碳源对固定化细胞生产柠檬酸的影响

柠檬酸是利用微生物代谢生产的一种极为重要的有机酸．广泛应用于食品、饮料、化工、冶金、印染等各个领域。在国外,近10年来,利用固定化细胞生产柠檬酸已获得较广泛的研究^〔1－6〕,国内也有学者指出,柠檬酸发酵的趋向是利用固定化细胞进行连续化生产⑺。而国内这方面的研究报道很少〔8,9〕。我们利用海藻酸钙凝胶包埋固定化黑曲霉细胞生产柠檬酸．探讨了碳源种类及其浓度对固定化细胞生产柠檬酸的影响。现将结果报道如下。     

人红细胞生成素单克隆抗体的制备、鉴定及应用研究

用rhEPo作为抗原,免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与x63Ag8．653小鼠骨髓瘤细胞融合,再碱性PAGE方法进一步分离并纯化的rhEpo,包被Pvc板,对杂交瘤用ELlSA方法进行筛选,获得两株稳定分泌抗hEPO单抗的杂交瘤细胞株。经鉴定分别属于IgG1、IgG2b,轻链均为k链,Kd分别为5．53×10^-10mol／L和1．34×1O^-10mol／L．用western blot方法证明两者对hEPO具有高度韵专一性．能特异地识别rhEPO和尿源hEPO。所制备单抗可作为亲和层析的配体,用于再生障碍性贫血病人尿中EPO及哺乳类工程细胞所表达的hEPO的分离、纯化,并可用于hEPO的定量检测．     

柠檬酸发酵过程的动力学

发酵动力学是微生物培养过程研究中的一个重要部分,它让人们从理论和定量的角度了解和分析微生物的培养过程,是过程设计和控制的基础．柠檬酸发酵过程的动力学．Chemiel^[1]、Kristiansen^〔2〕、Khan^〔3〕、Rohr^〔4〕、Vaija^〔5〕等曾作过研究。本文在考察前人工作的基础上．结合实验研究．进行如下探索。     

人纤溶酶原激活剂的抑制物2在昆虫细胞中的表达

纤溶酶原激活剂（Plasminogen Activator,PA）对血液中蛋白水解酶的活性有重要的调节作用。纤溶酶原激活剂的抑制物（Plasminogen Activator Inhibitor,PAI）可物异地抑制PA（t-PA和u-PA）,其作用迅速,是PA活性的重要调节因子。很多证据表明,PAI、Pat和体内许多生理反应有密节的关系,如炎症^[1]、组织重塑^[2]、肿瘤生长及恶性细胞的转移^[3,4]等。目前已发现了四种类型的PAI,PAI-2是基中的一种,它可由人胎盘滋养层细胞合成,在孕妇血浆中大理存在^[5].该蛋白具有两种形式：一种分子量为43~47kDa的非糖基化形式：另一种分子量为58~60kDa的糖基化形式^[6,7].对其结构与功能深入的研究将有助于了解许多生于现象,但由于PAI-2基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的表达都不理想,不能获得足够量的该活性蛋白,本文在以轩状病毒为载体在昆虫细胞中成功地表达了该基因。     

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和活性研究

利用PCR方法从抗CD20单链抗体（ScFv）表达载体上扩增抗CD20抗体轻链可变区基因（V^L）、重链可变区基因（V^H）,同时在抗体的可变区引入突变,然后将V^H、V^L基因重组到Fab′表达载体pYZF1中,构建抗CD20嵌合抗体Fab′片段表达载体,并在大肠杆菌16c9中进行高效可溶性分泌表达。经大量的筛选,获得一个产量和活性均有所提高的突变克隆。其突变位点在轻链可变区的CDR1区,即G77→A（Ser→Asn）。突变的抗体的表达量为每克干菌3.8 mg,而未突变抗体的表达量为每克干菌1.3 mg。突变体的亲和力常数K_a为2.2×10⁹ L/mol,约为突变前的2倍。竞争性免疫荧光抑制实验表明,突变的Fab′片段能竞争性抑制鼠源性抗CD20抗体HI₄₇和CD20表达细胞Raji细胞的结合,使HI₄₇的结合阳性率由98%下降至37.55%,体外细胞生长抑制试验亦证明突变的Fab′片段的抑制活性明显高于未突变的抗体。     

L－亮氨酸发酵过程氮源反馈与非反馈控制的初步研究

氮源可直接影响氨基酸发酵过程中菌体生长与氨基酸生成．但是关于氨基酸发酵过程中氮源控制的研究报道并不多。本文作者在L－亮氨酸发酵过程碳源流加研究及动力学特征分析基础上^〔1〕,比较了几种非反馈型、反馈型补加硫酸铵的发酵结果．提出了较佳的控制方法。     

人生长激素基因在哺乳动物培养细胞中的导入与表达

将小鼠金属硫蛋白I(MT—I)启动子置换人生长激素(hGH)基因的启动子,构建成MT—hGH嵌合基因。当与疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因(tk)的质粒共转染小鼠L—tk-细胞,在tk⁺转化细胞中所整合的MT-hGH基因可被重金属镉诱导。获得可表达和分泌hGH的细胞株,其中一株hGH的产率为2．5μg／10⁶细胞／24h．所产生的hGH分子量为22000道尔顿,表明小鼠L一tk+细胞株能对外源hGH基因所产生的mRNA进行正确的加工并能删除激素原的信号肽。     

L－精氨酸组织传感器动力学响应机理的研究

生物组织中有丰富的酶源。由于酶的底物专一性,固此利用生物组织可研制对生物物质选择响应的组织传感器^〔1－4〕。为了制备性能良好的组织传感器及扩大它们的应用,必须对生物组织传感器的动力学响应机理进行研究。目前有关这方面的报道较步。本工作利用L－精氨酸厚叶景天叶组织传感器〔6〕研究了L－精氨酸组织传感器的动力学响应机理。     

人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV₂-PrUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV2-dhfr-或MMTV—dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr^-)。利用选择培养基选择出二氧叶酸还原酶基因表达阳性(dhfr⁺)的转化细胞灶。用溶解圈法测定尿激酶型纤溶酶原激活剂(u—PA)的生物活性,其中两株显著高于其他株细胞,命名为CLF-14和CLF-8,表达水平依次为24Iu／10⁶细胞／48h,16Iu／10⁶细胞／48h。用ELLSA测定CLF一14和cLF-8细胞上清,表现为强阳性,阳性值比阴性对照值(P／N)大于10,CLF-14和CLF-8细胞表达量分别为0．14-o．22μg／10⁶细胞／48h和0．08-O．14μg／10⁶细胞／48h。分泌产物能被抗尿激酶(UK)血清抑制,而不被抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的抗血清和正常兔血清抑制。     

组蛋白去乙酰化酶3通过抑制AICD维持T细胞自稳

为探讨组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)在T细胞自稳中的作用,采用LoxP-cd4cre酶系统在胸腺CD4⁺CD8⁺双阳性T细胞(DP)中敲除hdac3基因．hdac3基因敲除小鼠不影响T细胞在胸腺中的发育,但导致外周T细胞显著降低,而且,hdac3基因敲除的外周T细胞主要以活化/效应/记忆表型为主．机制分析表明,hdac3基因敲除的外周T细胞凋亡增加并伴随细胞增殖加速,同时,Fas 和Fas配体阳性细胞比率以及Fas配体的表达显著增加．体外TCR活化不影响正常外周T细胞的凋亡,但导致hdac3基因敲除的外周T细胞凋亡显著增加．实验结果表明,HDAC3通过抑制活化诱导的细胞凋亡维持外周T细胞自稳．     

枯草杆菌中性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达

蛋白酶是枯草杆菌(Bacillus subtilis)产生的具有重要工业价值的水解酶。对蛋白酶基因的分离与高效率表达一直是基因工程研究领域的重要内容之一^[1-4]。蛋白酶基因的筛选可采用不同的方法,如“免疫法”、“DNA 杂交法”、“遗传互补法”等。大肠杆菌(Escherichia coli)是基因工程中最常用的宿主菌, 若能以E．Coli作为筛选蛋白酶基因的宿主苗,那么使用E．Coli的常规载体,便可直接获得完整的蛋白 酶基因。枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达．则是实现这一目标的关键。Koide等人^[5]报道过枯草杆菌的胞内丝氨酸蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达。转化细胞在含有脱脂牛奶的平板上可产生十分微弱的水解圈。Ikeraara等人^[6]将Subtilisin E(枯草杆菌蛋白酶E)插人大肠杆菌的表达载体,具有活性的Subtilisin E便可分泌到大肠杆菌的细胞周质中。吴汝平撰文指出^[7]。克隆的枯草杆菌蛋白酶基因不能在大肠杆菌中表达。是因为大肠杆菌不能转录枯草杆菌的促使生长调节基因。Wang等人^[8]则认为,在大肠杆菌中观察不到野生型的中性蛋白酶基因E(nprE)的表达。是因为nprE的表达产物对大肠杆菌有致死作用．除去该基因上的核糖体结合位点,nprE便能在大肠杆菌中低水平表达,并能将表达产 物分泌至胞外。由上可知．枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达以及表达的位置仍然是一个众说纷纭的问题,这一问题也正是能否用大肠杆菌作为宿主菌筛选蛋白酶基因的关键。     

O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)基因表达的抑制对 tau蛋白磷酸化作用的影响

研究HEK293T细胞中O?鄄GlcNAc糖基转移酶(OGT)基因表达抑制对与AD密切相关的tau蛋白磷酸化与糖基化修饰的影响．以OGT基因为靶点设计三段siRNA(OGT-siRNA_1～3),用脂质体的方法转染OGT-siRNA_1～3进入HEK293T细胞,通过RT-PCR检测OGT-siRNA_1～3对OGT mRNA的抑制．将pEGFP/OGT与OGT-siRNA_1～3共转染HEK293T细胞,24 h后在倒置荧光显微镜下观察各组GFP/OGT的表达,根据GFP/OGT的表达量来评价OGT-siRNA_1～3对OGT基因表达的抑制率．将筛选出的具有最佳沉默效果的OGT-siRNA与质粒pCI/ tau₄₄₁共转染HEK293T细胞,48 h后Western blot检测tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化．OGT-siRNA₃在100 nmol/L的终浓度时对OGT基因的抑制效率最高．与Mock组相比,对OGT基因mRNA及蛋白质水平的抑制率分别可达80.0%与51.3%左右．OGT基因表达的下调使tau蛋白糖基化水平下降,而磷酸化水平增高,证实tau蛋白的糖基化负调节其磷酸化,葡萄糖摄入减少或代谢降低可能在AD的发生发展中起关键作用．     

重组人粒细胞集落刺激因子Cdna在哺乳动物细胞中高效表达的研究

利用PCR反应、DNA测序、基因重组等技术,构建了两个表达人粒细胞集落刺激因子cDNA的重组质粒pED－GCSF和pEF－GCSF,两质粒分别转染COS7细胞作瞬时表达,转染CHO－dhfr－细胞作稳定表达。结果两质粒在COS7细胞和CHO细胞均获得了表达,pED－GCSF转染COS7细胞48h、72h的表达量分别为5.2×10⁴pg/ml和2.3×10⁵pg/ml,pEF－GCSF转染COS7细胞后48h、72h的表达量分别为2.8×10⁵pg/ml和1.4×10⁵pg/ml。转染CHO－dhfr－细胞,随着加入的氨甲喋呤(MTX)浓度升高,CHO－dhfr+克隆数减少,但平均每个克隆的rhG－CSF表达量升高,在0.5μmol/L MTX下最高表达rhG－CSF细胞株的量是4.46μg/ml/3d。且表达的rhG－CSF注射小鼠腹腔可提高小鼠外周血白细胞的数量。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。     

螺旋霉素产生菌的推理选育

螺旋霉素(spiramycin,以下简称SPM)为十六元大环内酯类抗生索〔r〕。内酯环C－3位上羟基酰化侧链片段构成SPM不同组分。C－3位上羟基酰化酶的合成受葡萄糖的诱导．该诱导作用受丁酸的抑制〔2〕。SPM的生物合成受高浓度铵离子的抑制。而支链氨基酸,如缬氨酸,经分解代谢可产生乙酸、丙酸、丁酸〔S〕。作为SPM生物合成的前体。本文根据SPM的生物合成途径,采用诱变和耐L－缬氨酸、耐α－氨基丁酸相结合的筛选方法．获得了高产菌株。     

人尿激酶原cDNA序列缺失突变体的构建及表达

采用PCR重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原cDNA序列中缺失150～156位氮基酸的突变体,以COS-7细胞中获得暂时性表达以及在CHO细胞中稳定高效表达,其表达水平为450～500IU／10⁶cell／24h,表达产物经SDS-PAGE电转溶实验和westemblot分析证明,细胞分泌的Pro-UK突变体与天然Pro-UK以及完整全长DNA序列表达Pro-UK的分子量相同,为54kDa．绝大多数为单链,比完整cDNA序列表达产物的单链比例明显增高,与纤维蛋白的亲和性有所提高。     

人核糖核酸抑制因子基因在人脐血干细胞中的转染表达及对小鼠黑色素瘤基因治疗的研究

探讨人核糖核酸抑制因子 (hRI)基因在人脐血干细胞中的转染及表达情况 ,及转染后对小鼠B16黑色素瘤生长的影响。用免疫磁珠分离系统 (MACS)分离纯化人脐血CD34⁺ 细胞后 ,用制备的含hRI基因的逆转录病毒上清转染脐血CD34⁺ 细胞 ,采用克隆形成法和PCR法检测转染效率 ,Western blot和免疫荧光法检测基因表达 ,同时观察RI对荷瘤C57BL小鼠B16黑色素瘤生长的影响。应用MACS能高度纯化人脐血CD34⁺ 细胞 ,使分选后的脐血CD34⁺ 细胞纯度平均达96.15%。hRI基因能够转染到脐血CD34⁺ 细胞上 ,转染效率达 35% ,Western blot和免疫荧光检测转染后CD34⁺ 细胞hRI基因有阳性表达。经转hRICD34⁺ 细胞治疗 ,使小鼠B16黑色素瘤的生长速度减慢 ,成瘤率和瘤重降低 ,成瘤潜伏期延长。     

重组腺伴随病毒载体介导的hEPO转移及表达

为实现人促红细胞生成素 (humanerythropoietin ,hEPO)基因在体内的持续表达 ,构建了携带hEPO的重组腺伴随病毒 (recombinantadeno associatedvirus,rAAV)载体质粒 ,建立了稳定携带hEPO表达盒的rAAV载体细胞株 ,采用“一种辅助病毒感染一个载体细胞株”的rAAV生产策略 ,制备并纯化了携带hEPO的rAAV(rAAV hEPO)。结果表明 ,rAAV介导的hEPO转移能够使hEPO在培养的BHK 2 1细胞中得到有效表达 ;用rAAV hEPO对Balb/c小鼠进行一次肌肉注射 ,可使hEPO在小鼠体内持续表达 10周以上 ,并可明显升高小鼠的红细胞比容     

噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选

构建抗人乳腺癌细胞MCF 7的噬菌体单链抗体库 ,从中筛选MCF 7细胞特异性单链抗体。用MCF-7细胞免疫BALB C小鼠 ,取脾脏 ,提取总RNA ,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链 (V_H)和轻链 (V_L)可变区基因 ,经重叠PCR(SOE-PCR) ,在体外将V_H和V_{L连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染 ,构建噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别MCF-7细胞的噬菌体单链抗体 ,将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌TOP10进行可溶性表达。成功地构建了库容为12×10⁶ 的抗MCF-7乳腺癌细胞的单链抗体库 ,初步筛选到了与MCF 7细胞特异性结合的scFv,Westernblot检测表明 ,在大肠杆菌TOP10中实现了单链抗体可溶性表达}