新的红细胞分化相关基因EDRF1功能的初步研究

曾报道过通过功能筛选得到一个新的红细胞分化相关基因, 并命名为EDRF1(erythroid differentiation related factor 1, GenBank登录号为AF040247). 鉴于功能线索明确, 选择K562细胞作为模型细胞, 通过基因转染技术观察了EDRF1反义RNA表达和EDRF1过表达对细胞增殖和分化的影响, [³H]TdR掺入和半固体集落培养实验的结果显示EDRF1过表达时, 细胞增殖代谢能力有所下降. Northern印迹和RT-PCR的结果表明, 反义EDRF1表达载体转染后的K562细胞α-globin, γ-globin mRNA表达水平下降, STAT3, c-myc, GATA-1表达下调, 红细胞生成素受体(EpoR)在反义表达载体转染后表达有一定程度的上调. 说明EpoR和珠蛋白的表达调节没有内在的正协同关系, EDRF1对K562细胞增殖和分化的调节有可能是通过影响GATA-1等诸多红系特异的转录因子与顺式序列相互作用的转录活性实现的.     

红细胞分化相关因子EDRF1的反义RNA下调蛋白激酶C—αmRNA的表达

为了研究通过功能筛选得到的一个新的红细胞分化相关的全长cDNA（命名为EDRF1）的功能,选择K562细胞作为模型细胞来观察反义EDRF1表达对细胞功能的影响。通过快速构建,同时得到了正向和反向插入片段的真核表达载体pcDNA3－EDRF1－S（sense）及pcDNA3－AS（antisense）,并通过改进的LipofectAMINE细胞转染和G418筛选,得到了稳定性表达的细胞株,进行基因组PCR鉴定,证明了转染的高效性。Northem Blot试验的结果表明,反义载体转染的K562细胞中,EDRF1在mRNA表达水平上受到下调,提示EDRF1反义DNA的表达可能抑制了EDRF1mRAN的正常转录。进一步,γ－珠蛋白和PKC－α的表达在反义构建质粒转染K562细胞中的表达均受到下调,这可能传递了红细胞分化的负反馈信号,从而抑制了珠蛋白的合成。     

基于CRISPR/Cas9技术的GATA-1基因敲除K562细胞系的构建

GATA-1(GATA binding protein-1)在造血分化过程是最重要的转录调控因子,在红细胞和巨核细胞中特异性高表达,并通过调节相关基因的转录在红系和巨核系造血细胞的分化发育过程中发挥重要作用。该研究采用CRISPR/Cas9技术将K562细胞中的GATA-1基因敲除,建立了GATA-1基因敲除K562细胞株。首先,设计了4个CRISPR的靶向位点,利用p GL3-U6-sg RNA-PGKpuromycin质粒构建了4个导向RNA(single guide RNA,sg RNA)载体。利用电穿孔的方法将sg RNA载体与Cas9载体p ST1374-NLS-fl ag-linker-Cas9共转K562细胞。转染48 h,经定点PCR和T7EN1内切酶酶切鉴定后,采用细胞有限稀释法嘌呤霉素筛选,定点测序和Western blot检测结果显示,成功构建了GATA-1基因敲除K562细胞株,命名为K562-KO GATA-1。使用联苯胺染色和流式细胞术的方法检测血型糖蛋白A(glycophorin A,CD235a)发现,与正常K562细胞相比,K562-KO GATA-1细胞株经Hemin诱导红系分化明显受到抑制。综上,该研究建立了敲除GATA-1的K562细胞系,可用于后续的造血分化相关研究。     

SOCS-3过表达对红系基因表达的影响

目的:建立能稳定、高效表达细胞因子信号转导抑制因子-3(SOCS-3)的细胞株SOCS-3-K562,为探讨SOCS-3在造血发育中的作用奠定基础。方法:通过重组慢病毒系统感染人红白血病细胞K562,采用流式细胞分选术,根据绿色荧光蛋白表达情况,获得稳定高表达SOCS-3的K562细胞;利用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹实验,比较分选获得的细胞与对照细胞的SOCS-3表达差异;利用半定量PCR检测SOCS-3表达升高对K562红系发育相关基因GATA-1、β-globin表达水平的影响。结果:构建了人SOCS-3慢病毒表达载体;与对照组相比,通过流式细胞分选获得的K562细胞的SOCS-3基因表达水平升高8.05倍,蛋白表达水平升高3倍;SOCS-3表达升高后,K562细胞的GATA-1、β-globin基因表达受到明显抑制。结论:SOCS-3在造血发育中有重要的调控作用,而对其表达进行改变将在规模化的造血细胞定向诱导研究中发挥重要作用。     

OAZ1基因诱导慢粒白血病K562细胞向成熟红系方向分化

近年来,鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ)作为肿瘤治疗的潜在靶点备受关注.本文研究了OAZ1基因过表达对慢粒白血病K562细胞红系分化的作用.构建框移位点突变的OAZ1 过表达慢病毒载体pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen,包装病毒并感染K562细胞, Western 印迹验证其过表达效果.FACS检测细胞分化标志物CD71和GPA,结合联苯胺染色分析细胞红系分化情况.对比氯化高铁血红素(hemin)诱导组,实时RT-PCR检测与K562细胞红系分化、癌变的关键基因(GATA1、BCR/ABL、TGFβ)转录水平,对OAZ1 诱导分化的机制进行初步探索.结果表明,慢病毒过表达载体及K562细胞过表达体系构建成功.OAZ1过表达后细胞红系分化标志物CD71+/GPA+为(11.22±2.09)%,与对照组(4.07±1.04)%、空病毒组(1.79±2.36)%相比差异极显著(P<0.01);联苯胺蓝染阳性率为(14.037±0.083)%,与对照组、空病毒组比较,差异也极显著(P<0.01).定 量分析结果提示,相对于GATA1、BCR/ABL 基因mRNA转录水平的影响,OAZ1对TGFβ 基因的作用更为明显.为此推断,OAZ1基因可诱导白血病K562细胞向成熟红系方向分化,其作用机制可能与TGFβ信号转导通路相关.     

氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β-珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT-PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素(Hm)对K562细胞中β-珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示：用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、48及72h后,不仅其γ-珠蛋白mRNA水平升高,其β-珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ→β-珠蛋白基因的转换机制相关。 Abstract: The recombinant plasmid HG was constructed,in which the reporter gene encoding the enhanced green fluorescent protein (EGFP) was driven by the β-globin promoter and regulated under the HS2 element.The inductive effect of hemin on the expression of the β-globin gene and transiently transfected β-globin genes in K562 cells was analysed by FACS as well as RT-PCR method.The results showed that the level of γ and β-globin gene mRNA in K562 cells increased significantly after 24,48 and 72 hours induced with 30 μmol/LHm.And this inductive effect was sronger after 24 and 48 hours.Furthermore,the transient expression of plasmid HG in K562 cells increased significantly with hemin induction.These results indicated that the mechanism of inductive erythroid differentiation with hemin may be correlated with mechanism of γ→β-globin gene.     

TMSG-1基因功能的初步研究

TMSG-1是用mRNA差异显示技术克隆的转移相关基因, 它在高转移肿瘤细胞系和有转移的肿瘤组织中表达下降. 以高转移的前列腺癌细胞系PC-3M-1E8为受体细胞, 通过基因转染技术观察了TMSG-1基因表达对细胞V-ATPase活性、细胞内pH值和细胞凋亡情况的影响, 同时利用GFP对TMSG-1细胞内定位进行了分析. 结果表明, V-ATPase在PC-3M-1E8细胞系, 转染空载体和转染反义TMSG-1细胞系的活性无明显差异. 在转染正义TMSG-1的细胞系中, V-ATPase的活性比PC-3M-1E8细胞系, 转染空载体和转染反义TMSG-1细胞系均有明显增高(P < 0.001). 利用pH敏感性荧光探针BCECF测定细胞内的pH值, 结果显示转染正义TMSG-1组的pHi值有明显提高. 细胞凋亡的检测结果表明, 转染正义TMSG-1组细胞凋亡明显增多(P < 0.01), BCL2的表达显著下降. TMSG-1蛋白的细胞内定位分析表明, TMSG-1是一个跨膜蛋白, 定位于内质网、线粒体等细胞质膜系统. 实验结果表明, 前列腺癌细胞系中TMSG-1的上调可以提高细胞V-ATPase的活性, 增加细胞内的pH值, 同时TMSG-1的上调还可抑制BCL2的表达, 促进细胞凋亡的发生.     

DLK1基因在急性白血病细胞系中的表达及其意义

目的:研究急性白血病细胞系DLK1基因的表达水平在红系分化中的作用.方法:采用RT-PCR、Western bitting时白血病细胞系K562、HL-60进行DLK1水平的检测.培养K562细胞,用氯化高铁血红素(hemin)诱导其分化,观察DLK1在红系分化中的变化.结果:K562细胞DLK1mRNA、蛋白水平存在明显表达,HL-60细胞DLK1则不表达.通过RT-PCR检测了hemin诱导K562细胞向红系分化过程中各时间点DLK1mRNA的变化,显示随着K562向红系分化,DLK1mRNA的水平逐渐下降.结论:K562细胞表达DLK1,HL-60不表达DLK1.DLK1基因可能参与K562细胞向红系分化的过程,可能抑制其分化.     

VentX促进人类造血干细胞向红系分化

GATA-2作为GATA家族成员,其通过与靶基因的GATA结合位点结合,在造血系统发育中起关键性的调节作用。VentX是非洲爪蟾蜍xvent基因同源的哺乳动物基因,最近研究发现,其参与了中胚层的分化定型及造血干细胞的维持,并且在细胞衰老、增殖、分化及炎症反应等的调节中发挥功能。为探索VentX基因与GATA-2的关系及其对造血干细胞红系分化的调节功能,首先在K562细胞株中进行了VentX启动子分析,发现GATA-2可以通过结合到VentX启动子区两个GATA结合位点来顺式调控Vent X;继而在人骨髓(造血)干细胞中的实验显示,过表达GATA-2或过表达VentX,均可抑制CD34~+细胞的增殖,促进CD34~+细胞向红系分化。以上实验结果为临床红细胞来源提供了有价值的研究线索。     

GATA—1红系特异性转录调节因子

ＧＡＴＡ－１是一种红系特异性转录调节因子,其结合基序广泛存在于红系特异表达基因的顺式调节元件中;ＧＡＴＡ－１具有锌指结构;能反式激活携带其结合基序的报告基因,在红系细胞分化发育中起重要作用。     

KLF1和KLF9对K562细胞红系分化的协同调控作用

Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLFs)是锌指蛋白超家族的一个亚家族,参与细胞内的多种生理、病理过程,该家族成员在红细胞分化发育过程中发挥非常重要的作用,但是家族成员间对红系分化的协同调控作用还鲜有报道。本课题组前期研究发现,KIF家族成员KLF1和KLF9在已分化的红系细胞中的表达水平显著高于造血干细胞。为进一步探讨二者在红系分化中是否存在协同作用,本研究在K562细胞中分别过表达/敲低表达KLF1和KLF9,检测二者表达的相关性,发现KLF1和KLF9的基因表达呈现正相关,且二者共表达可以显著促进K562细胞红系分化,特异地增强β-珠蛋白的表达。通过对KLF1、KLF9单独和共同过表达、敲低表达的K562细胞转录组数据的分析发现二者可能通过PI3K-Akt和FoxO通路协同调控红系分化,FOS、TF、IL8是协同调控的候选靶基因。本研究结果为后续深入研究KLF1和KLF9协同调控红系分化的分子机制奠定了基础。     

Nrf2/HO-1/HMGB1信号通路在白血病细胞K562/A02化疗耐药中的机制研究

目的:通过观察高迁移率族蛋白1(HMGB1)、转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)及血红素加氧酶1(HO-1)基因沉默对白血病化疗耐药细胞(K562/A02细胞株)的影响,探讨该信号通路在白血病化疗耐药中的作用及其可能机制。方法:将HMGB1基因、Nrf2基因及HO-1基因的特异性干扰RNA分别转染阿霉素耐药细胞株K562/A02,荧光实时定量(RT-PCR)方法检测HMGB1、Nrf2及HO-1的mRNA表达水平,Western blot方法检测HMGB1、Nrf2及HO-1的蛋白表达水平,免疫荧光方法检测Nrf2的蛋白表达,并使用CCK-8方法检测转染前后K562/A02细胞株的细胞活性。结果:HMGB1基因、Nrf2基因或HO-1基因沉默的K562/A02细胞活性皆显著低于对照组及空白组(P0.05),化疗敏感性恢复。结论:HMGB1高表达导致了白血病细胞株K562/A02对阿霉素的化疗耐药,Nrf2/HO-1信号通路参与了HMGB1诱导的K562/A02细胞的化疗耐药,其表达上调可恢复K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。     

一种用作阴性对照的siRNA可诱导人K562细胞向红系分化

我们发现,一种在RNA干扰实验中用作阴性对照的商业化siRNA具有明显的诱 导人慢性髓性白血病K562细胞系向红系方向分化的作用.它表现为K562细胞瞬时转 染该siRNA后,红系分化的特异表面标志CD235及ε 、γ 和β 珠蛋白的表达升高,GATA-2的表达降低,细胞增殖速度减慢,软琼脂克隆形成率降低,并且此 过程不伴随细胞凋亡. 而生物信息学分析显示,该siRNA序列与目前所有已知人类 基因均无明显同源性.研究结果提示,该siRNA不适于用作红系分化实验中的阴性 对照. siRNA的作用远比人们目前所知的要复杂得多,siRNA的脱靶效应应当引起 研究者的足够重视,在RNA干扰实验中阴性对照siRNA的选择会极大地影响对实验 结果的判读.     

siRNA沉默socs3对红系发育的影响

为了研究细胞因子信号转导分子3(suppressor of cytokine signals-3,SOCS-3)对造血发育的影响,构建了SOCS-3慢病毒siRNA干涉载体,并转染人红白血病细胞株K562.根据绿色荧光蛋白的表达进行流式分选后,获得了高表达慢病毒干涉载体的细胞.实时荧光定量PCR和Western-blot检测了转染细胞中SOCS-3基因的干涉效率,结果显示,与对照组相比,siRNA干涉后K562细胞SOCS-3基因的表达量仅为其相对表达量的22.1%,干涉效率77.9%;Western-blot结果显示,SOCS-3在蛋白质水平表达也明显受抑制.进一步对SOCS-3基因沉默后的K562细胞进行了诱导分化,并采用联苯胺染色法检测K562细胞向红系分化比例变化,免疫荧光染色检测细胞表面抗原的变化,RT-PCR检测造血相关基因的变化.结果发现,SOCS-3沉默后K562细胞向红系的发育能力显著提高.研究结果证明,SOCS-3在造血发育中有重要调控作用,而对其表达进行干涉或沉默将在规模化的红细胞诱导研究中发挥重要作用.     

过表达KLF4重组质粒的构建及其在白血病K562细胞中的表达

为了构建过表达锌指转录因子Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因的重组质粒pEGFP-KLF4,观察其在白血病K562细胞中的表达,以RT-PCR法扩增人KLF4基因,构建pEGFP-KLF4重组质粒;经酶切及测序鉴定后,将pEGFP-KLF4质粒电穿孔转染白血病K562细胞(K562/pEGFP-KLF4组),设pEGFP-C1空质粒转染K562细胞(K562/pEGFP-C1组)及空白K562细胞作为对照,荧光显微镜观察EGFP-KLF4融合蛋白的表达情况,同时用抗生素G418筛选阳性克隆并扩大培养建立稳定过表达KLF4基因的K562细胞株,随后用RT-PCR检测3组K562细胞中KLF4的m RNA表达水平。实验结果显示,pEGFP-KLF4重组质粒构建成功。该质粒转染K562细胞24 h后能观察到较高强度的绿色荧光;经G418筛选出的阳性克隆扩大培养后建立了稳定过表达KLF4基因的K562细胞株;与对照组相比,K562/pEGFP-KLF4细胞组KLF4的m RNA表达水平明显升高,其过表达率为65.71%(P0.05)。实验中构建的过表达KLF4基因的重组质粒pEGFP-KLF4能在K562细胞中高效表达,为进一步研究其在白血病中的作用奠定了基础。     

过表达PTPα促进K562细胞体外增殖能力和体内致瘤性

探讨蛋白质酪氨酸磷酸酶α（PTPα）在血液肿瘤细胞中的特异性表达,研究过量表达PTPα对人红白血病细胞K562生物学行为的影响及在裸鼠体内致瘤能力的改变.首先应用RT-PCR和Western 印迹检测3种不同类型造血系肿瘤细胞（K562、NB4、Jurkat T）中PTPα的表达水平.根据检测结果,选择K562细胞作为研究对象,利用脂质体将 PTPα 真核表达载体转染K562细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR和Western 印迹验证过表达情况;经MTT法检测细胞增值能力的改变;用流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞分化状态;并将阳性克隆细胞皮下接种裸鼠,观察 PTPα 基因转染前后细胞系在裸鼠体内的致瘤能力及瘤体的组织化学变化.上述实验结果表明,通过G418压力筛选获得了 PTPα 高表达多克隆细胞系K562-PTPα;经体外增殖实验分析,实验组K562-PTPα细胞与未转染组细胞K562和转染空载体组细胞K562-splice相比,细胞生长速度增快,G₂/M期细胞比例增加( P <0.05),而细胞分化状态无明显变化;裸鼠体内致瘤实验显示,K562组、K562-splice组和K562 PTPα组平均瘤重分别为(1.1±0.3)g、(1.3±0.2)g和(2.5±0.5)g;病理切片显示,K562-PTPα组瘤体组织分化程度较对照组低、恶性程度高,细胞的致瘤能力增强( P <0.01).综上所述,过表达PTPα使K562细胞具有更强的体外增殖能力和体内致瘤性,表明PTPα可能在造血系统恶性肿瘤的发生发展中发挥促进作用.     

与抑制K562细胞向红系分化相关的Attractin基因的分离和初步鉴定

应用差异显示PCR（DDRT-PCR）方法分离野生型K562细胞株和能表达人β－珠蛋白基因的变种K562细胞株的4个差异cDNA片段,序列测定后,挑选差异最明显的片段dd1,经过RT-PCR、Northern 印迹鉴定确实为两株细胞间的差异片段,测序后经同源性分析等,发现其所对应的基因是吸引素（Attractin,GenBank注册号AF106861）。 根据其结构预测,Attractin有可能是K562 细胞表面一个黏附因子受体,与抑制K562细胞向红系分化有关。 Abstract:Differential display PCR method was used to isolate four differential display fragments between the wild type K562 cell line and the variant type K562 cell line that expressed the human β-globin gene.After sequencing,the most remarkable different fragment,named dd1,was selected for further study.The analysis of RT-PCR and Northern blot hybridization showed that dd1 was exactly the differentiation fragment between the two cell lines.The homology analysis indicated that dd1 was matched to Attractin (GeneBank registration No.AF106861).It might be an adhesion receptor related to inhibiting erythroid differentiation based on its structure.     

氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β－珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT－PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素（Hm)对K562细胞中β－珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示：用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、48及72h后,不仅其γ－珠蛋白mRNA水平升高,其β－珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ→β珠蛋白基因的转换机制相关。     

两个新的红细胞分化相关因子的cDNA克隆及功能探讨

曾报道在终末分化阶段的红细胞中可表达一些与珠蛋白基因增强子HS2序列特异结合的蛋白因子, 并利用杂交瘤技术制备了两株针对上述蛋白的单克隆抗体. 为获得编码这些因子的基因, 实验利用这两株单抗筛选构建于l gt11的人胚肝cDNA表达文库, 并获得阳性克隆. 经分析, 其中一株 cDNA克隆具有全长编码序列(EDRF1), 另一株为具有可读框的cDNA片段(EDRF2), 由它编码的氨基酸序列含有反式调节因子特有的亮氨酸拉链结构域. 与GenBank作同源比较后确定上述两株cDNA序列均未见报道. Northern印迹结果表明, 它们编码的蛋白质为红细胞分化相关蛋白. RT-PCR系统地观察了EDRF1, EDRF2在多种细胞株和组织中的表达, 提供了重要的功能线索. EDRF1和EDRF2主要在造血系统和早期的胚胎多种组织表达, 说明它与血细胞成熟和早期的组织发育相关, 也可能是传递早期造血与胚胎发育的分子语言.     

人促血小板生成素受体c-Mpl编码区全长cDNA的克隆及其稳定表达的细胞株的构建

以人HEL细胞总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增了人促血小板生成素受体c-Mpl编码区全长1.9kb cDNA,测序结果表明与已报道的序列一致。然后构建了c-mpl的pcDNA3表达载体pcMPL,转染不表达cmpl的K562细胞后,经G418抗性筛选,Northern blot和Southern blot检测证实获得稳定表达cmpl的细胞株。为进一步研究cMpl的生物学功能提供有用的实验材料。