构建溶瘤腺病毒的策略

溶瘤腺病毒是通过遗传工程改造的腺病毒,具有溶细胞复制周期的特性和特异靶向肿瘤细胞和裂解肿瘤细胞的功能。溶瘤腺病毒通过复制、释放子代病毒感染邻近肿瘤细胞。现在对腺病毒生活周期的认识水平,可以对其基因组进行改造从而使其特异性裂解肿瘤细胞而不杀伤正常细胞,并且构建了多种溶瘤腺病毒。本文主要概述了溶瘤腺病毒的三种构建策略:剔除腺病毒在正常细胞中复制所必需而在肿瘤细胞中不需要的某些基因;利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基因;对腺病毒衣壳蛋白进行基因修饰,达到特异性结合肿瘤细胞的目的。     

双靶向溶瘤腺病毒MD55对肿瘤细胞与正常细胞的杀伤作用比较

应用分子克隆和同源重组技术构建双靶向溶瘤腺病毒MD55.分析MD55病毒在细胞中的复制能力,并用MTT和结晶紫方法检测MD55对肿瘤细胞和正常细胞生长的影响,West-ern印迹检测病毒感染后细胞中E1A蛋白和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)片断的表达.结果显示,MD55能在MN/CA9阳性的肿瘤细胞SW620和OSRC-2中特异性表达E1A蛋白.并且在这些细胞中的复制能力和对这些细胞的杀伤性与对照病毒ZD55基本相同,而其在正常细胞中的复制能力很弱,对正常细胞的伤害很小;同时MD55可诱导肿瘤细胞SW620和OSRC-2的凋亡,而对正常细胞的凋亡无影响.实验结果表明双靶向溶瘤腺病毒MD55靶向性和安全性比单靶向病毒ZD55更高,有望成为一种很好的肿瘤靶向基因一病毒治疗载体.     

苜蓿丫纹夜蛾杆状病毒在四个异源连续细胞系内的传代复制

本文比较了苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)在贪食夜蛾IPLB-SF-21AE细胞及其克隆株IPLB-SF-21AEC细胞,棉铃虫SIE-HAH-806细胞和粘虫SIE-MSH-805细胞系内长期连续传代复制的情况,每代病毒复制的历程为7天,观察指标是,细胞内形成多角体的百分率,游离病毒粒子的TCID50,对幼虫活体感染性,以及受感染后细胞超微结构的变化,结果证实,AcNPV在异源IPLB-SF-21AE昆虫细胞系内连续复制至50代次后,依然具有正常的形态和感染性,这为在离体下长期有效地复制杆状病毒提供了可能,我们还发现,在离体系统内增殖的病毒,其正常形态和感染性的维持与选用敏感细胞的种类有关。     

生理条件下的S期检查点

细胞周期检查点在细胞遭遇DNA损伤因子的攻击或遇到营养缺乏等不利因素作用时,能够暂时阻止或减慢细胞周期的进程,是细胞在长期进化中发展起来的抵御DNA损伤的重要机制.不仅如此,最近的研究表明,在正常生理条件下,存在一种S期检查点,对DNA复制的速度进行调控.从分子水平而言,这种调控作用可能是通过一系列细胞周期调控蛋白如ATR、9-1-1复合体、Chk1、Cdc25A和CDK2等的作用来实现的.这种调节作用对细胞至关重要,它使DNA复制速度不致于过快,从而减少复制过程中发生错误的几率,维护基因组的稳定性.     

大肠杆菌TorS/TorR二组分体应答蛋白TorR对DNA复制起始的影响

二组分体作为一种信号转导系统在细菌中普遍存在,能够感知外界环境变化并做出应答。细菌中CckA/CtrA、ArcA/ArcB和PhoP/PhoQ二组分体与DNA复制起始和细胞分裂相关,但目前还未见TorS/TorR二组分体对细胞周期及DNA复制影响的相关报道。大肠杆菌TorS/TorR二组分体能够监测细胞周围氧化三甲胺(Trimethylamine oxide, TMAO)的浓度变化,但其是否影响DNA复制起始呢?文章利用流式细胞仪检测了ΔtorS和ΔtorR突变体菌株的复制式样。结果发现,ΔtorS突变菌株每个细胞复制起始原点数目和倍增时间与野生型细胞一致,而ΔtorR突变菌株每个细胞复制起始原点数目多于野生型细胞,说明复制起始发生时间比野生型细胞早。但是过表达TorR蛋白或者共同表达TorS和TorR蛋白都不能使ΔtorR突变体表型恢复为野生型表型。而在野生型和ΔtorR突变细胞中过表达SufD蛋白能使复制起始提早发生,在ΔtorR和ΔsufD双突变细胞中复制起始延迟。所以,TorR可能通过改变sufD基因的表达来间接影响染色体复制起始。     

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶2在单纯疱疹病毒复制中的作用

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)与单纯疱疹病毒(HSV)等多种重要人类疾病病毒的复制密切相关.但具体哪种CDK是病毒复制所必需的还不清楚.本文用不同剂量的HSV-1-KOS株(以下简称HSV)感染CDK2功能缺陷型宿主细胞,结果发现HSV在CDK2功能缺陷型宿主细胞中的复制具有感染剂量依赖性;一步生长曲线分析结果表明其在CDK2功能缺陷型宿主细胞中的复制较在正常细胞延迟3h;感染6h时CDK2活性被诱导,9h时活性最大;CDK2活性增加后HSV-1即进入快速的裂解性复制.提示CDK2可能在HSV复制的启动中起着某种重要作用.     

谷氨酸钠及氯奎对离体人类红细胞膜的辐射保护作用

生物膜是保证细胞正常生命活动的重要基本结构之一,近来有人指出,它与DNA 的正常复制有密切关系;而且细胞经辐射作用后,对其受损伤的DNA 进行修补时,也需要依赖有关膜的完整     

细胞松弛素D对棉铃虫核型多角体病毒复制和装配的影响

杆状病毒感染引起宿主细胞肌动蛋白骨架的构象变化 ,使之形成缆绳结构 .棉铃虫核型多角体病毒 (HaNPV)的衣壳蛋白也能使宿主昆虫的肌动蛋白发生凝聚 ,用细胞松弛素D抑制宿主肌动蛋白形成纤丝结构 ,病毒感染Hz AM1,空斑计数表明 ,0 1μg/ml细胞松弛素D可使棉铃虫核型多角体病毒的增殖下降 10 4倍 ,细胞松弛素D浓度增高到 0 5 μg/ml则测不到子代病毒粒子 .Western印迹分析表明 ,细胞松弛素D并不影响受染细胞中肌动蛋白的含量 .斑点印迹 (dotblot)也表明 ,病毒DNA的合成也没有受到影响 ,推测宿主细胞的肌动蛋白纤丝结构与病毒的复制有关 .在电子显微镜下观察超薄切片发现 ,在 0 5 μg/ml细胞松弛素D处理细胞中形成的病毒粒子形态与正常形态明显不同 ,提示细胞松弛素D抑制HaNPV的增殖是由于抑制病毒组装成完整有感染性的病毒粒子 .从而可以认为宿主昆虫细胞的丝状肌动蛋白对子代病毒的复制和组装是必需的 .     

红细胞血影介导7sRNA对大鼠肝癌细胞(CBRH-7919)DNA复制、转录和甲胎蛋白合成的影响

本文总结了用红细胞血影介导正常肝7sRNA进入肝癌细胞的定位及其对细胞DNA复制、转录和蛋白合成的影响。装载~(125)I-78RNA的血影与肝癌细胞融合后,放射自显影标本显示7sRNA在细胞内的分布,主要定位于细胞质,也有见于细胞核内。7sRNA进入细胞后对细胞的DNA复制、转录和蛋白合成有抑制作用。免疫荧光和免疫沉淀法检测肝癌细胞甲胎蛋白合成的结果表明,7sRNA导入晚G_1期同步细胞后继续培养4小时,甲胎蛋白合成减少。由于细胞DNA复制和转录被抑制,在一定程度上影响了甲胎蛋白基因的表达。     

用人造微小染色体技术研究着丝粒和端粒的DNA结构与功能

为了在细胞世代中保持其稳定性,染色体起码应具备3个结构要素,那就是有一个DNA复制起点;一个着丝粒(ccntromere)使细胞分裂时两个姊妹染色单体能平均分配到子细胞里;最后,在染色体的两个末端必须有端粒(telomere),使DNA能完成复制。近年来人们采用分子克隆技术把真核细咆染色体的复制起点、着丝粒和端粒的DNA片段分别克隆成功。并且把它们互相搭配或改造而构成所谓“人造微小染色体”(aftificial minichromosomes),以研究这3种成分的结构与功能。 一、染色体复制起点 大肠杆菌质粒pBR322不能转化酵母细胞,因为pBR322上的DNA复制起点不能被酵母系统所识别,DNA不能复制。1979年Stinchcomb和Carbon实验室分别把带有遗传标记,例如Trp~+的酵母DNA的EcoRI片段插入pBR322,用来转化trp~-酵母,获得了带有质粒并能传代的Trp~+细胞。它们所含的质     

YfiA、Rmf和Hpf影响大肠杆菌DNA复制起始

探讨核糖体休眠因子yfiA、rmf和hpf对大肠杆菌DNA复制起始的影响。观察ΔyfiA、Δrmf和Δhpf基因缺失突变体的DNA复制式样、细胞倍增时间、细胞大小等表型变化,并使用温度敏感性实验和蛋白定量实验探究yfiA、rmf和hpf对DNA复制起始的作用机理。结果发现,相较于野生型细胞,ΔyfiA、Δrmf和Δhpf突变体出现DNA复制起始的延迟、细胞倍增时间延长、细胞体积减小等表型变化。温度敏感性试验表明YfiA、RMF和HPF蛋白不是直接通过与DnaA、DnaB或DnaC蛋白相互作用来影响DNA复制起始。蛋白定量实验表明它们可能是通过减少细胞内总蛋白的量,包括DnaA蛋白,使细菌的代谢和生长速度减慢,从而导致细菌DNA复制起始发生延迟、细胞倍增时间延长和体积减小等表型改变。这为深入研究yfiA、rmf和hpf的功能提供基础。     

端锚聚合酶(Tankyrase)和端粒

端粒是真核细胞染色体末端的一个特殊结构 ,由一段具有特定重复序列的ＤＮＡ和端粒结合蛋白组成 ,是维持染色体结构稳定的重要因素。端粒ＤＮＡ的复制不是由ＤＮＡ聚合酶完成的 ,而是由端粒酶 (ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ)催化合成后添加到染色体的末端。正常细胞随着细胞分裂活动的进行 ,端粒ＤＮＡ逐渐缩短 ,当缩短到一定程度时 ,染色体结构被破坏 ,细胞进入衰老期并以死亡而告终。但当细胞发生癌变时 ,由于端粒酶的重新激活 ,这种端粒ＤＮＡ随分裂活动发生渐进性缩短的趋势受到阻遏 ,使正常细胞转化成具有无限分裂能力的永生化恶性细胞。研究…     

猪瘟病毒C株共感染口蹄疫病毒影响口蹄疫病毒复制

【背景】猪瘟(Classical Swine Fever)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的猪高度接触性传染病,致死率极高。在临床中存在着CSFV与猪其他病原菌共感染的情况,例如CSFV与口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)的共感染。【目的】利用CSFV与FMDV共感染猪源宿主细胞,研究CSFV与FMDV共感染对FMDV病毒复制的影响。【方法】构建体外共感染细胞模型,在正常PK-15细胞上进行CSFV共感染FMDV实验,通过观察细胞病变效应(Cytopathic Effect,CPE)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western Blot、间接免疫荧光检测CSFV和FMDV共感染及FMDV单独感染情况下FMDV复制水平的差异。利用RT-qPCR筛选鉴定能够影响FMDV复制的CSFV蛋白。【结果】CSFVC株共感染FMDV能够抑制FMDV的复制,而且灭活的CSFV同样抑制FMDV的复制。通过筛选鉴定出CSFV的C蛋白能够抑制FMDV复制。【结论】研究发现CSFV C株共感染FMDV能够抑制FMDV复制,而其C蛋白具有抑制FMDV复制的能力。     

HSV I感染L-02细胞对核不均一性核糖核蛋白H2(hnRNP H2)表达影响

单纯疱疹病毒(HSV I)对宿主细胞转录及mRNA修饰翻译通路的调控是一个系统的、复杂的体系,探索其具体机制将有助于了解病毒复制过程及与宿主细胞之间的相互作用.基于2-DE分析,人正常肝细胞L-02细胞核不均一性核糖核蛋白H2(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2,hnRNP H2)在感染HSV I前后存在表达差异,通过 Western blot,Northernblot等技术方法验证其在病毒复制过程中不同时段对其表达影响.     

HSV I感染L-02细胞对核不均-性核糖核蛋白H2（hnRNP H2）表达影响

单纯疱疹病毒（HSV I）对宿主细胞转录及mRNA修饰翻译通路的调控是一个系统的、复杂的体系,探索其具体机制将有助于了解病毒复制过程及与宿主细胞之间的相互作用。基于2-DE分析,人正常肝细胞L-02细胞核不均一性核糖核蛋白H2（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2,hnRNPI-12）在感染HSVI前后存在表达差异,通过Western blot,Northern blot等技术方法验证其在病毒复制过程中不同时段对其表达影响。     

高危型HPV 复制相关蛋白在宫颈组织中的研究

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)复制机制的研究,对复制与宫颈病变的相关性可提供重要的依据。HPV是有衣壳包裹的小型环状双链DNA病毒。其基因组可分早期及晚期蛋白编码区和一个调控区。高危型HPV通过E1、E2蛋白及Ori序列启动复制。高危型HPV在宫颈上皮细胞中的复制是分化依赖型的,在高危型HPV感染的成熟的宫颈表皮细胞中,HPV E7蛋白使细胞再次进入增殖分裂期,HPV-DNA得以复制,但同时E7蛋白亦会诱发宿主细胞染色体不稳定,增加癌变风险。由此推理,高危型HPV的复制与宫颈癌的发病有一定相关性。目前有学者对高危型HPV的复制机制,复制与致癌的关系方面正开展相关研究。     

赤霉素与脱落酸对番茄种子萌发中细胞周期的调控

利用细胞流检仪检测番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ．） ＧＡ－缺陷型、ＡＢＡ－缺陷型和相应的正常品种（野生型）成熟种子胚根尖细胞倍性水平时发现：ＧＡ－缺陷型和野生型种子绝大多数细胞ＤＮＡ 水平为２Ｃ,而ＡＢＡ－缺陷型种子则含有较多的４Ｃ细胞。在标准发芽条件下,ＡＢＡ－缺陷型和野生型种子浸种１ ｄ 后胚根尖细胞ＤＮＡ 开始复制,随后胚根突破种皮而发芽。然而ＧＡ－缺陷型种子除非加入外源ＧＡ,否则既不发生细胞ＤＮＡ 复制,也不发芽。这说明内源ＧＡ 是启动番茄种子胚根尖细胞ＤＮＡ 复制的关键因素,同时也说明番茄根尖细胞ＤＮＡ 复制是种子发芽的必要条件。实验证明：ＡＢＡ 不抑制细胞ＤＮＡ 合成,但阻止Ｇ２ 细胞进入到Ｍ 期。外源ＡＢＡ处理野生型种子与渗控处理结果相似,可以大幅度提高胚根尖４Ｃ／２Ｃ细胞的比例,但抑制种子的最终发芽     

宿主细胞膜骨架蛋白在病毒感染复制中作用的研究进展

病毒与宿主细胞之间相互关系的研究不仅具有重要的理论意义,也是重大的医学实践课题.病毒可以与宿主蛋白相互作用并改变细胞的正常功能,从而促进病毒的感染与复制.宿主细胞膜骨架蛋白在病毒的生命周期中起着重要作用,研究表明细胞膜骨架蛋白参与了病毒的感染及复制,尽管许多精细机制尚不清楚,但这扩展了人们对细胞膜骨架蛋白功能的理解.本文重点介绍宿主细胞膜骨架蛋白如肌动蛋白、血影蛋白在病毒进入、细胞内运输、组装和释放等病毒感染复制过程中的作用.     

p53选择性抗瘤腺病毒

多种肿瘤的抑癌基因p53发生了突变。一种腺病毒E1B缺失体ONYX-015能够在p53突变的肿瘤细胞内有效地复制而导致痛细胞的裂解,但不能在p53正常的细胞内复制。这种p53选择性抗瘤病毒代表了一类新的抗癌武器:溶癌病毒。     

DNA错配修复与癌症的发生及治疗

DNA错配修复是细胞复制后的一种修复机制,具有维持DNA复制保真度,控制基因变异的作用。DNA错配修复缺陷使整个基因组不稳定,最终会导致肿瘤和癌症的发生。DNA错配修复系统不仅通过矫正在DNA重组和复制过程中产生的碱基错配而保持基因组的稳定,而且通过诱导DNA损伤细胞的凋亡而消除由突变细胞生长形成的癌变。错配修复缺陷细胞的抗药性也引起了癌症化疗研究方面的关注。大多数情况下,错配修复健全型细胞对肿瘤化疗药物敏感,而错配修复缺陷细胞却有较高的抗性。DNA错配修复系统通过修复和诱导细胞凋亡维护基因组稳定的功能,显示了错配修复途径在癌症生物学和分子医学中的重要性。