供氧对产丙三醇假丝酵母产丙三醇发酵研究

研究了产丙三醇假丝酵母(Candidaglycerolgenesis)产丙三醇及副产物与氧供给的关系。摇瓶试验发现其它营养条件一定,玉米浆添加量决定酵母量。在04%的玉米浆和装液比008时产丙三醇最高,副产物乙醇、乙酸和乙酸乙酯最小,玉米浆和装液比影响丙三醇和副产物的形成。在5L的反应器中以搅拌转速控制供氧水平,菌体生长阶段比耗氧速率为28mg/(g·h),在发酵阶段比耗氧速率16mg/(g·h)。适量供氧能得到高产率的丙三醇,而只产生微量的乙醇、乙酸和乙酸乙酯。     

不同发酵条件下产甘油假丝酵母有机酸代谢的研究

产甘油假丝酵母 (Candidaglycerolgenesis)发酵产生的有机酸对丙三醇产品质量和产率均有影响。发现在发酵其它条件恒定 ,装液比和玉米浆浓度增加时 ,发酵液总酸是递增的。在装液比为 0 2和玉米浆浓度为 8g L时 ,丙酮酸和乳酸在细胞生长期可分别积累达 4 1g L和 1 0g L ,比正常发酵时增加 2倍以上 ,丙三醇产率也低 ;然而 ,装液比为 0 0 8和玉米浆浓度为 4g L时 ,丙酮酸和乳酸产生较低 ,丙三醇产率较高 ,但乙酸积累比供氧不足时高 ,可达 2 6g L。发酵过程中有机酸被细胞代谢 ,含量逐渐下降 ,如在初糖浓度为 1 0 0g L时 ,有机酸在细胞生长期积累至高峰后 ,丙三醇和有机酸随之均降低至较低含量 ,并且丙酮酸或乳酸可以转化为乙酸。此外 ,在外加一些添加剂时对其产生有机酸也有影响 ,如添加 1 %油酸和VB1时可以降低乙酸的积累 ,同时增加丙酮酸的含量 ,丙三醇产量也有所增加 ;而丙酮酸结构类似物氟代丙酮酸和亚硫酸盐促进乙酸的产生 ,使酮戊二酸合成减少 ,丙三醇产量约增加 2 0 %。     

耐高渗压高压甘油的一个假丝酵母新种：产甘油假丝酵母

从自然标本中分离获得一高产甘油的菌株ＷＬ２００２－５,仅发酵葡萄糖及微发酵蔗糖,能利用葡萄糖、蔗糖、乙醇生产、微利用甘油和柠檬酸,不利用肌醇,硝酸盐、与ＤＢＢ显色反应为阴性。     

耐高渗压高产甘油的一个假丝酵母新种——产甘油假丝酵母

从自然标本中分离获得一高产甘油的菌株WL20025,仅发酵葡萄糖及微发酵蔗糖,能利用葡萄糖、蔗糖、乙醇生长,微利用甘油和柠檬酸,不利用肌醇、硝酸盐、赤藓醇、阿拉伯醇、甘露醇,与DBB显色反应为阴性,可在含500g/L葡萄糖或100mL/L醋酸的培养基中及40℃下生长,可在水活度为0890～0900的培养基中生长,出芽生殖,易形成“假丝酵母菌型”假菌丝,不进行有性生殖,线粒体DNA的分子量为20kb,是假丝酵母属的一个新种,定名为产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis Zhuge[WTBZ] sp.nov.)。     

玉米浆在产甘油假丝酵母甘油发酵中的作用机理

以复合培养基和合成培养基进行比较发酵,研究了玉米浆在产甘油假丝酵母甘油发酵过程中的作用机理。结果表明:玉米浆中的磷、氮和微量元素是影响产甘油假丝酵母甘油发酵的3个关键因素。当玉米浆磷浓度为121·75mg/L(玉米浆浓度为14g/L),最大甘油转化率达到53·44%。玉米浆磷可以调节EMP途径与HMP途径之间碳架代谢流的分布,随着玉米浆浓度进一步增加,过量磷能抑制HMP途径而激活EMP途径,因而复合培养基各项发酵参数的变化非常显著。玉米浆氮对磷的调节功能有协同作用,但并不是产甘油假丝酵母甘油发酵的理想氮源。玉米浆中的微量元素能够显著提高葡萄糖的消耗速率、促进菌体的生长和增加甘油的产量。     

REMI介导电转化产甘油假丝酵母

为了分离耐高渗和甘油代谢相关基因,以Zeocin为选择标记,利用REMI技术电转化产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes。考察了7种限制性内切酶对转化的影响,选择HindIII进一步优化了转化的几个条件。结果表明,在OD600≈1.3时收集细胞,在1.5kV电压下,感受态细胞浓度为2.0×109个细胞/mL,100U Hind III时,能获得129个转化子/μgDNA的较高转化率,58%的转化子稳定,表明REMI技术适合于产甘油假丝酵母的转化。     

REMI介导电转化产甘油假丝酵母

为了分离耐高渗和甘油代谢相关基因,以Zeocin为选择标记,利用REMI技术电转化产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes。考察了7种限制性内切酶对转化的影响,选择Hind III进一步优化了转化的几个条件。结果表明,在OD₆₀₀≈1.3 时收集细胞,在1.5 kV 电压下,感受态细胞浓度为2.0×10⁹个细胞/mL,100U Hind III时,能获得129个转化子/μg DNA的较高转化率,58% 的转化子稳定,表明REMI技术适合于产甘油假丝酵母的转化。     

运用穿梭载体建立产甘油假丝酵母质粒基因文库

产甘油假丝酵母WL2002─5既具有耐高渗压性能,又能以葡萄糖为原材料高产甘油,且耐高渗压性能与高产甘油的能力相关。本研究以大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒YEp51为载体,通过对产甘油假丝酵母WL2002─5高分子量染色体DNA的提取、Sau3AI部分酶切、体外重组等建立起产甘油假丝酵母WL2002—5的质粒基因文库,库容为5．3×105,已满足对WL2002—5某一特定基因的克隆。     

耐高渗压是产甘油假丝酵母甘油高产的基础

运用化学诱变法从产甘油假丝酵母获得１９株渗透压突变株。对其生理及发酵性能的研究结果显示,所有渗透压敏感突变株的甘油产率皆显著降低并巨大多数渗透压敏感突变株的糖利用速度减慢．耐渗透压性能提高突变株的糖利用率几乎与亲株相同而甘油发酵性能改变呈现多样性,突变株如ＷＬ－ＯｓｍＤ、ＷＬ－ＯｓｍＦ以及ＷＬ-ＯｓｍＨ甘油转化率极度降低而突变株ＷＬ－ＯｓｍＢ的甘油耗糖转化率接近亲株。     

限磷对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响

研究了磷酸盐限量对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明, 当酵母细胞从适磷或富磷培养基转接入低磷培养基时, 发酵过程中胞内积累的磷逐渐减少; 而当菌体从低磷培养基转接入适磷或富磷培养基时, 发酵过程中胞内聚磷酸盐的积累量迅速增加。当细胞在第14小时和第38小时从适磷培养基转接入低磷培养基时甘油得率分别高达60.9%和61.4%, 而甘油产率则分别为2.03 g/(L·h)和2.23 g/(L·h)。这些现象说明限制发酵培养基中的磷浓度是产甘油假丝酵母高产甘油的必要条件, 并为其反复分批发酵法生产甘油提供了重要依据。     

一些氨基酸对产甘油假丝酵母甘油生产的促进作用

以EMP途径与TCA循环中间代谢物的添加为对照,研究在尿素为氮源的产甘油假丝酵母发酵过程中添加氨基酸对甘油产量的影响。结果表明:对甘油产量有强促进作用的氨基酸有谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸和丝氨酸,其最适添加浓度在0.26～0.45g/L之间,丙酮酸、α_酮戊二酸、草酰乙酸、柠檬酸和琥珀酸的最适添加浓度在0.24～0.42g/L之间;赖氨酸最适于在0h添加,丙酮酸和草酰乙酸在第14h,谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甘氨酸、α_酮戊二酸和琥珀酸在第30h,天冬酰胺、丝氨酸和柠檬酸在第48h;在最适条件下添加这些促进剂,甘油产量均呈显著增加趋势,转化率和增加率分别达到60%和16%以上。氨基酸的作用机理为其脱氨形成的碳骨架经特定的分解代谢途径进入TCA循环,使其强化,导致碳代谢流在3_磷酸甘油醛节点处发生转移,使甘油合成途径的代谢流增加。     

渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响

研究了不同磷浓度时渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明,不同磷含量时,产甘油假丝酵母甘油合成越多,分泌至胞外和积累于胞内的甘油也越多,其最大甘油合成量存在一个最适渗透压。同样;在相同渗透压下,其最大甘油合成量也存在一个最适磷浓度。在相同磷含量时,渗透压增高能够促进胞内聚磷酸盐积累;当渗透压相同时,培养基中磷含量增加,胞内游离磷和聚磷酸盐均增加。在生长稳定期后期,富磷可以促进胞内游离磷和聚磷酸盐积累显著增加。经分析发现,产甘油假丝酵母胞内积累甘油与聚磷酸盐,可能对克服对数生长期细胞数量少而渗透压胁迫大的困境发挥了极其重要的作用,从而能维持其生长稳定期较高的生物量、细胞存活率和甘油产量。     

溶氧对Candida glycerinogenes产甘油发酵过程的影响

研究了溶氧浓度对产甘油假丝酵母分批发酵生产甘油过程的影响。实验结果表明：当溶氧浓度控制在30%时,C. glycerinogenes的甘油产量、得率和产率达到最高,分别为120.7 g/L、0.575 g/g和1.69 g/(L•h),而糖酵解代谢副产物形成最少。当溶氧浓度为10%时,发酵过程呈现出“巴斯德效应”的特征,生成的酵解代谢副产物维持在较高水平。在快速生长阶段,随着溶氧从10%增加到60%,细胞呼吸类型表现为从厌氧呼吸向好氧呼吸转变,酵解代谢副产物依次减少。在生长稳定期,控制的溶氧浓度越高,酵解代谢副产物乙醇、乙酸等的生成减少。分别选用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret-like方程,能较好地模拟细胞生长、甘油合成和葡萄糖消耗的动力学过程。     

产甘油假丝酵母与酿酒酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因的功能比较

胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酿酒酵母细胞甘油合成过程中的关键限速酶．尽管高产甘油菌株产甘油假丝酵母基因组中编码该酶的基因CgGPD已经被克隆出来,但是具体的功能,特别是与酿酒酵母GPD1和GPD2基因的功能比较值得进一步研究．以酿酒酵母渗透压敏感型的gpd1/gpd2和gpd1突变株为宿主,分别导入CgGPD、GPD1和GPD2基因,比较分析了CgGPD、GPD1和GPD2基因在高渗透压胁迫条件下和厌氧环境中的表达调控,及其对细胞甘油合成能力的影响．研究发现,GPD1基因受到渗透压诱导表达,GPD2基因在细胞厌氧条件下起着氧化还原平衡调节作用,而CgGPD基因不仅能够在渗透压胁迫条件下通过过量快速合成甘油调节渗透压平衡,而且能够在厌氧培养环境中互补GPD2基因的缺失,使gpd1/gpd2缺失突变株能够正常生长,同时提高了突变株的甘油合成能力．结果表明,CgGPD基因在gpd1/gpd2缺失突变株中既具有GPD1基因的功能,又能发挥GPD2基因的功能．     

Influence of Temperature and Oxygen Concentration on the Fermentation Behaviour of Candida Stellata in Mixed Fermentation with Saccharomyces Cerevisiae

Summary Candida stellata is a wine-yeast species that has been proposed for use as a starter in the wine industry in combination with selected Saccharomyces cerevisiae cultures. To improve our knowledge on the metabolic interactions between these two yeast species, we have investigated the influence of temperature and oxygen concentration on their fermentation behaviour in mixed fermentation. Trials were carried out with free and immobilized C. stellata cells followed by an inoculum of a commercial strain of S. cerevisiae, to determine the biomass evolution and the oenological profiles of the resulting wines. We show that the oxygen concentration does not influence the fermentation behaviour of the C. stellata cells, while a low temperature (16 °C) is a critical condition for the metabolic activity of C. stellata in free-cell trials. The immobilization procedures produce a significant improvement in the metabolic activity of C. stellata, with a consequent enhancement of the glycerol content also at the 16 °C fermentation temperature. High cell concentrations and the immobilization system appear to positively influence the fermentation behaviour of C. stellata. These results are of interest for the practical application of this process in winemaking.     

Viability of Candida shehatae in D-xylose fermentations with added ethanol

Ethanol was added at concentrations of 25 and 50 g/L to active cultures of Canida shehatae under oxygen-limited (fermentative) conditions. Added ethanol completely inhibited grwoth and fermentation of D-xylose by C. shehatae. Cultures with added ethanol rapidly declined in cell viability as measured by plate counts and methylene blue staining. The rate of decline in cell viability was dependent on the amount of added ethanol. Over the course of the fermentation, cell viability, as measured by plate counts, was significantly lower in all experiments (with or without ethanol addition) compared with the viability measurements by methylene blue staining. Thus, data from the plate counts provided a more sensitive measure of the toxic effects of added ethanol and long-term anaerobiosis on C. shehatae growth/fermentation. Mean cell volume and total cell volume declined in fermentations with added ethanol. (c) 1992 John Wiley & Sons, Inc.     

克鲁氏假丝酵母在高渗环境中海藻糖和胞内甘油积累的研究

Brown[1]在1976年提出了相容溶质(Compatible solutes)的概念,尽管有关它们功能的确切机制尚不是非常清楚,但是通常它们被认为是具有渗透调节作用和对细胞中生物活性物质具保护功能的物质.海藻糖和甘油在这方面所表现出的特殊功能已被国内外广泛关注[2].Brown[3]和Crowe[4]还分别报道了甘油和海藻糖在保护胞内可溶性酶和细胞膜稳定性方面的功能.Crowe[5]在研究几种不同碳水化合物对动物肌细胞的保护功能时发现,海藻糖和甘油都在不同程度上表现出这种特性.关于酵母细胞在加盐培养基中的生长代谢情况Kuniho Nakata[6]和Sukesh [7]分别进行了报道,发现酵母细胞内有海藻糖的积累,并且海藻糖的量与细胞对外界不利环境的耐受性有密切关系.     

高效液相色谱法测定细菌发酵液中的糖、甘油和乙醇的研究

目的：建立一种用高效液相色谱快速测定细菌发酵液中糖、甘油和乙醇的方法。方法：酌情取细菌发酵液样品适量(1—9mL)于10mL容量瓶中,加入10mg/mL的甘露醇内标物1．0mL,用水定容到刻度,取2mL用4．5μm滤膜过滤,进样2μL分析,糖、甘油和乙醇以Waters Suger—Park—1钙型阳离子交换柱为固定相,0．05g／L EDTA钙钠水溶液为流动相分离,示差折光仪为检测器检测测定。结果：一次进样可同时测定细菌发酵液样品中的糖、甘油和乙醇;方法RDS在0．52％-0．85％之间,标准回收率在99—102％之间,结果满意。结论：该方法简便、快速、结果可靠,为发酵法生产甘油过程中的质量监控提供了方法。     

过氧化氢胁迫促进产朊假丝酵母合成谷胱甘肽

谷胱甘肽(GSH)在生物细胞抵御外界环境条件的刺激和胁迫时起到非常重要的作用。考察了不同时间不同浓度过氧化氢胁迫和过氧化氢连续胁迫对产朊假丝酵母合成GSH的影响, 发现低浓度过氧化氢的连续胁迫对GSH的合成有明显促进作用。进一步在发酵罐上应用了低浓度过氧化氢(36 mmol/L)持续胁迫策略, 最终GSH产量为922 mg/L, 胞内GSH含量为1.64%, 比对照分别提高了7%和35%。