素钠、5%O2,20%O2和37℃、39℃作为研究条件。并检测不同情况下小鼠胚胎干细胞原代集落形成和后期增殖情况。结果:LIF对KM-ESC原代集落形成和后期增殖具有显著促进作用,极显著高于EGF、bFGF和肝素钠组(P<0.01)。温度对KM-ESC原代集落形成和增殖具有显著影响,39℃条件下,原代集落形成率、直径和后期增殖显著高于37℃(P<0.05);而氧分压对KM-ESC原代集落形成无显著作用(P>0.05),但是对原代集落直径和后期增殖有一定促进作用,20%O2组显著高于5%O2组(P<0.05)。结论:LIF、EGF、bFGF、肝素钠、39℃、20%O2对小鼠胚胎干细胞原代集落形成和后期增殖具有显著促进作用。     

一种简便的小鼠精原干细胞分离培养方法

采用一步酶消化法分离小鼠精原干细胞,比较α-MEM、DMEM培养基对体外培养的精原干细胞生长状态的影响,对精原干细胞集落进行形态观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色和免疫组化鉴定,并诱导精原干细胞向精子细胞分化。结果显示,以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,用α-MEM培养的精原干细胞集落较大且呈葡萄串状或念珠状,细胞状态较好;小鼠精原干细胞集落的AKP染色阳性呈紫红色;在红色荧光下精原干细胞集落的Oct-4核蛋白表达为阳性、膜蛋白c-Kit、β_1-integrin和Gfrα-1表达为阳性;精原干细胞经维甲酸(all-trans-retinoic-acid,RA)诱导可初步分化成精子样细胞。因此,采用一步酶消化法能够分离小鼠精原干细胞,α-MEM更适合小鼠精原干细胞体外培养。     

人脐带间充质干细胞对肿瘤细胞生长及软琼脂克隆形成的影响

目的研究人脐带间充质干细胞(h UCMSC)体外共培养对肿瘤细胞增殖的影响以及在软琼脂中形成克隆的可能性,从而评价其体外促瘤性和致瘤性,为其体内致瘤性研究及临床应用提供安全性数据。方法剥取脐带华通氏胶,剪碎,组织块贴壁法获得贴壁细胞,培养传代,倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表型,检测诱导成脂肪和成骨及成软骨分化的能力,鉴定是否为h UCMSC。然后,通过体外软琼脂克隆形成实验观察h UCMSC形成集落的能力;h UCMSC分别与人白血病细胞株K562和人结肠癌细胞株Colo-205体外共培养,MTT法测定细胞增殖,并以肿瘤细胞的增殖指数(PI)值来判定h UCMSC是否对肿瘤细胞体外增殖有影响。结果人脐带华通氏胶分离培养的细胞具有成纤维细胞样的细胞形态,具有向成脂肪和成骨及成软骨方向分化的能力,表达间充质干细胞指标CD73、CD90、CD105,低表达CD34、CD45、CD19,符合间充质干细胞特点。软琼脂克隆形成实验显示h UCMSC未表现出在阻力介质中的克隆生长能力。h UCMSC分别与人白血病细胞K562和人结肠癌Colo-205细胞共培养,PI值显示h UCMSC对肿瘤细胞增殖没有影响。结论 h UCMSC体外培养不具有致瘤性,同时对肿瘤细胞增殖无影响。     

昆明小鼠胚胎干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的:建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)滋养层,用于昆明小鼠胚胎干细胞的培养。方法:取妊娠13.5的胎鼠,采用组织消化法分离培养出原代成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线及分裂指数进行观察;MTT法筛选丝裂霉素C(MMC)作用的最佳浓度和时间;取妊娠3.5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果:MEFS为一种贴壁生长且增殖速度较快的细胞,第三代细胞增殖旺盛,第5代以后细胞开始变形并趋于衰老;MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是10ug/ml作用2.5～4h,20ug/ml作用1-2.5h。妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成典型的"鸟巢"状干细胞集落,并可维持胚胎干细胞的正常形态且不发生分化。结论:这种方法制备的滋养细胞层适用于胚胎干细胞的培养。     

抑制MTM1表达促进胚胎干细胞分化

应用随机RNAi文库,筛选了与胚胎干细胞自我更新和分化调控相关基因,发现了多个阳性候选基因,对其中的1个阳性候选基因肌管素1（myotubularin, MTM1）基因进行了深入研究．MTM1是属于蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）蛋白家族的蛋白,其基因突变导致肌管性肌病．MTM1在胚胎干细胞中的功能到目前为止还不清楚．研究证实,MTM1在小鼠胚胎干细胞系CCE和R1均有表达．应用RNA干扰及集落形成实验证明,MTM1表达抑制后,处于自我更新状况胚胎干细胞集落的比例显著增加,提示MTM1在胚胎干细胞自我更新和分化的调控中起了重要的作用．     

骨髓间充质干细胞无血清培养

为建立一种化学成分明确的、能用于体外扩增骨髓间充质干细胞的无血清培养基, 且骨髓间充质干细胞经无血清培养扩增后仍能保持其多向分化的潜能。采用密度梯度离心结合贴壁法从1月龄新西兰大白兔股骨中分离骨髓间充质干细胞, 比较在含10%胎牛血清的培养基(SCM)和自制的化学成分明确的无血清培养基(CDSFM)中骨髓间充质干细胞的形态、增殖能力, 以及扩增后的骨髓间充质干细胞的细胞周期、集落形成能力和成骨、成脂肪分化能力。经过10 d的培养, 骨髓间充质干细胞在自制的无血清培养基中扩增了50倍, 在含10%胎牛血清的培养基中扩增了40倍。在无血清和有血清培养基中扩增后的细胞中G0/G1期比例分别为(80.31%±0.6%)和(75.24%±4.0%), 两者无显著差异(P>0.05)。无血清培养扩增后的骨髓间充质干细胞集落形成率(12.7%±4.0%)低于有血清培养组(28.7%±4.2%), 两者比较差异显著(P<0.01)。经过无血清培养扩增的骨髓间充质干细胞在成骨、成脂肪诱导分化培养基中能够分化成成骨和脂肪细胞。自制的化学成分明确的无血清培养基能够在体外培养扩增骨髓间充质干细胞, 并且维持其干细胞特性, 可以用于细胞治疗以及生物医学研究。     

造血干细胞发生学研究——Ⅰ.人胚肝造血干细胞

人卵黄囊的血管内造血已被细致地观察过。卵黄囊的造血停止,肝成为主要的造血器官。肝造血持续到胎生7个月为止。Fukuda,T.在电镜观察中看到了肝造血中出现未分化的单个核细胞,提出预期的干细胞(presumptive stem cell)一词。近来有人对人胚造血提出卵黄囊、肝及骨等组织的造血三阶段。国内进行了胚肝扩散盒培养细胞的电镜观察,开展了各种因素对造血干细胞的调控研究。迄今为止对造血干细胞的发生学尚乏定     

混合培养体系中间充质干细胞与造血干细胞生物学特性

为了体外同时获得符合鉴定标准的造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSC/HPC)和间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),本研究采用Ficoll淋巴细胞分离液方法从脐带血中分离出脐带血单个核细胞,MACS免疫磁珠法分离出CD34~+的造血干细胞。分离出的细胞与MSC同时接种在培养瓶中,利用15%AB型脐血浆的IMDM培养基添加白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)、IL-6、血小板生成素(thrombopoietin,TPO)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)和Flt-3配体(FMSlike tyrosine kinase 3 ligand,Flt-3L)因子培养体系来同时培养扩增HSC/HPC和MSC。为了评估扩增出的HSC/HPC和MSC是否符合细胞鉴定标准,本研究通过倒置显微镜观察HSC/HPC和MSC生长状态,并计数细胞。流式细胞仪检测HSC/HPC表面抗原CD34阳性百分率,检测第4代(P4)MSC表面抗原CD105、CD90、CD73、CD45、CD34和HLA-DR阳性表达率。半固体集落培养检测HSC/HPC的粒细胞-巨噬细胞集落形成能力。将共培养至P4的MSC行成骨、成软骨、成脂肪诱导鉴定。通过秋水仙素法进行MSC核型分析。结果显示,体外共培养的HSC/HPC依然有高增殖能力、集落形成能力和CD34阳性百分率。MSC具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞诱导分化的能力。MSC染色体核型维持稳定。以上结果提示本研究成功建立了一种合适的MSC和HSC/HPC混合培养体系,通过该体系可同时获得两种干细胞,共培养后的MSC依然有典型的MSC的生物学功能;共培养后的HSC/HPC的粒细胞-巨噬细胞集落培养、细胞数量和流式表型符合鉴定标准,HSC/HPC生物学功能没有受到影响。     

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞（male germ stem cells, mGSCs）来源于原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs),且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到 95.8%。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示：SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明：20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干（embryonic stem, ES）细胞。     

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞(male germ stem cells , mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells ,PGCs) ,且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs ,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到95.8 %。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示:SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament ,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明:20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干(embryonic stem,ES)细胞。     

胎肝干细胞的分离、培养与鉴定

目的体外扩增培养大鼠胎肝干细胞,研究其形态、生物学特性及表面标志物,探讨胎肝干细胞的性质。方法分离培养胎龄12-16d的胎肝细胞,SABC法检测原代、传代后及细胞克隆中的肝干细胞特异表面标志物OV-6、CK-19及nestin的表达。结果原代、传代培养的胎肝细胞部分表达OV-6、CK-19及nestin;培养3d开始出现小细胞团,1个月即形成肉眼可见的细胞集落,5-7d传代一次;细胞克隆几乎全部为干细胞标志阳性细胞。结论胎肝干细胞可通过克隆筛选法进行体外扩增,胎肝内存在nestin阳性干细胞,可能是一种更为原始的干细胞,在胚胎发育中起重要作用。     

胚胎干细胞建系方法

胚胎干细胞具有的独特特征———分化全能性是生物学各研究领域多年来的热点之一。胚胎干细胞独特的生物学特征在生殖细胞与体细胞及动物个体之间建立了广泛的联系。胚胎干细胞应用前景有着巨大的潜力。为此,对其培养建系的完善性研究显得格外重要。在此,对胚胎干细胞建系方法方面做一简要综述,尤其对建系过程中内细胞团的分离方法及干细胞集落的获取方法进行探讨。     

肌间隙移植明胶海绵获取成体干细胞

通过移植生物材料到小鼠体内而建立一种新的干细胞获取方法.移植明胶海绵到小鼠后肢的大腿内侧肌间隙,12天后分离明胶海绵中的迁移细胞.海绵来源干细胞形态、增殖能力、多向分化能力与骨髓源干细胞相似,但海绵中成纤维细胞集落形成单位的比例(82.2±10.6/105)远远高于骨髓中的比例(43.7±7.4/106)(P＜0.05...     

山羊精原干细胞体外培养分化

探索山羊精原干细胞体外培养体系。收集2月龄关中奶山羊睾丸,一步酶法消化分离曲细精管细胞,台盼兰检测平均存活率82.7%,以1×106个/ml接种含15%胎牛血清DMEM/F12培养瓶,37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养,4周后FBS逐渐降至10%。原代培养以多突起和片状的睾丸体细胞铺壁生长为主,10天左右精原干细胞数量增加,可见二联体和四联体,3周左右有鸟巢状和山脉状集落形成,碱性磷酸酶染色阳性,培养30天集落数不断增加,散在分布有贴壁和漂浮精子,换液后精子丢失。挑取单集落重新接种铺壁的曲细精管体细胞饲养层后陆续有精子细胞及精子形成,主要分布于集落周围。     

循环血中GM-CFC的性能研究

利用造血细胞体外琼脂培养技术,比较了狗的不同来源的GM—CFC增殖、分化性能和辐射敏感性。结果表明,在正常生理条件下循环血中GM—CFC集落产率约为骨髓的1/60;细胞集落开始形成时间较骨髓晚1天,细胞集落随培养时间(前3—5天)增加而增加,其增加速率约为骨髓的20%;辐射敏感性D_0值为0.34Gy,明显低于骨髓中GM—CFC的D_0值(0.82Gy)。造血干细胞动员剂动员后血中GM—CFC数量明显增加,细胞集落增加速率约为骨髓的59%,D_0值为0.72Gy。从而为循环血干细胞移植疗效提供了实验依据。     

用饲养层分离胚胎干细胞集落的实验初探

目的 用饲养层分离胚胎干细胞集落。方法 用胚龄为13~14 d的小鼠胚胎分离原代成纤维细胞,制成饲养层,用于囊胚的培养。结果 小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）贴壁能力较好,增殖快,易铺层。囊胚和内细胞团（ICM）在饲养层上贴壁生长良好,当培养4~5 d时,其增殖率为16/28（57%）。在ICM离散48 h后,各种胚胎干细胞（ES）集落开始出现。此种集落经碱性磷酸酶染色成阳性。结论 用饲养层分离胚胎干细胞获得初步成功。