极端嗜盐古菌Natrinema sp.J7-2的转录组学研究

[目的]从转录组的角度研究极端嗜盐古菌Natrinema sp.J7-2的盐适应性。[方法]利用Illumina Hi Seq 2000双末端测序技术对生长在不同盐浓度下(15%Na Cl、25%Na Cl、30%Na Cl)的Natrinema sp.J7-2的转录组测序分析,并对差异表达基因进行了GO与KEGG富集。[结果]转录组测序结果表明,培养在3种不同盐浓度下的Natrinema sp.J7-2差异表达基因主要富集到氨基酸代谢、卟啉与叶绿素代谢两条途径上,氨基酸代谢主要涉及谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸代谢;在3组盐培养物中,有1 320个基因存在差异,其中83个共同差异表达的基因。[结论]通过转录组分析揭示Natrinema sp.J7-2菌株主要通过调控氨基酸代谢与能量代谢来适应不同盐环境。     

鉴别差异表达基因的新方法──抑制消减杂交法(SSH)

抑制消减杂交法（SuppressicSubtractiveHybridization,SSH）是最近（1996）报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法［1,2］。该方法是以抑制PCR和消减杂交法为基础,在一轮反应中实现mRNA的均等化和消减步骤。本文对SSH法的原理、优缺点作了介绍,并与其它检测差异表达基因的方法,如mRNA差别显示法（DDRT－PCR）、代表性序列差异分析（RDA）比较,认为SSH方法具有高效快速、高敏感性和假阳性低等优点。同时,625个克隆中有很大一部分是转录物丰度很低的基因,40％的克隆可能为新的基因。因此,SSH可作为鉴别差异表达基因和克隆新基因的有效方法。     

鉴别差异表达基因的新方法—抑制消减染交法（SSH）

抑制消减杂交法是最近报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法。该方法是以抑制ＰＣＲ和消减杂交法为基础,在一轮反应中实现ｍＲＮＡ的均等化和消减步骤。本文对ＳＳＨ法的原理,优缺点作了介绍,并与其它检测差异表达基因的方法,如ｍＲＮＡ差别显示江,代表性序列差异分析比较,认为ＳＳＨ方法具有高效快速,高敏感性和假阳性低等优点。     

差别显示mRNA法的改良

本文介绍了一种筛选和克隆差异表达基因的新方法——差别显示mRNA法。并在模板、引物、反应体系、反应条件等方面,对该方法作了深入的探索和改进,与原方法相比,改良法具有高效、可靠性高、经济等优点。实验表明,该方法能有效地筛选到一对细胞或组织在不同状态下表达差异的基因。为新基因的发现和克隆提供了新的手段。     

运用多种策略改良差异显示PCR

目的：改进差异显示PCR技术,提高其在筛选差异表达基因方面的效率。方法：①采用单碱基金铆钉引物;②增加引物长度;③提高PCR反应的严谨性;④应用同步重复测序电泳。结果：减少经典方法的工作量,降低了非特异性和假阳性率。用改良技术研究热适应大鼠下丘脑基因的差异表达,发现了一个差异表达基因片段,斑点杂交证实为阳性片段。结论：改进后的差异显示PCR技术是一种研究基因差异表达从而发现新基因或基因新功能的有效方法。     

用改进的DDRT-PCR技术进行人胚差异基因筛选

介绍一种从不同类型细胞或不同生长状态细胞中分离差异表达基因的快速高效mRNA差异显示技术,其特点是利用Ready-To-Go RT-PCR反应珠和Ready-To-Go RAPD分析珠进行mRNA差异显示分析,使取样步骤降至最低程度,减少了潜在的取样误差和外源DNA污染,并确保每次反应的高度重复性.通过银染测序胶分析差异显示的cDNA带,便于DNA回收和进一步克隆.用此方法分析人胚发育早期不同阶段基因的差异表达,选用6条随机引物对3、4和5周龄人胚进行mRNA差异显示分析,从2 000多条带中共分离出14个差异产物,经二次扩增及反向RNA印迹确证其中6个片段为发育不同阶段差异表达基因.     

差异显示技术及其研究进展

差异显示技术是分离差异表达基因的重要方法与手段,同其它研究基因差异表达的方法如RDA,SSH,SAGE相比,差异显示技术是其中使用频率较高的方法。该技术自1992年创立以来,经过各国研究者不断完善与改进,现已大大克服以往诸多不足,扩大了应用领域。本文就差异显示技术的原理及主要优缺点作以简要概述,并着重就引物设计、降低假阳性、鉴定差异表达基因及差异显示技术的衍生技术这4个方面的研究进展作以详尽介绍。     

mRNA差别显示技术研究进展及其在水稻中的应用

随着基因组计划的顺利实施,大量的生物信息被解析,分离和鉴定差异表达基因已成为分子生物学研究的热点.mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)是目前有效筛选、分离差异表达基因的方法之一.就DDRT-PCR的基本原理、存在的问题及相应的改进方法作了简要概述.阐明了该技术在水稻生长发育、杂种优势、抗逆性基因研究中的应用、取得的成绩,最后对该技术在水稻突变体及抗药性上的应用前景做了有益探讨.     

低温对鲤鱼的5个基因在不同组织中表达量的影响

本研究应用实时荧光定量 PCR技术对抑制性消减杂交所得到的鲤鱼不同温度下差异表达的5个基因做进一步的研究.结果表明: 水温由16℃降至4℃(骤降点)的过程中,在鲤鱼的肝、肠组织中,LKE-25基因的表达量呈下降趋势,而LKE-62基因则呈上升趋势;在肾脏组织中,LKE-48-1、 LKE-48-2和LKE-59基因的表达量呈上升趋势,且随着4℃维持时间的延长,其表达量逐渐下降.LKE-25和LKE-59基因在4℃同一尾鱼的心脏、脑、肝、脾、肾、肠组织中的表达量上有很大差异,其中LKE-25基因在心、LKE-59基因在肾组织中的表达量最高 .本实验所研究的5个基因在不同温度、不同组织表达量的显著差异,证明了这些基因与水温相关且有组织特异性 [动物学报 54(3):460-466,2008].     

西伯利亚蝗抗菌肽基因的克隆及表达特性研究

[目的]扩增西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus抗菌肽(attacin)基因,并对其进行生物信息学分析,同时分析西伯利亚蝗不同组织中抗菌肽基因的差异表达.[方法]基于RACE技术从西伯利亚蝗中克隆得到抗菌肽,利用生物信息学软件对西伯利亚蝗抗菌肽的一级结构、二级结构、三级结构、系统进化和亚细胞定位进行分析.采用实时荧光定量PCR技术检测了西伯利亚蝗抗菌肽基因在马氏管、中肠、后肠、脂肪体和唾液腺中的相对表达量.[结果]克隆获得的抗菌肽基因的开放阅读框为282 bp,编码93个氨基酸,其编码蛋白预测理论分子量为9.98 ku,等电点为9.26.抗菌肽氨基酸序列中存在信号肽序列.基因定量分析显示,抗菌肽基因在西伯利亚蝗的中肠中表达量最高.[结论]attacin在西伯利亚蝗成虫不同组织中差异表达,提示其消化道在防御病原微生物的入侵中起着重要的作用.     

小麦苗期水分胁迫诱导差异表达cDNA的研究

以小麦幼苗为材料 ,采用mRNA差异显示方法和银染技术 ,对经过用 16 % (- 0 .5MPa)PEG - 6 0 0 0溶液处理不同时间而诱导表达的小麦基因进行分离 ,共得到cDNA差异片段 5 2条。经ReverseNorthern验证 ,检出阳性表达片段 15个 ,克隆并测序。经GenBank查询 ,11个片段序列与已知序列有较高的同源性 ,4个片段同源性非常低 ,可能为新基因。     

显性核不育亚麻可育、不育花蕾mRNA差异表达研究及差异片段分析

利用mRNA差异显示技术,以显性雄性核不育亚麻不育系分离出的可育株和不育株为材料,对可育、不育花蕾中基因差异性表达进行了研究.对回收的差异片段进行反向Northern杂交验证,获得了7个阳性差异表达基因片段,并对它们进行测序和BLAST分析,最后确定了3个候选基因片段G-E07-100、G-E07-830和G-E07-330.序列分析结果表明:G-E07-100与蓖麻(Ricinus communis)的GTP-结合蛋白基因部分序列高度(90%)同源;G-E07-830与梨(Pyrus pyrifolia)的β-木糖苷酶基因高度同源(80%),并且还包含1个糖基水解酶家族C-末端的保守结构域;G-E07-330与亚麻(Linum usitatissimum)LuP12025D10 cDNA高度(89%)同源.进一步的Northern杂交结果表明3个候选基因均在不育花蕾中表达.     

团头鲂生长相关基因在不同发育时期生长轴组织的表达分析

为了探讨生长相关基因对团头鲂生长发育的调控, 研究采用Real-time PCR的方法定量分析了团头鲂6个生长相关基因在其不同生长发育阶段(3、6、12月龄)相关组织(脑、肝脏、肌肉)的表达情况, 并比较了这些基因在生长快和慢两个群体的表达差异. 结果显示: GHRs基因在肝脏与肌肉中的表达量高于脑, 在6月龄表达量高于3月龄与12月龄, 生长快群体中的表达量高于生长慢群体(P0.05); IGFs基因在三个组织中均有表达, 肝脏表达量最高, 生长快群体中的表达量高于生长慢群体(P0.05). MSTN a与MSTN b基因在组织中表达模式存在差异, MSTN a在肌肉中高表达, MSTN b主要在脑与肝脏中表达. HCL聚类结果表明: 除了MSTN a基因外, 其他5个基因在生长差异的两个群体中表达量均分别聚为一支. 不同时期组织表达聚类结果表明, 除了3月龄肝脏与12月龄肌肉组织, 6个生长相关基因在不同时期的同一组织中的表达模式存在相似性. Pearson相关分析显示: GHRs与IGFs呈正相关, MSTN a基因与GHR 2、IGFs基因呈负相关, 相同基因在两个群体中呈极显著相关(P0.01).       

差异显示技术及其进展

差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞的ｍＲＮＡ进行分组反转录及ＰＣＲ扩增,在相邻泳道上显示扩增结果,通过比较电泳图谱找出差异。差异显示技术建立至今仅五年时间便在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床诊断遗传疾病等方面被广泛应用,并不断得到改进和完善。     

差异显示技术及其进展

差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞的ｍＲＮＡ进行分组反转录及ＰＣＲ扩增,在相邻泳道上显示扩增结果,通过比较电泳图谱找出差异。差异显示技术建立至今仅五年时间便在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床诊断遗传疾病等方面被广泛应用,并不断得到改进和完善。     

Ywhaz和ATPase6在小鼠植入前胚胎中阶段特异性表达的分析

Ywhaz基因与卵裂球之间的通讯以及细胞通讯系统的建立有关,而ATPase6基因对1-细胞向2-细胞转变是非常关键的并在氧化磷酸化系统的建立中起重要作用。本文报道小鼠2-细胞期胚胎特异表达的基因的表达分析。对mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）进行改进,使之在小鼠植入前胚胎发育领域得以应用。通过对感兴趣的差异片段进行回收,亚克隆,序列分析和反向Northern杂交,结果表明：Ywhaz和ATPase6是2-细胞期胚胎特异表达的基因。     

玉米Ubi-1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因-1启动子(Ubi-1)与大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因(gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自玉米未成熟胚盾片组织的I-型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织、细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达.UbiGUS在花粉、卵细胞和T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性.对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈11分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传.同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生.目前已得到第二代转基因种子.     

大鼠脑组织Nav1.5钠通道的基因克隆及分布分析

为了阐明大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位的编码基因、分子特性及其在不同发育阶段各脑叶的分布差异,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位进行了克隆(命名为rN1),并比较其在不同发育阶段各脑叶的分布情况.rN1基因编码2016个氨基酸残基,序列分析显示,其与rH1氨基酸相似性为96.53%,与hNbR1相似性为96.13%.在DI-S3～S4发现与rH1不同的一个新的外显子(第7外显子),同时发现DⅡ～Ⅲ选择性剪切了第20外显子(53个氨基酸残基)的异构体(命名为rN1-2).分布结果显示,大鼠脑组织Nav1.5钠通道α亚单位在不同发育阶段各脑叶分布有明显的差异,研究证实,Nav1.5钠通道在大鼠脑组织显著表达,存在脑叶的分布差异,而且随着脑组织的发育,其表达逐渐趋于稳定,实验证实Nav1.5钠通道基因编码了一个新的外显子而且其表达范围更加广泛.     

LIN28A在GT1-7细胞中过表达对性发育相关基因的影响

[目的]在GT1-7细胞过表达LIN28A,研究其与性发育相关基因表达是否存在调控关系; RNA-seq发现LIN28A参与调控性发育的信号通路和基因。[方法]构建LIN28A慢病毒过表达载体,转染GT1-7细胞,Real-Time PCR检测LIN28A和性发育相关基因在mRNA水平表达变化;将过表达LIN28A的GT1-7细胞进行RNA-seq、生物信息学分析、Real-Time PCR验证,找到影响性发育的信号通路和基因。[结果]与对照相比,LIN28A在GT1-7细胞过表达18倍(P <0. 001),KISS1在mRNA水平显著升高(P <0. 01); KEGG分析,LIN28A相关的差异基因在MAPK信号通路差异显著,MAPK通路筛选到多个性发育相关基因(Fgf21、JUN、Cyp1a1、Rasgrp2),Real-Time PCR验证它们在mRNA水平差异显著(P <0. 05)。[结论]成功构建LIN28A慢病毒过表达载体,LIN28A在GT1-7细胞中过表达会促进KISS1的表达,并且LIN28A可能通过MAPK通路调控性发育。     

耐热α-半乳糖苷酶的高效表达及酶学性质初探

[目的]实现耐热α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达,并初步研究其酶学性质。[方法]克隆来源于埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的α-半乳糖苷酶基因TEgal,构建p AO815-TEgal重组表达载体,采用DNS法测定其水解活性及酶学性质;通过薄层层析研究其水解底物谱;并构建TEgal基因多拷贝表达框,实现了该基因的高效表达。[结果]TEgal对棉籽糖水解活性最高9. 5 U/m L,最适温度75℃,最适pH值3. 5; Na~+、K~+对TEgal有促进作用,Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)均能抑制酶活,多拷贝重组表达菌株活性最高为22. 4 U/m L。[结论]成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株,通过提升基因剂量将酶活和蛋白含量提高了135%和356%。