福氏2a志贺氏菌△aroA突变减毒株的构建

志贺氏菌芳香族氨基酸合成酶基因缺陷能够使菌体明显减毒,并有可能成为新一代痢疾疫苗．用ＰＣＲ技术从野生型福氏２ａ志贺氏菌２４５７Ｔ中克隆出ａｒｏＡ基因,在体外进行精确的缺失突变,并通过体内同源重组,构建成△ａｒｏＡ突变体ＲＳ４２６．实验结果表明,这种突变体仍保持了侵袭能力和保护性Ｏ抗原的表达,但其毒力已明显降低,不能产生豚鼠角结膜炎,小鼠半数致死量明显提高．免疫保护试验显示,ＲＳ４２６可在小鼠中产生对福氏２ａ野生菌１００％的保护作用．     

志贺氏菌链霉素依赖菌株回复突变的研究——Ⅰ.体外回复突变率

南斯拉夫Mel氏应用志贺氏菌链霉素依赖菌株(Streptomycin-dependent Shigella strains,以下简称S~d)制备口服痢疾活菌苗进行预防菌痢的现场效果考核,取得满意的结果。目前,国内已引进南斯拉夫福氏志贺氏菌2a(Shigella flexneri 2a)S~d菌苗株,并选育出国内常见流行型福氏志贺氏菌1b、3a、4a及宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)的S~d菌株,进行口服预防效果观察。     

志贺氏菌福氏2a 301株ipaH4.5突变株的构建及生物学功能分析

利用λ-Red重组系统对福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因缺失突变株?ipaH4.5,利用低拷贝质粒构建ipaH4.5缺失突变株的回复突变株△ipaH4.5HF。PCR方法证实了ipaH4.5基因的缺失和回复。对野生株、突变株和回复突变株的生长代谢及细胞侵袭能力进行比较;ELISA方法检测3株菌侵袭鼠J774巨噬细胞后培养上清中炎性因子的水平。生长代谢实验表明缺失和回复ipaH4.5不影响志贺氏菌的生长速度,侵袭实验表明缺失和回复ipaH4.5也不影响志贺氏菌对HeLa细胞和鼠J774巨噬细胞的侵袭能力,表明ipaH4.5基因与志贺氏菌的生长代谢和侵袭能力无关;鼠J774巨噬细胞培养上清中细胞因子水平的改变提示该基因在志贺氏菌侵入细胞后抑制宿主细胞炎症反应。     

福氏志贺氏菌的溶原性以及由5型福氏志贺氏菌中得到的温和型噬菌体所引起的敏感菌株的抗原变异

自302株福氏志贺氏菌中发现了37株溶原菌,其中有11株得自福氏5型志贺氏菌的温和型噬菌体,可以使1a,2a,2b,x,y诸亚型福氏志贺氏菌发生溶原转换,从而变为5型福氏志贺氏菌株。变异是稳定的,所获得的V型抗原在血清上可以得到证实。 由5型福氏志贺氏菌得到的温和型噬菌体还可以使1a,2a,2b诸亚型菌株的部份个体发生丧失变异,失去型特异抗原而变为x或y变株。这种丧失变异后的个体也是稳定的,同时,继续对5型温和型菌体敏感,因而,它似乎是菌株在发生溶原转换过程中的一种中间(过渡)类型,此外,丧失变异产生的x或y变株对另外的温和型噬菌体敏感(如FTP60299),可以经其作用后发生溶原转换,变为3a或3c亚型福氏志贺氏菌,而丧失变异前的原始菌株(如1a,2a,2b)却对这种噬菌体全无作用,这说明了一种可能的新的型间变迁方式。     

稳定、无抗药的痢疾福氏2a和宋内双价菌苗候选株的构建

通过体内外基因重组,将大肠杆菌粘附因子cs3基因定位整合到痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32菌染色体的asd基因内,使asd基因灭活;将来内O抗原基因克隆至无抗药性表达载体pXL378,获得重组质粒pXL390,将其转化asd-的T32受体菌,构建成福氏2a和宋内双价苗苗株FS01。实验表明:重组质粒pXL390在不带任何抗菌素基因的情况下,在asd-的T32受体菌内是稳定的。FS01株遗传稳定,能表达两种痢疾菌的PLS-O抗原,无明显毒性作用。动物试验表明,以FS01株皮下免疫的小鼠对福氏2a和宋内有毒株的腹腔攻击有100％的保护。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变株的构建

目的:构建弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变体,以研究yciD基因的功能。方法:根据弗氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用Red重组系统对yciD基因进行缺失,并经PCR和SDS-PAGE证实;对野生株和突变株的生长状态及生化反应进行比较研究。结果:构建了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株2457TΔyciD,该突变株外膜蛋白样品中缺失了一条相对分子质量与从yciD基因推导的蛋白相当(约22000)的蛋白带。该突变株比野生株生长快,利用葡萄糖和甘露醇的能力也比野生株大为增强。结论:获得了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株。     

稳定、无抗药的痢疾福氏2a和宋内双价菌苗候选株的构建

通过体内外基因重组,将大肠杆菌粘附因子cs3基因定位整合到痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32菌染色体的asd基因内,使asd基因灭活;将来内O抗原基因克隆至无抗药性表达载体pXL378,获得重组质粒pXL390,将其转化asd^-的T32受体菌,构建成福氏2a和宋内双价苗苗株FS01。实验表明:重组质粒pXL390在不带任何抗菌素基因的情况下,在asd-的T32受体菌内是稳定的。FS01株遗传稳定,能表达两种痢疾菌的PLS-O抗原,无明显毒性作用。动物试验表明,以FS01株皮下免疫的小鼠对福氏2a和宋内有毒株的腹腔攻击有100％的保护。     

福氏2a宋内氏双价痢疾菌苗候选株的生物表型及稳定性鉴定

志贺氏痢疾是我国常见病、多发病。根据我国主要流行型别特点,构建f侵袭表型阳性的福氏人来内氏双价痢疾菌苗。2株议价菌苗候选株生物表型及其稳定性研究结果：（1）O抗原表达,候选株能良好表达福氏Za及来内氏双价0抗原,用针对保护性表位单抗2E6及SSD3所做的FAS表明,福氏Za抗原表达为亲株FS－15的86．8％一121．0％,来内氏为兀．4％～119．0％;经液体传代20代后,双价O抗原表达稳定率均在95％以上。（2）IPa表达,WesTen1Dlot结果表明,候选株能表达侵袭相关蛋白IPaA、IPaB、IPaC、IPaD,经液体连续传20代后,侵袭蛋白的…     

福州市细菌性痢疾的病原学问题

1．1955—1956年福州所见的痢菌中,169株宋内氏痢疾菌之生化反应均属典型。227株福氏痢疾菌中最多为2a型(51．5％)及3型(23．8％),其余为4型之Rabculensis为种     

利用宿主-载体平衡致死系统构建志贺氏菌3价疫苗候选株

选择福氏2a志贺氏菌疫苗株T32为受体菌,通过基因同源重组交换技术,对其染色体asd基因进行定位突变,使之不能在LB培基上生长;同时利用链球菌asd基因构建Asd⁺的无抗药性互补载体,两者组成1套T32宿主载体平衡致死系统.进一步应用该系统克隆和表达了具有重要免疫保护功能的宋内I相O抗原基因和志贺氏毒素B亚单位基因(stxB),构建成福氏2a-宋内-StxB3价菌苗候选株FSD0l.结果显示:该菌株遗传稳定,重组质粒不需用抗生素选择,能有效表达3价抗原和产生针对上述3种野生型毒株的免疫保护反应.     

大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的共培养研究

为研究大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)混菌体系,构建了基于抗生素筛选的2株重组菌。将携带卡那霉素抗性基因的载体pET-28a转化到肺炎克雷伯氏菌中,获得重组菌K.pneumoniae(pET-28a);将携带氯霉素抗性基因cm的重组载体pET-cm(卡那霉素和氯霉素双抗性载体)转化到大肠杆菌中,获得重组菌E.coli(pET-cm),在卡那霉素抗性培养基中单独培养及混合培养上述两株重组菌。结果发现:单独培养条件下,E.coli与K.pneumoniae的相对菌体密度为57.87%;混合培养条件下,E.coli与K.pneumoniae的相对菌体密度为1.94%;E.coli和K.pneumoniae相对于各自单独培养的存活率分别为2.57%和76.60%。上述结果表明,K.pneumoniae为混菌体系的优势菌,可强烈抑制E.coli的生长。     

弗氏志贺菌4c和2a型菌株的脉冲场凝胶电泳分型特征

目的：了解北京部分地区弗氏志贺菌4c型（F4c）和2a型（F2a）菌株的分子分型特征。方法：对2005年和2006年自北京部分地区腹泻监测分离的弗氏志贺菌菌株（4c型10株,2a型20株）进行生化鉴定和血清分型,用PCR检测侵袭性抗原基因ipaH,用改良Kirby-Bauer纸片法检测菌株的耐药谱,用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分子分型。结果：10株血清型鉴定为F4c的菌株中,有7株间的PFGE图谱存在相当的差异,Dice系数为0.78～0.92,而F2a菌株与大部分F4c菌株间的距离较远（Dice系数小于0.8）;F4c和F2a菌株对14种抗生素的耐药谱略呈差异。结论：采用PFGE能够很好地辨别弗氏志贺菌4c型和2a型菌株;弗氏志贺菌4c型菌株具有易变性,可在流行过程中产生PFGE图谱的差异、血清亚型的转换、耐药谱的变化等。     

食蟹猴肠道志贺氏菌感染情况的调查

本文对 337只食蟹猴肠道志贺氏菌进行调查 ,其感染率为 1 1 %。对所分离到的 2 7株志贺氏菌进行生化、血清学鉴定 ,分属三个群 ,八种血清型 ,痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌所占比例分别为 1 0 8%、86 5%、2 7% ,以福氏志贺氏 2a型居多 ,占 59 5%。对八种志贺氏菌血清型菌株进行药敏试验 ,结果表明 ,不同血清型菌株对同一种抗菌药物的敏感性、耐药性均有差异。提示不同血清型的菌株均可自然感染食蟹猴 ,在治疗时 ,对感染不同血清型志贺氏菌的食蟹猴区别用药 ,以提高治愈率 ,避免因用药不当所造成的经济损失。     

慢生型大豆根瘤菌氨基酸营养缺陷型的共生性质

经亚硝酸或转座子Tn5诱变慢生型大豆根瘤菌,分离到了23株氨基酸营养缺陷型菌株。11株需要色氨酸,7株需要组氨酸,2株需要亮氨酸,1株需要脯氨酸,1株需要异亮氨酸的不完全营养缺陷型和1株需要色氨酸和组氨酸的双重营养缺陷型。检测了这些氨基酸营养缺陷型菌株的结瘤和固氮表型。2株亮氨酸营养缺陷型和异亮氨酸不完全营养缺陷型菌株为Nod~+和Fix~+,11株色氨酸营养缺陷型中的3株虽然不能固氮,却能作为营养缺陷型结瘤。其余色氨酸、脯氨酸和组氨酸营养缺陷型只能形成无效根瘤,以这些菌株接种所形成的根瘤中仅包含原养回复突变型。双重营养缺陷型菌株TA5H5不能形成任何类似根瘤的结构。     

肺炎克雷伯氏菌VBNC状态转化突变株的筛选与特性研究

采用双亲本接合法对从文山湖富营养化水体中分离得到肺炎克雷伯氏菌进行Tn5转座子插入诱变,在含四环素和卡那霉素的LB培养基上获得接合子,利用饥饿冷冻高渗透压法对接合子进行细菌VBNC状态转化突变株的筛选和特性的研究。结果表明,带有卡那霉素基因的Tn5成功地插入到了肺炎克雷伯氏菌的染色体中,在双抗性培养基上获得约2.3×104 cell/mL的接合子,转座效率为6.58×10-4。对多个接合子和对照肺炎克雷伯氏菌的诱导、筛选及比较,发现KPQT-7是最快进入VBNC状态的突变株,该突变株在胁迫诱导9d后超过30%的细胞都进入了VBNC状态,而对照的肺炎克雷伯氏菌至少要在诱导21d后才大部分进入VBNC状态。在此基础上,对VBNC转化突变株KPQT-7作进一步的遗传学分析将会为细菌VBNC状态分子机理的研究奠定坚实的基础。     

福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因突变体的构建

目的：构建福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体,以进行后续ArgT功能研究。方法：根据福氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用λ-Red重组系统对argT基因进行缺失,并经PCR验证;采用定点突变的方法构建ArgT非降解株,并经SDS-PAGE验证;对野生株、argT缺失突变株和ArgT非降解突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究。结果：构建了2457T的argT缺失突变株和ArgT非降解突变株;2种突变株初始生长均较慢,但最终和野生株状态一致;2种突变株利用甘露醇的能力都比野生株强,而利用葡萄糖的能力降低。结论：获得了福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法：用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western Blot检测融合蛋白的表达。结果：构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;Western Blot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

应用肠杆菌科诊断噬菌体检测志贺氏菌的评价

应用肠杆菌科诊断噬菌体对2280株疑似志贺氏菌进行了检测,同时进行了常规鉴定。结果表明,志贺氏菌属Sh噬菌体10³RTD对属内裂解率为100%,1RTD为99.9%;65株与志贺氏菌分型血清呈现凝集的非志贺氏菌,10³RTD裂解率为12.3%,1RTD为4.6%。裂解模式的测定表明,2215株志贺氏菌分属于7个裂解模式,仅模式3中3株鲍氏5型为文献[2,3]所未列入,余者完全一致。Sh10³RTD裂解的非志贺氏菌均可用1RTD和裂解模式排除     

ShF3a菌核酸自身转化分化为ShF2a菌及其生物学性状

以福氏志贺氏3a菌原养型(ShF3a-P_(199):Str~R·Met~ )DNA为供体,与同来源之福氏志贺氏3a菌营养缺陷型(ShF3a-A_2:Str~S·Met~-)为受体菌,进行自身核酸转化,在基本培养基上产生出对ShF3a和ShF2a菌血清都能发生凝集反应的菌落。这种菌经继代培养后便自身分离成单一菌型,产生“菌型分化”现象。转化体菌经生物学试验是属于福氏志贺氏菌特征,遗传特性稳定。同时观察到对抗生素耐药性上有不同的变化。菌落形态大小,转化体菌(ShF2a-T)比ShF3a菌的菌落小得多。这个异型菌问题的产生对于福氏志贺氏菌的分类和流行病学及其在临床医疗上都具有实际意义。 琼脂糖凝胶电泳图谱观察到ShF3a菌和ShF2a菌中有许多分子量较小的各种不同的核酸区带。     

关于志贺氏菌属保护性抗原问题的研究现状

<正>细菌性痢疾是由志贺氏菌引起的肠道传染性疾病之一,在发展中国家尤为严重,其流行以福氏菌群为主,在发达国家则以宋内氏志贺氏菌较多。由志贺氏Ⅰ型和福氏志贺氏菌引起的菌痢特别严重,且后者常引起慢性感染。痢疾菌的感染力较强,约为10-100个菌,ID50<1000个菌。由于菌痢的发病率高,感染性强,感染剂量小,血清型多,以及抗药性菌株的增加。因而对它的防治,在发展中国家就成为一个主要的公共卫生问题,多年来人们在痢疾菌苗的研究方面作了大量工作。现就其保护性抗原问题概述如下。