栽培高梁、甜高梁和拟高梁比较基因组原位杂交分析

用一种植物的总基因组DNA与近缘或远缘物种的染色体杂交,可以研究植物近缘或远缘物种基因组进化关系。以拟高粱总基因组DNA为探针,对栽培高粱、甜高粱基因组进行杂交,结果表明栽培高粱、甜高梁和拟高梁基因组中重复序列存在很大的同源性,基因组进化关系表现出保守性。栽培高粱与拟高粱基因组间重复序列的同源性要比甜高粱与拟高粱间重复序列的同源性高。     

栽培高粱、甜高粱和拟高粱比较基因组原位杂交分析

用一种植物的总基因组DNA与近缘或远缘物种的染色体杂交,可以研究植物近缘或远缘物种基因组进化关系。以拟高粱总基因组DNA为探针,对栽培高粱、甜高粱基因组进行杂交,结果表明栽培高粱、甜高粱和拟高粱基因组中重复序列存在很大的同源性,基因组进化关系表现出保守性。栽培高粱与拟高粱基因组间重复序列的同源性要比甜高粱与拟高粱间重复序列的同源性高。     

垂穗披碱草与达乌里披碱草基因组细胞遗传学比较

采用顺序FISH-GISH技术,12个重复序列探针,包括9个三核苷酸简单重复序列、2个卫星DNA重复序列pSc119.2和pAs1以及5S rDNA,通过重复序列的物理定位对达乌里披碱草和垂穗披碱草基因组中部分重复序列的分布特征进行了比较分析,为进一步研究垂穗披碱草和达乌里披碱草的物种形成及演化提供新的分子细胞遗传学证据。结果表明:(1)所有的序列在这2个物种的染色体上都能产生可检测的杂交信号,且在2个物种中(AAC)_(10)、(ACT)_(10)、(CAT)_(10)都表现为共分布,(AAG)_(10)与(AGG)_(10)表现为近似共分布;2个物种的H基因组除5S rDNA序列外,其他序列都产生强烈且丰富的杂交位点,St与Y基因组不同重复序列探针的荧光位点数目有所差别,表现为5S rDNA、pSc119.2、(AAC)_(10)、(CAT)_(10)、(ACT)_(10)、(CAC)_(10)探针的信号位点较少或无信号,其余的探针信号位点稍多。(2)达乌里披碱草的第2对染色体上具有(AAC)_(10)、(CAT)_(10)、(ACT)_(10)的杂交位点、第6对染色体上具有(CAC)_(10)的杂交位点,而在垂穗披碱草的St基因组中未观察到上述序列杂交位点;达乌里披碱草St基因组仅有第4对染色体的端部具有pSc119.2杂交位点,而在垂穗披碱草St基因组中的pSc119.2杂交位点位于第5对染色体长臂的间隔区;相对于达乌里披碱草,垂穗披碱草St和Y基因组染色体含有更多的重复序列杂交位点。(3)达乌里披碱草的H/Y基因组间易位在不同材料间是稳定存在的,达乌里披碱草基因组相对稳定,不同材料间H基因组重复序列杂交信号多态性高于St和Y基因组;垂穗披碱草基因组的变异较大,不同材料间St和Y基因组重复序列杂交信号多态性高于H基因组。研究认为,垂穗披碱草和达乌里披碱草的H基因组均起源于布顿大麦,St基因组可能起源于不同的拟鹅观草属物种;与达乌里披碱草相比垂穗披碱草St与Y基因组可能具有更高的染色体结构变异性,而垂穗披碱草St与Y基因组变异较大的原因可能是与同区域分布的含StY基因组的物种发生了种间渗透杂交。     

用实时定量PCR解决基因组序列组装中的重复序列问题

目的:探寻一种简单、经济的方法,解决基因组序列拼接中的重复序列问题。方法:选取序列拼接中遇到重复序列问题的质粒NDM-BTR,在其与重复序列相关的contigs两端设计引物,进行实时定量PCR,通过观察临界循环数来判断contig之间的位置关系。结果:成功判断出质粒contig之间的位置关系,得到了质粒基因组完成图。结论:实时定量PCR法可用于解决基因组序列拼接中的重复序列问题,相比较传统建立大片段文库更加简单、快速、经济。     

大豆重复序列的克隆,特性分析及在染色体上的定位

从大豆栽培品种Ｕｎｉｏｎ（Ｇ．ｍａｘ）基因组ｐＵＣ１８质粒文库中,以基因组ＤＮＡ为探针,筛选出一个重复序列家族。序列分析表明,此重复序列的重复单位为９１ｂｐ,拷贝数约为１０￣５,其序列约占基因组ＤＮＡ的０．９％。基因组ＤＮＡ不同限制酶片段Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析和染色体原位杂交分析表明此重复序列主要以串联方式集中分布在Ｍ２和Ｍ１１号染色体的臂上,而另外一些则散布于整个Ｍ１２和Ｓｍ７号染色体上。以该序列为探针片大豆属不同亚属１３个种的１８个品系的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,此重复序列为Ｓｏｊａ亚属所特有。这一Ｓｏｉａ亚属特异重复序列的发现,从另一个角度支持应把Ｓｏｊａ亚属的３个种Ｇ．ｓｏｊａ、Ｇ．ｇｒａｃｉｌｌｉｓ、Ｇ．ｍａｘ划分为一个种的观点。     

玉米有丝分裂染色体上玉米BAC探针的FISH杂交体系的构建

本研究分别探讨了玉米和水稻基因组c 0t DNA对探针的封阻、杂交后洗脱的严谨度、杂交液中FAD的浓度变化对BAC-FISH杂交的影响;探讨了玉米BAC探针中重复序列含量对FISH信号的影响.初步形成了一套以玉米BAC探针在玉米有丝分裂染色体上进行FISH杂交的优化技术体系.结果表明,玉米基因组c 0t DNA对探针封阻的c 0t值应小于50;而降低杂交液中FAD浓度和适度控制杂交后洗脱的严谨度,尤其是使用水稻基因组的c 0t 100 DNA封阻探针重复序列对BAC-FISH杂交信号特异性的改善具有明显的效果;同时,验证了选择重复序列含量较少的玉米BAC作为FISH杂交的探针也是获得特异性杂交信号的重要条件.     

拟南芥DNA探针的比较基因组原位杂交揭示的拟南芥与远缘植物基因组间的同源性

采用生物素标记的拟南芥基因组DNA探针在75%杂交严谨度下对双子叶植物番茄、蚕豆和单子叶植物水稻、玉米、大麦的染色体进行了比较基因组荧光原位杂交（comparative genomic in situ hybridization,cGISH）分析,以揭示拟南芥与远缘植物基因组间的同源性.cGISH信号代表了拟南芥基因组DNA中的重复DNA与靶物种染色体上同源序列的杂交.探针DNA在所有靶物种的全部染色体上都产生了杂交信号.杂交信号为散在分布,并呈现随基因组增大,杂交信号增多,且分布更加分散的趋势.所有靶物种的核仁组织区（NOR）都显示了明显强于其他区域的杂交信号,表明拟南芥基因组DNA探针可用于植物NOR的物理定位.在所有的靶物种中,信号主要分布在染色体的臂中间区和末端,着丝粒或近着丝粒区有少数信号分布.大麦染色体显示了与C-和N-带不同的独特的cGISH信号带型,表明此探针可用于不同植物染色体的识别.这些结果表明,拟南芥基因组与远缘植物基因组之间,除rDNA和端粒重复序列外,还存在其它同源的重复DNA;一些重复DNA序列在被子植物分歧进化为单子叶和双子叶植物之前就已存在,虽经历了长期的进化过程,至今在远缘物种之间仍保持了较高的同源性.结果还提示,大基因组中古老而保守的重复DNA在进化过程中发生了明显的扩增.     

大赖草总DNA转化小麦的分子证据

用来自大麦组的４个高度重复序列克隆了ｐＨｖ７１６１,ｐＨｖ７１７８９,ｐＨｖ７１９１、ｐＨｖ７２９３,经地高辛和同位素２种方法标记后作为探针,对新疆大赖草（供体）、春麦７６１（受体）以及用大赖草总ＤＮＡ通过花粉管通道转化成功的大穗转化株基因组在高度严谨条件下进行了分子杂交。结果表明,这４个探针可以探查出基因内一种具有主串产重复单位的散在重复序列。比较受共体和转化体的杂交图谱,发现在转化株中出现了     

一种能表现水稻基因组DNA分化特征的重复DNA顺序

用ＤＮＡ 复性动力学方法克隆到一个水稻中度重复顺序。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交、限制性内切酶分析及序列分析资料表明,该重复顺序在水稻基因组中具有串联重复和散布状态两种存在方式。以该ＤＮＡ 片段作探针,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交方法分析了多种野生稻种和栽培稻品种的基因组分化特征。某些限制性内切酶消化过的水稻ＤＮＡ,其图谱呈现出多达４０ 条以上的杂交带,包括强杂交带和弱杂交带两种类型。重复实验结果证明,强杂交带表现为ＢＢＣＣ染色体组型特异而弱带则在栽培稻各品种间显示出丰富的多态性,表明该重复顺序片段在水稻理论研究和育种实践中可能具有重要意义     

实时定量PCR法预测禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis基因组大小

【目的】准确测定基因组大小是进行禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis全基因组序列测定和拼接的基础,本研究旨在利用实时定量PCR方法预测禾谷丝核菌的基因组大小。【方法】首先克隆了禾谷丝核菌R0301菌株翻译延伸因子A基因(tef A)的部分序列,Southern杂交明确该基因在该病菌基因组中为单拷贝。以已测序立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG1-IA融合群菌株GD118为对照,采用实时定量PCR的方法进行了禾谷丝核菌基因组大小的预测。【结果】实时定量PCR的方法可以比较准确的测定立枯丝核菌基因组的大小,研究首次预测了禾谷丝核菌的基因组大小位于32.2–36.6 Mb之间。【结论】实时定量PCR法是一种快速和简便的预测丝核菌基因组大小的方法。     

一个AA基因组特异的串联重复序列的克隆及其在中国普通野生稻和栽？…

从籼稻“窄叶青”中克隆到了１个重复序列（ｐＯｓ１３９）。经分子杂交证明,ｐＯｓ１３９为一稻属内ＡＡ基因组特异的串联重复序列。序列分析表明,ｐＯｓ１３９以３５５ｂｐ为一重复单位。以ｐＯｓ１３９为探针对２９份中国普通野生稻和４３份中国栽培稻的基因组ＤＮＡ进行的分子杂交表现,籼、粳亚种之间具有明显的差异,籼稻杂交带数明显多于粳稻,普通野生稻与籼稻相似,具有较多的杂交带数。拷贝数测定结果表明,ｐＯｓ１３９     

利用栽培稻C0t-1DNA和基因组DNA比较分析斑点野生稻和短药野生稻基因组

通过荧光原位杂交(FISH)利用来源于A基因组栽培稻的中高度重复序列C0t-1DNA和基因组DNA作为探针,对栽培稻、斑点野生稻和短药野生稻进行了比较基因组分析。结果发现C0t-1DNA杂交信号主要分布在这3种染色体的着丝粒、近着丝粒和端粒区域,在斑点野生稻染色体上的信号多于短药野生稻,与gDNA作为探针FISH的结果相一致,说明A和B基因组间的亲缘关系明显近于A和F基因组。确定了含有中高度重复序列的C0t-1DNA用于属内种间关系研究的可行性,并根据C0t-1DNA的FISH结果进行了染色体核型分析。     

利用栽培稻C_0t-1 DNA和基因组DNA比较分析宽叶野生稻基因组

利用AA染色体组栽培稻的中高度重复序列C0t-1 DNA和基因组DNA作为探针,通过荧光原位杂交技术对宽叶野生稻(Oryza latifolia)(CCDD染色体组)进行了比较基因组分析。结果显示,在宽叶野生稻染色体上,C0t-1 DNA的杂交信号没有基因组DNA的杂交信号明显;杂交信号主要分布在着丝粒、近着丝粒及端粒区域;随着洗脱严谨度的不同,杂交信号呈现出较高的种特异性。本研究以不同洗脱严谨度下的荧光原位杂交结果为依据,对宽叶野生稻进行的核型分析,可进一步提高稻属染色体识别的准确性。     

利用栽培稻C0t-1 DNA和基因组DNA比较分析宽叶野生稻基因组

利用AA染色体组栽培稻的中高度重复序列C0t-1 DNA和基因组DNA作为探针,通过荧光原位杂交技术对宽叶野生稻（Oryza latifolia）（CCDD染色体组）进行了比较基因组分析。结果显示,在宽叶野生稻染色体上,C0t-1 DNA的杂交信号没有基因组DNA的杂交信号明显;杂交信号主要分布在着丝粒、近着丝粒及端粒区域;随着洗脱严谨度的不同,杂交信号呈现出较高的种特异性。本研究以不同洗脱严谨度下的荧光原位杂交结果为依据,对宽叶野生稻进行的核型分析,可进一步提高稻属染色体识别的准确性。     

水稻重复DNA顺序克隆pRRD3的研究

用ＤＮＡ复性动力学方法克隆到一个水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）中度重复ＤＮＡ顺序。不同限制性内切酶消化和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析显示,这段重复ＤＮＡ顺序以串联加散布的形式存在于水稻基因组中;序列分析表明在它内部含有一个典型的植物启动子序列ＴＧＴＡＴＡＡＡＴＡ;以ｐＲＲＤ３克隆片段作探针,对水稻３４个品种进行拷贝数测定,在野生稻与栽培稻、籼稻与粳稻之间均存在拷贝数上的明显差异;对ＡＡ基因组不同亚型水稻ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,得到基因组亚型特异的杂交带谱,说明该重复顺序是研究水稻进化和分类的一个有用探针。     

水稻BAC在玉米有丝分裂染色体上FISH杂交体系的构建

 以水稻细菌人工染色体(BAC)为探针在玉米有丝分裂的细胞学制片上进行荧光原位杂交(FISH),探讨玉米基因组C_ot DNA对BAC探针重复序列的封阻、杂交后洗脱的严谨度、杂交液中FAD的浓度变化、水稻BAC探针的特异性重复序列的封阻对FISH杂交信号特异性的影响.初步形成了一套以水稻BAC探针在玉米有丝分裂染色体上进行BAC-FISH杂交的优化技术体系.研究结果表明：使用玉米基因组C_ot DNA来封阻水稻BAC探针的重复序列玉米基因组C _ot DNA的C_ot值应小于50,同时还需根据不同探针调整C_ot DNA的C_ot值及与探针的比例;而降低杂交液中FAD浓度和适度控制杂交后洗脱的严谨度,尤其是使用水稻BAC探针本身特异的重复序列的封阻对BAC-FISH杂交信号特异性的改善具有较好的效果.     

拟南芥与水稻之间简单重复序列的比较分析

利用Perl,C 语言编写了鉴定和分析简单重复序列的一系列程序,在全基因组水平上分析了拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)简单重复序列的分布及简单重复序列和基因的关系。共发现5652个简单重复序列(≥20bp),大约每20.6kb有1个简单重复序列。拟南芥各染色体之间简单重复序列的密度基本一致。拟南芥的27480条编码序列中,只有677条编码序列含有725个简单重复序列,其中的3碱基简单重复序列多数对应的是小的亲水性的氨基酸。在拟南芥和水稻(OryzasativaL.)第4号染色体的高度保守的基因中,简单重复序列却并不保守。通过比较拟南芥和水稻之间简单重复序列的差异,推论出:水稻的全基因组和基因中简单重复序列的密度都比拟南芥大,这可能是水稻基因组序列比拟南芥大的原因之一,水稻基因组中0.21%来自简单重复序列,而拟南芥中只有0.13%;不但不同物种的基因组对简单重复序列的偏好性不同,而且不同物种的基因对简单重复序列的偏好性也不同。在水稻和拟南芥中都发现了一些嵌套性的卫星序列。     

水稻(Oryza sativa L.)核基因组存在叶绿体psbA基因的同源片段

序列比较说明,重复DNA顺序pRRD9与水稻叶绿体基因组中编码QB蛋白的psbA基因存在高度的同源。用pRRD9亚克隆片段pRRD9R和片段pRRD9L对水稻的叶绿体和核DNA进行Southern杂交分析,揭示了psbA基因同源片段在某个进化时期由叶绿体基因组转移到水稻核基因组,而且两者在水稻进化过程中的变异程度存在明显的差异。利用它们对野生稻和栽培稻总DNA的Southern杂交分析,显示亚洲栽培稻与AA基因组型的野生稻有较近的亲缘关系,以及在部分野生稻产生特异的杂交带谱,说明它可以作为一种分子探针来研究水稻的进化问题。     

植物外源基因组成分鉴定方法的研究进展

具外源基因组成分(外源染色体/染色体片段/基因)植株是目前进行基因组学研究以及作物改良的重要材料。迄今为止,已建立了基于性状观测、染色体分析、特异蛋白、DNA序列4种鉴定外源基因组成分的策略。其中,基于DNA序列的分子标记技术是当前鉴定外源基因组成分的主要手段,文中归纳了用于小麦、甘蓝等重要作物外源基因组成分的分子标记,且对简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)、插入缺失(Insertion-deletion,InDel)、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)等9种标记进行了系统的比较。相比单一的鉴定方法,组合法更全面精准,文中对各组合法的应用情况进行统计和分析,提供了小麦族、芸薹族等作物的最佳鉴定组合。新一代分子标记InDel、SNP易实现高通量检测,对于外源渗入基因的精细定位展现了一定的优越性。此外,可以考虑一些新鉴定方法的加入,如微阵列比较基因组杂交(Microarray-based comparative genomic hybridization,array-CGH)、抑制差减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)。     

基因文库的鉴定和应用

由于草菇是一种同宗结合的食用真菌,这给草菇的杂交育种带来了一定的困难。本文在建立草菇部分基因文库的基础之上,对草菇的基因文库进行了鉴定。在草菇基因文库中任意抽取72个克隆,利用专一的PCR方法,测出在草菇基因文库中,草菇基因组DNA的平均大小为1156个碱基对。在基因文库中任意选择53个克隆,利用专一的PCR进行DNA扩增以及dig非同位素标记,用于和草菇基因组DNA杂交。在测试的53个克隆中有8％的高度重复序列,36％中度重复序列和56％的低度重复序列。