孕酮和米非司酮对蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA表达的影响

β-防御素(β-defensin)在雌性动物生殖道广泛存在,起免疫防御作用.为了研究孕酮与雌性生殖道β-防御素mRNA表达的关系,本实验建立绵羊(Ovis aries)输卵管上皮细胞培养体系,添加不同浓度孕酮(10~(-6),10~(-7),10~(-8),10~(-9)和10~(-10) mol/L)和孕酮拮抗剂米非司酮后提取细胞总RNA,利用实时定量PCR测定β-防御素mRNA的相对表达量.结果显示,一定浓度的孕酮(10~(-6),10~(-7),10~(-8)和10~(-9) mol/L)对培养的输卵管上皮细胞β-defensin mRNA的表达有促进作用,且不同浓度的孕酮对β-defensin mRNA的表达的影响程度不同.米非司酮极显著抑制了孕酮诱导的β-defemin mRNA的表达.结果表明,孕酮通过与孕酮受体结合促进β-defensin mRNA的表达,推断雌性生理周期下孕酮可能通过作用于β-defensin等影响自身免疫.     

孕酮对蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA表达的影响

建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外实验模型,分别添加10^-6、10^-7、10^-8、10^-9和10^-10 mol/L孕酮,运用实时荧光定量PCR方法测定孕酮对上皮细胞内β-防御素相对表达量的影响。结果显示,与对照组比较,10^-6和10^-7 mol/L孕酮组β-防御素相对表达量显著升高（P<0.05）;10^-8和10^-9 mol/L孕酮组极显著升高（P<0.01）;而10^-10 mol/L孕酮组未见显著性差异。孕酮添加组间比较显示,10^-8和10^-9 mol/L孕酮组极显著高于10^-10 mol/L组（P<0.01）,其它孕酮添加组间未见显著性差异。分析认为,一定浓度的孕酮（10^-9－10^-6 mol/L）对培养的输卵管上皮细胞β-防御素的表达有促进作用。且不同浓度的孕酮对β-防御素表达的影响程度不同。因而推断,雌性生理周期下,雌性生殖道β-防御素的表达与孕激素相关。     

抗菌肽人beta防御素3 对铜绿假单胞菌PAO-1 株的抑制作用

目的:分析抗菌肽人β防御素3(humanβdefensin 3,hBD3)对铜绿假单胞菌PAO-1株的抑制作用。方法:合成抗菌肽hBD3,分别通过最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)检测、直接杀菌试验、重要功能基因检测分析其对PAO-1的直接抑制作用;并将其与阿奇霉素、四环素、利福平、氯霉素、链霉素、环丙沙星联合施用,观察对抗生素MIC的影响。结果:HBD3对PAO-1的MIC为32μg/mL;在浓度达到8μg/mL时即有明显杀菌作用。HBD3上调PAO-1株的ahpF基因表达,下调aprA和rhlR基因表达。在联用5μg/mL的hBD3后,四环素、利福平、氯霉素、链霉素、环丙沙星的MIC值均有降低。结论:抗菌肽hBD3对铜绿假单胞菌PAO-1株有显著的抑制作用。     

青蛤抗菌肽基因的克隆及其在组织间的表达分析

利用构建的SMART-cDNA文库及高通量测序方法,获得了青蛤抗菌肽macin家族相关基因(mytimacin)的全长序列,采用荧光定量PCR方法分析了mytimacin在青蛤各组织的表达情况,并在鳗弧菌胁迫下分析了mytima-cin在外套膜中的时序表达关系。结果表明,mytimacin基因全长461bp,开放阅读框为261bp,编码86个氨基酸,具有24个氨基酸的信号肽序列;荧光定量PCR结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃和闭壳肌等组织中普遍表达,其中外套膜表达水平最高,在鳃中表达最低;在鳗弧菌刺激后6～24h,青蛤外套膜中mytimacin的表达量出现明显上调的趋势且与对照组差异显著(P<0.05),说明mytimacin抗菌肽基因在青蛤的免疫反应中具有重要作用。     

一种新型贻贝抗菌肽的分离纯化及鉴定

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）广泛分布于我国东部海域,其体内富含各种抗菌肽分子,是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,获得一种分子量为6261.55 D的具有抗菌活性的多肽成分;经多肽N端测序和基因克隆,结果表明该抗菌肽由55个氨基酸残基构成,含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。结构域分析表明该抗菌肽具有几丁质结合结构域（Chitin-biding domain）,因此将该抗菌肽命名为mytichitin-A。Mytichitin-A对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用,同时对真菌及革兰氏阴性菌也具有抑制作用。荧光定量PCR检测表明,mytichitin-A主要在厚壳贻贝的性腺组织中表达且在细菌诱导后12h其表达量达到峰值。研究为深入了解厚壳贻贝抗菌肽的分子多样性及免疫机制奠定了基础。       

香鱼镉胁迫相关基因UraD的特征和表达分析

2-氧-4-羟基-4-羧基-5-脲基咪唑啉脱羧酶(UraD)是嘌呤代谢反应酶,目前鱼类UraD基因仅在斑马鱼等少数物种得到克隆分析。从香鱼克隆获得UraD的cDNA序列,全长为967 bp,编码一个由174 aa组成的分子量为19.6kDa的蛋白,等电点为5.42。系统进化树分析显示香鱼UraD位于鱼类UraD簇中,与爬行类和哺乳类的亲缘关系较远,香鱼与斑马鱼UraD的蛋白序列相似性最高达70%。香鱼UraD表达经过反转录PCR(RT-PCR)检测发现在香鱼肝、心和肠中具有较高表达。香鱼肝组织中UraD表达量经过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测,发现镉胁迫下显著减少,香鱼UraD表达在盐度胁迫和鳗利斯顿氏菌感染下表达量保持不变。上述结果揭示香鱼UraD基因的基本特征,说明香鱼UraD基因表达与镉胁迫密切相关。     

siRNA介导的MKK4表达抑制研究

采用脂质体转染方法,将3对(siRNA ID#64447、siRNA ID#64539和siRNA ID#186583)人工合成的MKK4基因特异的小分子干扰RNA(siRNA)分别导入小鼠成肌细胞C2C12中.实时荧光定量PCR结果表明,转染了siRNA ID#64447的细胞,其MKK4 mRNA的表达水平下调得最多,约为85%.试验获得了能够高效下调MKK4基因表达的siRNA.     

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用（P〈0．01）,对目的蛋白的表达无显著影响（P〉0.05）,延长诱导时间对菌株生长有利（P〈0．01）,但对蛋白的表达无显著影响（P〉0.05）。以0．5％乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28,1％。控制好诱导条件,乳糖与IPTC的诱导效果基本相当。     

β-防御素2的生物学作用

防御素是一类阳离子抗菌肽,具有天然的抗茵活性.β-防御素2是第一个在人体中被发现的可诱导性防御素,它不仅可通过直接杀菌作用抵御入侵机体的病原微生物,还在介导获得性免疫反应、调节机体的免疫炎症反应和创伤修复过程中起着重要作用.另外,β-防御素2在肺损伤、白血病等疾病的预防和治疗中也有着重要的作用,表现出其广阔的应用前景.     

肝脏表达的抗菌肽-2

抗菌肽是在多种生物体中表达的具有抗菌活性的肽类物质的总称.肝脏表达的抗菌肽-2(liver-expressed an-timicrobial peptide-2,LEAP-2)在肝脏中产生后分泌到血液中参与血液循环,从而发挥抗菌活性等作用.本文简要介绍LEAP-2的发现过程,对LEAP-2的基因组成、结构、诱导表达机理、抗菌活性以及基因调控等方面的研究进行综述,并展望LEAP-2可能的生理功能.     

猪ANG4在小肠表达的特征及细胞类型

血管生成素4(ANG4)是一种新型的抗菌肽,主要在哺乳动物的肠道组织表达,具有抗菌和促血管生成等功能,在机体对病原体的免疫过程和血管生成过程中发挥着重要的作用。鉴于该蛋白具有多种功能,ANG4在新生断奶仔猪肠道疾病防治方面具有非常广阔的前景。为了了解ANG4在仔猪肠道的表达特点,我们通过蛋白质免疫印迹、荧光定量PCR和免疫组化分析及其在肠道表达的细胞定位,分别确定了仔猪肠道内ANG4的mRNA、蛋白质表达水平以及在肠道表达的细胞定位。结果显示,ANG4的mRNA和蛋白质在仔猪肠道不同部位的变化趋势大致相同,除mRNA水平在断奶后有一个明显下降外,mRNA和蛋白质表达水平呈现随着周龄的增加而升高的趋势。ANG4蛋白的表达基本都集中于小肠绒毛,腺窝处也有少量表达,主要的表达细胞为肠上皮细胞以及潘氏细胞。     

安体舒通对糖尿病大鼠血管生成素1和血管生成素2表达的影响

目的 观察安体舒通对1型糖尿病大鼠肾皮质血管生成素-1（Ang．1）、血管生成素-2（Ang．2）及肾脏血管重建的影响,并初步探讨其机制。方法建立1型糖尿病大鼠模型,用安体舒通干预8周后观察大鼠肾脏血管重建改变,用放射免疫法测定大鼠血浆及肾组织醛固酮水平,用RT-PCR检测各组肾皮质Ang-1和Ang-2mRNA表达。观察安体舒通对上述指标的影响。结果 与糖尿病组相比,安体舒通组大鼠肾血管重建改善,血浆及肾组织醛固酮水平更高,Ang-1和Ang-2mRNA表达减少。结论 安体舒通通过拮抗醛固酮的作用,减少Ang-1和Ang-2mRNA表达,改善糖尿病肾血管重建从而发挥肾脏保护作用。     

小鼠β-防御素30的原核表达和纯化

目的:在原核细胞中表达小鼠β-防御素30(DEFB30),并对表达产物进行鉴定和纯化。方法:用RT-PCR方法扩增小鼠Defb30的cDNA序列,将2个拷贝的cDNA序列串联连入原核表达载体pET28(a),构建重组表达载体pET28(a)-Defb30,并将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,以Western印迹分析表达产物His-DEFB30,用Ni-NTA亲和柱纯化融合蛋白。结果:构建了Defb30基因的原核表达载体,经IPTG诱导,相对分子质量约15×103的融合蛋白获得表达,Western印迹分析证实此蛋白即为目的蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化,获得了高纯度的融合蛋白His-DEFB30。结论:获得了在大肠杆菌中表达的DEFB30,为研究该蛋白的免疫避孕效果、抗菌活性奠定了基础。     

基因crtI对重组酿酒酵母β-胡萝卜素产量的影响

本文研究了在一株表达红法夫酵母色素合成相关基因crtE、crtYB、crtI和酿酒酵母HMG1功能域的重组酿酒酵母菌株Sc-EYBIH中,再表达一个拷贝crtI基因,对重组酵母Sc-EYBIH中β-胡萝卜素产量的影响。结果表明再表达crtI基因后,重组酿酒酵母Sc-EYBIH+I中β-胡萝卜素产量达到1136.17μg/g,是出发菌株Sc-EYBIH产量(358.82μ/g)的3倍。且重组菌株Sc-EYBIH+I的死亡率明显要低于不产色素的对照菌株Sc-vector。。这些结果显示,本研究所构建的重组菌ScEYBIH+I有着较好的色素产量和优异的生长性能,无论是用来生成色素类物质还是生产其他生物制品都有着广泛的应用前景。     

猪β防御素2与猪γ干扰素在毕赤酵母中的融合表达及生物学活性比较

为了研究猪β防御素2(PBD-2)与猪γ干扰素(PoIFNγ),采用重叠延伸PCR法合成嵌合编码序列PBD-2-PoIFNγ,在此序列的基础上扩增PoIFNγ基因,并分别克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ与pPICZαA-PoIFNγ。经SacI线性化,电击转化巴斯德毕赤酵母X33,筛选阳性重组子,在含0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导72h。SDS-PAGE及Western blotting结果表明,所获得的重组子能够分别分泌表达PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与PoIFNγ。琼脂扩散法和细胞病变抑制法未检测到融合蛋白的抑菌和抗病毒活性,而PoIFNγ具有明显的抗病毒活性。圆二色谱分析显示PoIFNγ与PBD-2-PoIFNγ的螺旋和无规则卷曲含量差别较大,推测是融合蛋白未能正确折叠影响了PBD-2-PoIFNγ的活性。     

枣果实β-半乳糖苷酶基因的克隆及表达分析

采用3-′RACE技术获得了梨枣果实β-半乳糖苷酶(-βGal)基因的部分cDNA片段,并运用实时荧光定量PCR技术和PNPG反应比色法,研究了梨枣不同生长期及采后常温贮藏过程中ZJGAL基因的相对表达量和β-Gal活性的变化,以探索β-半乳糖苷酶在枣(Ziziphus jujubaMill.)果实生长及采后软化中的分子调控机制.结果表明,克隆的-βGal基因序列长2 584 bp(GenBank登录号HQ827769),其中包含2 193 bp的最大阅读框,编码730个氨基酸,将该基因命名为ZJGAL.Blastn和Blastp序列比对分析发现,该ZJGAL基因与已登录的其他物种的β-Gal基因相似性达到60%～80%.随着果实的生长、成熟及采后衰老,ZJGAL基因的表达量和-βGal活性在果实采收前后均呈先上升后下降的趋势,两者的采前高峰均在幼果膨大期,但是采后贮藏过程中虽然基因的表达量较高,但是-βGal活性一直较低.     

HBD-3基因的乳腺特异性表达载体的构建及真核表达

为了制备高效表达人β-防御素-3基因的转基因奶牛提供可靠的核移植供体细胞,本试验采用RT-PCR从人胎盘组织获得人β-防御素3cDNA,通过双酶切法将目的基因片段hBD插入到质粒pBCP之间,最后再通过双酶切法将目的片段BCD插入到真核表达载体pEGFP-C1中,最终构建乳腺特异性表达载体pEBCD。脂质体介导法转染奶牛胎儿成纤维细胞G418,抗性筛选3~4周后,经PCR、RT-PCR扩增检测和报告基因EGFP表达检测,得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞;同时检测稳定转染的奶牛乳腺上皮细胞系的上清液,检测到重组人β-防御素-3蛋白可以在奶牛乳腺上皮细胞组织特异性表达。     

Gallinacin-2在毕赤酵母中的分泌表达

利用RT-PCR技术,从鸡肺脏总RNA中克隆了Gal-2 cDNA全序列,以克隆载体为模板PCR扩增Gal-2成熟肽cDNA,将成熟肽cDNA插入到分泌型表达载体pPIC9k中,构建pPIC9k-Gal-2成熟肽表达载体;通过电转化方法将表达质粒导入到毕赤酵母GS115体内,阳性克隆菌经甲醇诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳检测在3.9ku附近出现预期大小的条带,灰度扫描显示蛋白表达量占总分泌蛋白量的63.7%。抑菌试验结果表明,表达的防御素对大肠埃希氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌活性。     

抗菌肽CM4与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）与抗菌肽CM4融合基因的真核表达载体。方法：采用递归PCR（rPCR）将GFP基因与CM4基因通过一段核苷酸片段连接成GFP-CM4融合基因,构建真核表达载体pcDNA3-GFP-CM4,用脂质体介导转染人K562白血病细胞,用MTT检测其活性。结果：融合基因可在K562细胞中表达,抗菌肽CM4的表达可抑制K562细胞的生长。结论：为全面了解抗菌肽的生物学活性及其在基因治疗中的可能作用提供了重要的理论依据。     

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响*

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用(P<0.01),对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05),延长诱导时间对菌株生长有利(P<0.01),但对蛋白的表达无显著影响(P>0.05)。以0.5%乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28.1%。控制好诱导条件,乳糖与IPTG的