黄道蚜蝇螺原体的分离及其基本生物学特性

摘要：【目的】调查我国部分昆虫螺原体的存在情况,收集我国的昆虫螺原体资源,并研究它们的基本生物学特性,初步确定其分类地位。【方法】螺原体分离、培养方法,应用暗视野显微镜和透射电子显微镜观察螺原体形态,根据16S rDNA构建系统发育树研究螺原体分离菌株可能的分类地位。【结果】从黄道蚜蝇昆虫体内分离到螺原体YY0801,并对其进行了形态学、基本生物学及分子生物学特性研究。分离菌株在R2液体培养基中生长良好,能通过孔径为0.22 μm、0.45 μm的微孔滤膜;在R2固体培养基上呈颗粒状菌落;在对数期呈典型的螺旋状;能利用葡萄糖、D-果糖作为碳源;能强烈代谢精氨酸;不能利用尿素,在含氨苄青霉素钠(2000 U/mL)的R2液体培养基中生长良好。根据16S rDNA构建的系统发育树显示,分离菌株YY0801与血清组Ⅰ的Spiroplasma melliferum 聚类较近。【结论】首次在国内从食蚜蝇科中的黄道蚜蝇（Phytomia zonata）分离到螺原体,分离菌株YY0801可能是Spiroplasma melliferum,但其确切的分类地位需要进行血清学进一步分析。     

分离自我国蜜蜂的一株新的致病螺原体及其基本特性

【目的】通过分析分离自我国患病蜜蜂体内的螺原体MF1006的基本生物学特征,初步确定其分类地位及致病性。【方法】应用暗视野显微镜和透射电子显微镜观察螺原体形态,运用常规螺原体分离和培养方法、分子生物学方法和血清学方法研究螺原体分离菌株可能的分类地位,并采用饲喂接种法研究其致病性。【结果】菌株MF1006具有典型的螺旋形和运动性,能通过0.22μm孔径的滤膜,与我国之前发现的引起蜜蜂螺原体病的参比菌株Spiroplasma melliferum CH-1的基本生物学特征差异较大。S.melliferum CH-1抗血清对其没有抑制作用。根据16S rDNA、ITS序列构建系统发育树显示,菌株MF1006与在法国发现的引起蜜蜂"五月病"的Spiroplasma apis的亲缘关系最近。此外,菌株MF1006对供试意蜂有较强的致病性。【结论】分离菌株MF1006是在我国蜜蜂体内发现的除S.melliferum以外的另一种致病螺原体。     

分离自蜜蜂(Apis mellifera)的三株螺原体的基本特性

【目的】调查我国蜜蜂螺原体的种类,研究它们的基本生物学特性,初步确定其分类地位,为研究螺原体在自然界中的传播途径提供依据。【方法】螺原体的分离、培养方法,应用暗视野显微镜和透射电子显微镜观察螺原体形态,运用分子生物学方法(选16S rDNA、ITS、rpoB基因进行系统发育分析)和血清学方法(生长抑制试验、代谢抑制试验、菌体变形试验)研究螺原体分离菌株可能的分类地位。【结果】从健康的意蜂(Apis mellifera)体内分离到3株螺原体MF0903、MF0904、MF0905。3株螺原体都呈典型的螺旋状,但菌株MF0905的菌体短小,螺旋数较少;MF0903和MF0904菌落呈规则的圆形,MF0905菌落近圆形、较大;它们都能利用葡萄糖、D-果糖作为碳源,不能利用尿素;菌株MF0903、MF0904能强烈代谢精氨酸、不能利用蔗糖作为碳源,而MF0905不能代谢精氨酸、能利用蔗糖作为碳源;根据16S rDNA、ITS、rpoB基因序列构建系统发育树显示,分离菌株MF0903、MF0904与Spiroplasma melliferum聚类较近,而MF0905与Spiroplasma clarkii聚类较近。生长抑制试验、代谢抑制试验、菌体变形试验结果均表明标准菌株Spiroplasma melliferum CH-1的抗血清对菌株MF0905没有抑制作用,而能抑制菌株MF0903和MF0904生长。【结论】分离菌株MF0903、MF0904属于Spiroplasma melliferum,而MF0905可能是Spiroplasma clarkii,这表明我国蜜蜂中存在的螺原体不仅仅是Spiroplasma melliferum。     

3种植物花螺原体的分离及其基本特性

[目的]调查我国植物花上的螺原体的存在,搜集我国的螺原体资源,并研究它们的基本生物学特性.[方法]常规螺原体分离、培养方法,应用暗视野显微镜和透射电子显微镜观察螺原体形态,根据16S rDNA和ITS序列构建系统发育树研究螺原体分离菌株可能的分类地位.[结果]分别从油菜(Brassica napus)、杜鹃(Rhododendron simsii)、红花酢浆草(Oxalis corymbosa)3种植物花表分离到4株螺原体CNR-1和CNR-2、CNA-1、CRW-1,对其形态、部分生理生化特性及分子生物学特性进行了初步研究.这4株螺原体在R-2液体培养基中生长良好,都能通过孔径为0.22 μm的微孔滤膜;在R-2固体培养基上呈圆形或颗粒状菌落,菌落直径约50～600 μm;在生长的某个阶段可呈典型的螺旋状,菌体直径为37.04～370.40 nm,长度约0.89～11.88 μm;它们都能利用葡萄糖作为碳源,不能利用尿素;在不含胎牛血清的R-2培养基中,它们都不能生长;菌株CNR-1、CNA-1能强烈代谢精氨酸,而CNR-2和CRW-1不能代谢精氨酸;在氨苄青霉素钠浓度高达2000 U/mL的R-2培养基中,分离菌株生长良好.根据16S rDNA序列构建的系统发育树显示,分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1与蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum聚类较近,而CRW-1与S.clarkii聚类较近;根据ITS序列构建的系统发育树显示,CRW-1形成一个单独的分枝,其它3个菌株仍与S.melliferum聚类.[结论]以上结果初步表明,分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1极有可能是spiroplasma melliferum,而CRW-1可能是一个新的螺原体种,但还需要血清学试验进一步验证.     

西伯利亚鲟(Acipenser baerii)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定

摘要：【目的】本研究旨在寻找引起养殖西伯利亚鲟鱼(Acipenser baerii)病害的致病因子。【方法】从北京地区自然患病的西伯利亚鲟鱼体内分离到致病菌株X-1-06909,采用生理生化鉴定结合16S rRNA基因序列的系统发育学分析确定该菌株的系统发育地位。同时采用琼脂扩散法对抗菌类药物的敏感性进行测定。【结果】菌株X-1-06909与Aeromonas veronii ATCC 35624T的16S rRNA基因序列相似性达99.6％;结合形态特征与生理生化测定结果,革兰氏阴性杆菌,具极生单鞭毛     

新疆小叶白蜡丛枝病植原体的鉴定及16S rRNA基因序列分析

【目的】对新疆小叶白蜡丛枝病植原体进行检测,通过其16S rRNA基因分析确定其分类地位。【方法】利用苯胺蓝和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,在荧光显微镜下观察新疆小叶白蜡嫩茎横切片;采用植原体16S rRNA基因的通用引物对P1/P7和R16F2n/R16R2进行直接和巢式PCR扩增,对得到的16S rRNA基因的序列进行RFLP和构建系统进化树分析。【结果】表现丛枝病症状的新疆小叶白蜡中存在植原体,暂命名为Fraxinus sogdianaBunge witches’broom phytoplasma(Fraxinus sogdianaBunge WB);其16S rRNA基因的序列GenBank登录号为KF061042,RFLP图谱与16Sr V-B亚组的枣疯病植原体相同,系统进化地位与枣疯病菌株AB052876相同。【结论】新疆小叶白蜡丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员。     

落地生根内生固氮菌多样性和促生特性

【背景】内生固氮菌可以定殖于植物体内为植物提供营养物质,还能通过代谢促进植物生长,目前对于落地生根内生菌的研究鲜见报道。【目的】研究落地生根中内生固氮菌多样性。【方法】从表面消毒的植物组织中分离纯化内生菌,并通过乙炔还原法测定菌株的固氮酶活性。采用SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS指纹图谱对菌株聚类,各类群代表菌株进行16S rRNA基因系统发育分析和生理生化鉴定。测定菌株固氮、分泌生长素和ACC脱氨酶、产铁载体、溶磷和解钾等促生特性。【结果】从落地生根中分离纯化出26株内生固氮菌,聚为5个类群,隶属于4个属的5个菌种,且各类群代表菌株具有多种促生功能。【结论】从落地生根中分离获得的内生菌具有丰富的遗传多样性和促生特性,并且存在新的微生物资源,有待开发利用。     

两株茶树内生草螺菌的微生物学特性

【目的】从健康茶树叶片内分离两株内生乳白色短杆菌(编号WT00C和WT00F)并进行微生物学特性调查。【方法】通过细菌培养和染色的方法进行了形态观察;通过微生物生理生化分析的方法进行了生物活性测定,还进行了16S rDNA序列分析以及生理生化特性调查;通过系统发育学分析及各项指标的比较,确定两个菌株的分类归属。【结果】两株细菌菌落形态为圆形、不透明、乳白色、中央隆起、边缘整齐。菌体呈杆状,大小为(0.5-0.7)μm×(1.4-1.8)μm,有鞭毛,无芽孢,革兰氏染色阴性,产生IAA、NH4+和嗜铁载体但无固氮酶活性。WT00C和WT00F菌株产生IAA量分别为18.7±1.2 mg/L和24.9±1.5 mg/L。除不能利用丙酸盐外,它们的生理特征与伯杰氏手册中草螺菌属生化指标中的可利用碳源情况基本一致,并且与已鉴定的13种草螺菌的16S rDNA高度同源,相似度达99%。基于16S rDNA序列的系统发育学分析结果显示,两株细菌形成一个独立的分支,与已报道的13种草螺菌聚类并保持着一定的距离,两个菌株的生理生化特征与其它草螺菌有许多共性但存在明显的差别。【结论】分离获得的两株茶树内生细菌WT00C和WT00F为草螺菌属的新菌株。     

美洲大蠊成虫肠道可培养细菌多样性研究

【目的】了解美洲大蠊成虫肠道可培养细菌的多样性。【方法】运用纯培养法、数值分类和16S rRNA基因序列的系统发育分析对样品中可培养细菌多样性进行研究。【结果】从NA培养基中分离得到54株细菌,根据形态观察和部分生理生化特性,选取32个代表性菌株进行16S rRNA基因序列的系统发育多样性分析。结果表明,数值分类中的代表菌株在82%相似水平上可分为12个表观群;这些分离菌株代表20个物种,属于4个大的系统发育类群(Proteobacteria,Bacteroidetes,Firmicutes,Actinobacteria)的10个科、15个属。多数菌株属于Proteobacteria门(15株,占46.9%)和Bacteroidetes门(10株,占31.3%)。【结论】美洲大蠊成虫肠道内存在较为丰富的细菌多样性。     

大西洋洋中脊深海多环芳烃降解菌群的优势菌分析

摘要：【目的】为了分析大西洋洋中脊深海海水及表层沉积物中多环芳烃(PAHs)降解菌群中的优势菌。【方法】采用富集培养法和平板涂布法从深海样品中分离可培养细菌及PAHs降解菌。通过16S rRNA基因测序完成系统发育分析。采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）及DNA测序分析降解菌群中的优势菌。【结果】总共分离到16株细菌,包括一株PAHs降解菌Novosphingobium sp. 4D。系统发育分析发现,可培养细菌中两个最大的类群分别与Alcanivorax dieselolei NO1A（5/16）和Tistrella mobilis TISTR 1108T（5/16）亲缘关系最近。DGGE结果表明,在菌群MC2D中菌株4L（以及4M、4N, Alcanivorax dieselolei NO1A, 99.21％）、4D（Novosphingobium pentaromativorans US6-1T,97.07％）和4B（以及4E、4H、4K,Tistrella mobilis TISTR 1108T,＞99％）是降解菌群中的优势菌。而降解菌群MC3CO中的优势菌是菌株5C（以及5H,Alcanivorax dieselolei NO1A,＞99％）、条带5-8代表的未培养菌株（Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444T,99.41%）、5J（Tistrella mobilis TISTR 1108T,99.52％）和5F（以及5G,Thalassospira lucentensis DSM 14000T,＜97％）。【结论】本研究发现在大西洋洋中脊深海海水及表层沉积物中Alcanivorax、Novosphingobium、Thalassospira、Tistrella属的细菌是PAHs降解菌群中的优势菌,其中的主要降解菌是Novosphingobium属的细菌。     

基于16S rRNA和HSP60基因序列分析粘细菌孢囊杆菌亚目形态分类的种属之间的亲缘关系

[目的]利用16S rRNA和HSP60基因分子标记分析鉴定形态分类特征不稳定的粘细菌种属.[方法]利用粘细菌的传统分离纯化方法从土壤中分离粘细菌,根据菌株的形态特征进行分类,PCR方法扩增菌株的16S rRNA和HSP60基因序列并进行系统发育关系分析.[结果]根据形态特征,分离得到的15株粘细菌菌株归入孢囊杆菌亚目(Cystobacterineae)的2个科3个属.其中11株粘细菌具有典型的所在种属的子实体结构,而菌株0085-4、0121-3、NM03和Myx9736的子实体结构发生了不同程度退化.15株粘细菌的16S rRNA基因序列的相似性在95.4%到99.5%之间.而HSP60基因序列差异较大.[结论]在属水平上,粘细菌形态分类特征和16S rRNA基因系统进化关系具有很好的一致性;在揭示粘细菌种间系统发育关系中,HSP60基因序列更为适用.     

中国白蛉亚科数值分类研究（双翅目: 毛蠓科）

【目的】 对中国白蛉亚科（Phlebotominae）昆虫进行数值分类研究, 探索其在系统发育过程中的亲缘关系。【方法】 选取中国白蛉40个蛉种作为分类单元以及白蛉的68项形态特征为分类指标, 进行系统聚类分析。【结果】 聚类分析结果与传统属级及白蛉属Phlebotomus的亚属级分类一致。司蛉属Sergentomyia的亚属分类与传统分类有一些区别, 聚类分析将司蛉属分为8类, 其中尼克组nicnic group与司蛉亚属subgenus Sergentomyia和传统分类一致; 泉州司蛉S. quanzhouensis和唐氏司蛉S. tangi聚入帕蛉亚属subgenus Parrotomyia; 尹氏司蛉S. yini聚入新蛉亚属subgenus Neophlebotomus, 应氏司蛉S. iyengari、马来司蛉S. malayensis、吐鲁番司蛉S. turfanensis、兰州司蛉S. lanzhouensis和南京司蛉S. nankingensis聚为一类; 歌乐山司蛉S. koloshanensis、方亮司蛉S. fanglianensis和云南司蛉S. yunnanensis与尼克组nicnic group聚成一类, 此类群和此属中其他蛉种系统发育关系距离远。【结论】 中国白蛉亚科昆虫的聚类分析结果与传统分类基本一致, 验证了传统分类系统的可靠性, 并揭示了传统分类中一些蛉种不确定分类问题。司蛉属聚类分析结果与传统分类有差别, 提示有个别蛉种需重新考虑其分类地位。     

比什凯克盐碱土壤可培养细菌的多样性

【目的】通过对吉尔吉斯共和国比什凯克地区一处盐碱土壤样品可培养细菌的分离筛选,初步了解该地区土壤微生物生理多样性和系统发育多样性。【方法】利用加盐(NaCl 5%)的R2A、TSB、1/4×NA和Gause No.1培养基筛选耐盐碱菌株。对部分分离菌株的革兰氏染色、耐盐性、生长温度范围、pH耐受、产酶性能进行了比较,进而采用核糖体DNA扩增片段限制性酶切分析(ARDRA)研究了比什凯克地区耐盐碱细菌的群落结构和多样性。【结果】从比什凯克地区盐碱土样中分离得到120株耐盐碱细菌,通过限制性内切酶Hae III对纯化菌株的16S rRNA基因进行酶切分型,根据ARDRA的酶切图谱,将其划分为19个操作分类单元。16S rRNA基因序列测定和系统发育分析结果显示,分离菌株分布于厚壁菌门、放线菌门、变形菌门下的17个种属,且部分菌株的16S rRNA基因序列同源性低于97%,可能是潜在的新种。【结论】比什凯克地区盐碱土样中的耐盐碱细菌不仅具有丰富的多样性,还蕴藏着具有地域特点的新菌种资源。     

硇洲岛海胆可培养细菌的多样性

摘要：【目的】研究南海硇洲岛马粪海胆（Hemicentrotus pulcherrimus）可培养细菌多样性。【方法】采用纯培养法和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对样品中细菌（含放线菌）多样性进行研究。【结果】用补充0～2.0 mol/L NaCl的MA、ISP 2、NA、SWA和HAA培养基从海胆样品中分离到106株细菌菌株,根据形态观察和部分生理生化实验结果去冗余,选取34个代表性菌株进行基于16S rRNA基因序列的系统发育多样性分析。结果表明,这些分离菌株代表21个物种,属于3个大的系     

两株采自惠州的细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae)嗜热蓝细菌的分离鉴定及细胞组分分析

【背景】随着CO_2排放增加,全球变暖愈发严峻,嗜热蓝细菌作为能够在45°C及以上环境中生长并实现生物固碳的微生物,具有重要的研究意义。【目的】对从广东惠州地区采集的藻种进行分离鉴定,并筛选出2株嗜热蓝细菌,研究其生长特性,为嗜热蓝细菌的后续应用提供依据。【方法】通过16SrRNA基因、藻蓝蛋白链A基因(PhycoA)序列分析确定从惠州地区采集到的菌株的分类学位置。对PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29两株嗜热蓝细菌进行形态观察和主要细胞成分(灰分、糖类、脂质、蛋白质和色素)分析。【结果】共分离出12株嗜热蓝细菌,其中PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29菌株,形态上呈蓝绿色球形毛状体,是由细胞形成密集的簇,彼此附着形成的。两株嗜热蓝细菌的主要细胞成分是糖类,分别占细胞干重的36.42%和28.46%。PKUAC-GDTS1-24的灰分、脂质和蛋白质含量分别为24.41%、21.40%和26.64%。PKUAC-GDTS1-29的细胞中,灰分、脂质和蛋白质含量分别为24.72%、23.92%和12.93%。藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)在PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29中的含量分别为157.29 mg/g DW和374.86 mg/g DW,类胡萝卜素分别为65.13 mg/g DW和18.87 mg/g DW。【结论】基于系统发育树研究,本实验的2个分离株属于细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae),与研究较少的纤发鞘丝蓝细菌属(Leptolyngbya)菌株相近,可能是广东和四川温泉中存在的一种新型丝状轻度嗜热蓝细菌属或Leptolyngbya新种。嗜热菌株PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29的形态和细胞组成相似,通过比较,2个菌株的藻胆蛋白含量远远高于其他研究报道的Leptolyngbya蓝细菌,尤其是PKUAC-GDTS1-29可以作为藻蓝蛋白生产的潜在菌株。     

药用植物内生芽孢杆菌的多样性和系统发育研究

[目的]了解药用植物内生芽孢杆菌的生物多样性.[方法]采用数值分类、16S rDNA PCR RFLP、BOX-PCR指纹图谱和16S rDNA序列分析技术对分离于几种药用植物的内生芽孢杆菌和已知参比菌株进行表型、遗传多样性及系统发育研究.[结果]供试菌株在数值分类聚类分析中在84%的相似水平上产生13个表观群.16S rDNAPCR-RFLP分析表明供试菌株表现出丰富的遗传多样性.BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明药用植物的内生芽孢杆菌的基因组也具有多样性,聚群的结果与数值分类有较好一致性.用软件在Genbank中进行所得序列的同源性检索,并构建系统发育树.由16S rDNA序列分析可知,供试的代表菌株SCAU11与球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)亲缘关系最近,SCAU78和SCAU25为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的两个亚种,代表菌株SCAU39与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的亲缘关系最近.[结论]研究结果表明药用植物内生芽孢杆菌具有明显的表型和遗传多样性.     

超声波处理土样分离放线菌

【目的】探索超声波处理土壤悬液,增加稀有放线菌的类群。【方法】将西双版纳热带雨林的混合土样,制成土壤悬液,用超声波分别处理0-120s,用平板稀释法分离放线菌,得到纯菌落后测定其16S rRNA基因序列,进行系统发育分析,将分离菌株鉴定到属;用超声波处理已经鉴定到种且常见的10种链霉菌0-5min,后进行培养,测定其存活率。【结果】土壤悬液经超声波处理不同时间,放线菌的数量和种类逐渐增加。超声波处理已知链霉菌1-5min,对链霉菌的数量没有明显影响。【结论】用超声波处理土壤悬液40s,可以大大增加放线菌的出菌总数,明显增加稀有放线菌的种类,是一种经济且简便易行的方法。