Elicitins与植物的抗病性

Elicitins是一类分子量约为 10kD的小分子蛋白激发子 ,由Phytophthora和Pythium两个属的植物病原卵菌胞外分泌产生 ,在烟草上引起过敏性反应 (hypersensitiveresponse,HR)和系统获得抗病性 (systemicacquiredresistance ,SAR)。文中从Elicitins结构与功能、生物学意义、基因表达调控 ,Elicitins在植物上诱发的信号传导和转Elicitins基因的抗病基因工程5个方面概述了E     

对水稻MADS-box基因M79的表达模式和功能的分析

利用简并引物和T引物,通过RT-PCR, 从水稻减数分裂时期的小花中扩增并克隆出一个MADS-box基因M79,序列分析表明M79与OsMADS7在DNA水平上同源性达到97.5%,推导的蛋白序列同源性却只有91.0%.M79的转录本有5个不同的 poly (A)添加位点,它同OsMADS7一样在水稻中为单拷贝基因,也定位在水稻的第8号染色体上.M79仅在花器官中表达,其表达从减数分裂前期开始贯穿整个花的发育各时期,并且成熟雌蕊中的表达量比成熟雄蕊中多.对两代转基因水稻的分析表明,M79涉及水稻的花时控制,异位表达可使烟草的花期提前,并且还可能参与控制营养生长中的分枝以形成更多的花芽.     

Paenibacillus massiliensis T7固氮基因簇nifBHDKENX的克隆、序列分析及铵和氧对nifB启动子的调控

Paenibacillus massiliensis T7是我室从北京郊区分离的一株革兰氏阳性、产芽孢的固氮菌. 根据GenBank中已发表的多种固氮生物nifH基因序列, 在其保守区域设计一对简并引物, PCR扩增获得324 bp的nifH片段. 用地高辛标记该片段为探针, 对EcoRⅠ和PstⅠ消化的P. massiliensis T7染色体DNA进行Southern杂交, 结果DNA/EcoRⅠ杂交道1.1 kb和9 kb处, DNA/PstⅠ杂交道1.3 kb和8 kb处分别有两条杂交带, 从而初步判断nifH可能有两个拷贝. 在324 bp nifH片段的基础上, 采用反向PCR扩增的方法, 获得了purD和nifBHDKENX基因. 在nifB的上游有一个类似σ⁵⁴型启动子的保守序列, 在该启动子上游有一个类似激活蛋白NifA结合位点. 分析表明, nifBHDKENX可能组成一个转录单元, 共用nifB上游的启动子. 将nifB启动子与报告基因lacZ相融合, 构建成表达载体pnifB-LacZ, 并转化到P. massiliensis T7中, 研究铵和氧对该启动子的表达调控. 结果表明, 在无氧条件下, 铵浓度为0%时, β-半乳糖苷酶的活性最高, 随着铵浓度的增加, 酶活性并没有明显的下降过程, 即使铵浓度达80 mmol/L时, 酶活也相当于无铵时的73.12%, 说明铵对nifB启动子有微弱的抑制作用, 而铵浓度一定, 氧浓度3%时, β-半乳糖苷酶活性最高, 提高氧浓度则酶活性开始下降, 当氧浓度高于20%时, β-半乳糖苷酶活性仅几个Miller单位, 说明氧对nifB启动子有明显的抑制作用.     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响

研究Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响。实验小鼠分为5组,每组有Smad3基因剔除小鼠（Smad3^-/-）和其同窝孪生的野生型小鼠（Smad3^+/+）各1只。小鼠的造血功能用14天形成的脾结节(CFUS14)、多系祖细胞（CFUGEMM）、粒单系祖细胞（CFUGM）、红系祖细胞（BFUE）测定及外周血象、骨髓象等实验血液学指标来确定。每组小鼠取尾血作白细胞、红细胞和血小板计数,涂片作白细胞分类计数。将一侧股骨的骨髓冲出,制成单细胞悬液,计数其中有核细胞数,测定CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM值。将每只小鼠的4×10⁴个骨髓有核细胞,经尾静脉注入3只8～10周经致死量射线照射的同系雌性小鼠体内,测定14天的CFUS。取一部分胸骨、肝脏、脾脏固定做病理切片,其余胸骨冲出骨髓,涂片作分类计数。结果Smad3^-/-小鼠外周血白细胞和血小板计数明显高于Smad3^+/+小鼠,红细胞数无显著差异。外周血白细胞分类结果也表明粒细胞显著增高。骨髓有核细胞数无显著差异,CFU-GM显著增高,BFU-E 无显著差异,CFU-GEMM明显减少,CFU-S显著减少。病理形态学观察发现骨髓增生极度活跃,以粒系为主,肝脾无显著差别。骨髓涂片分类表明粒系增多,粒系：红系比例增高。因此得出结论Smad3基因剔除使小鼠造血干祖细胞数目减少,而且干祖细胞分化异常,向粒系分化增多。Smad3基因对造血系统的作用与TGF-β的作用有相关性。     

猪卵母细胞c-mos基因表达以及RNA干扰

c-mos基因在动物卵母细胞减数分裂调控中起作用,但其作用机制目前仍不清楚。本实验通过RT-PCR、免疫荧光激光共聚焦检测方法检测了猪卵母细胞在体外成熟培养过程中c-mos基因在转录水平、翻译水平上的表达以及蛋白的分布,并应用注射小干扰RNA(siRNA)方法对其进行了RNA干扰(RNAi)研究。结果显示,猪卵母细胞在体外成熟培养过程中c-mos基因mRNA量逐渐增高,电激活后6h接近完全降解;MOS(c-mos基因蛋白产物)在GV卵母细胞生发泡中有一定量的表达,生发泡破裂(GVBD)前表达量增加且开始向卵母细胞胞质弥散,成熟培养44h未成熟卵母细胞中的MOS表达量要高于成熟卵母细胞,激活后6h核区MOS明显减少,但仍然有少量MOS分布于胞质中;成熟培养前干扰c-mos基因,所用三个siRNA都能成功敲低mRNA量,分别是同时期对照组mRNA量的0.08±0.03,0.11±0.06和0.20±0.06倍,干扰后虽然没有完全剔除MOS,但MOS量比同期卵母细胞有明显下降,仍可以引发成熟卵母细胞染色体解凝集。研究结果揭示了猪卵母细胞体外成熟及发育进程中c-mos基因在转录和翻译水平上的动态表达规律,建立了猪卵母细胞c-mos基因RNAi体系,为MOS在猪卵母细胞发育过程中的功能研究建立了重要的基础。     

不同渗透压调节剂对Candida krusei生理代谢的影响*

比较了氯化钠、氯化钾、甘露醇存在的高渗环境下克鲁氏假丝酵母(Candida kru-sei)的生理代谢。3种渗透压调节剂对C.krusei生理代谢影响有显著差异。与甘露醇相比,氯化钠和氯化钾对细胞生长的影响更为显著,而氯化钾对细胞的毒性则又小于氯化钠。细胞对糖的消耗速率依次为甘露醇>氯化钾>氯化钠。甘油和海藻糖是C.krusei在高渗环境下的主要相容性溶质。氯化钠和氯化钾对甘油合成的促进作用明显高于甘露醇。在0.6mol/L氯化钠、氯化钾、甘露醇存在时,细胞甘油浓     

疟蚊Anopheles gambiae和A. arabiensis嗅觉结合蛋白基因的鉴定和表达谱分型

嗅觉在疟蚊寄主发现行为过程中起主要作用. 基于生物信息学技术, 对按蚊嗅觉结合蛋白基因进行了全基因组分析, 结果总共鉴定了32条嗅觉结合蛋白(OBP)候选基因序列. 进一步采用半定量反转录聚合酶链反应(semi-quantitative RT-PCR), 以疟蚊激动蛋白基因为内部表达参照标准, 研究了冈比亚按蚊所有嗅觉结合蛋白候选基因的组织特异性表达谱. 结果显示: 其中20个OBP候选基因在嗅觉组织(雌蚊触角)中有强的表达, 这说明OBP在疟蚊嗅觉行为中起重要作用. 还研究了冈比亚按蚊复合体(A. gambiae complex)中两种最重要的疟蚊, 即冈比亚按蚊(A. gambiae)和阿拉伯按蚊(A. arabiensis)的蚊种嗅觉特异性表达型, 结果发现其中12个OBP候选基因显示种间差异表达, 同时发现阿拉伯按蚊触角中OBP的累积相对表达强度高于冈比亚按蚊, 其比例为1441.45︰1314.12. 这可能是由二者的不同寄主偏好行为所致, 因为冈比亚按蚊高度嗜吸人血, 而阿拉伯按蚊则介于嗜吸人血和嗜畜血之间, 因此后者需要表达更多的OBPs以支持其寄主选择行为模式. 疟蚊OBP基因的鉴定及其组织和蚊种特异性表达型的确定, 是分析疟蚊嗅觉探测的分子机制的第一步, 如嗅觉结合蛋白重组表达及其配体鉴定.     

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.F26过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

从一株低度嗜盐、兼性嗜碱芽孢杆菌Bacillussp .F2 6中纯化得到一种碱性过氧化氢酶 ,并对该酶进行了性质研究。纯化过程经硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析及疏水层析四步最终获得电泳纯的目标酶 (纯化 58.5倍 )。该过氧化氢酶的分子量为140kD ,由两个大小相同的亚基组成。天然酶分子在40.8nm处显示特征吸收峰 (Soretband)。吡啶血色素光谱显示了酶分子以原卟啉Ⅸ (protohemeⅨ )作为辅基。计算获得酶的表观米氏常数为 32.5mmol/L。该过氧化氢酶不受连二亚硫酸钠的还原作用影响 ,但被氰化物、叠氮化物和 3-氨基-1,2 ,4-三唑 (单功能过氧化氢酶的专一抑制剂 )强烈抑制。以邻联茴香胺、邻苯二胺和二氨基联苯胺作为电子供体测定酶活时 ,该酶不显示过氧化物酶活性。同时 ,酶的N_端序列比对结果说明 ,该过氧化氢酶与单功能过氧化氢酶亚群有一定的相似性 ,而与双功能过氧化氢酶亚群及猛过氧化氢酶亚群均没有同源性。因此 ,本文将纯化的碱性过氧化氢酶定性为单功能过氧化氢酶。此外 ,该酶具有热敏感的特点 ,且酶活在Ph 5～ 9的范围内不受pH影响 ,此后 ,活性随着pH的升高而升高,并在pH11处有明显的酶活高峰。20℃、pH11条件下的酶活半衰期达49h.在pH11的高碱条件下表现出最高活力和一定的稳定性,这在已报道的过氧化氢酶中还未见描述。同时,该酶也显示了良好的盐碱稳定性,0.5mol/L NaCl、pH10.5条件下的酶活半衰期达90h.另一方面,本文所研究的过氧化氢酶是第一个来源于嗜碱微生物的同源二聚体单功能过氧化氢酶,也是第一个来源于天然碱湖的单功能过氧化氢酶,它能部分地反映出细胞抗氧化体系对相应环境的适应情况。     

菌核寄生菌Talaromyces flavus的生物学特性及寄生菌核规律初探

本文对核盘菌菌核寄生菌Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｆｌａｖｕｓ的基本生物学特性及影响其寄生菌核的生态因子进行了初步研究。结果表明：Ｔ.Ｆｌａｖｕｓ在我国南北方菌核病发生区土壤中普遍存在。其菌丝在３－３５℃及ｐＨ值２－１０范围内均能生长及产孢,最适生Ｋ温度为３０℃,最适生长ｐＨ值为４。对峙培养结果表明Ｔ,fｌａｖｕｓ对核盘菌的抗生作用微弱,对菌丝和菌核均有很强的寄生致腐作用。除核盘菌外它还能寄生三叶草核盘菌、小核盘菌及离菌上的一种待鉴定的产菌核真菌。Ｔ,ｆｌａｖｕｓ     

TFAR19基因对MEL细胞在小鼠体内流变学特性和致病性的影响

将依托泊甙(etopside, VP16)、MEL细胞和MEL-TF19细胞注射到小鼠体内, 观测4周 时间内小鼠的血象、肝脏和脾脏的组织学, 以及血液流变学指标变化. 结果表明: 注射MEL细胞使小鼠发生了类似于红白血病的病征, 表现为肝脾组织受损、骨髓和脾脏细胞涂片出现大量的原红、早幼和中幼红细胞, 红细胞的变形和取向能力明显下降; 而携带了TFAR19基因的MEL-TF19细胞对小鼠的致病性明显小于MEL细胞, 并且在化疗药物诱导凋亡的作用下, MEL-TF19细胞完全失去了原本较弱的致病性. 动物实验的结果提示, TFAR19基因可以抑制MEL细胞对小鼠的致病性, 并且在化疗药物VP16的协同下可发挥更好的作用.     

IGF2基因对鸡生长及屠体性状的影响及印记状况的研究

以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F₂代鸡群为实验材料, IGF2基因作为控制鸡生长、屠体性状主基因的候选基因, 通过PCR-SSCP方法对IGF2基因多态性进行检测. 该基因外显子2中有一个单核苷酸多态性位点, 即71位碱基由C突变为G. 对F₂鸡群个体进行了基因型鉴定, 经方差分析表明：该基因对部分生长、屠体性状有显著性影响(如胸角宽、腺胃重、半净膛重等). 研究表明该基因可能调控鸡生长、屠体性状的表达, 或与控制生长、屠体性状的主基因连锁. 进一步分析发现, 正反交结果不一致, 即杂合子AB(父本等位基因在前)出生重、胸肌重较杂合子BA高, 而腹脂重后者较前者高. 另选丝毛乌骨鸡家系做IGF2印记状况检测, 杂合子与纯合子进行正反交, 然后检测后代基因型并选取杂合子, 利用RT-PCR-SSCP检测表达情况, 结果表明, 鸡的IGF2基因不受印记控制. 交互效应可能是由于其他遗传因素作用的结果.     

p53对restin基因转录表达的调控作用

restin基因是Zhu等人从全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)诱导肿瘤细胞分化时克隆得到的一种黑色素瘤抗原相关基因. 前期研究表明, 该基因与细胞周期阻滞有关. 由于p53在细胞增殖调控中占据重要地位, 并且与维甲酸具有诱导关系, 因此本研究试图揭示维甲酸诱导restin基因表达是否与p53有关. 将p53转染真核细胞, 研究restin与p53的表达关系. 结果表明p53能诱导restin基因转录增加. 进一步分析发现, restin基因5¢端上游约2 kb基因组序列中存在p53蛋白结合位点. 扩增该序列构建荧光报告系统, 检测到该报告系统可以接受维甲酸的诱导调控. 在此基础上, 研究p53对缺失p53结合位点的截短体报告质粒和p53结合位点突变后的报告质粒的作用, 结果显示p53调控restin基因的表达与该基因上游序列区中的p53结合位点无关, 推测p53对restin基因的表达调控可能还存在其他分子的相互作用.     

一氧化氮和氧自由基诱导缺氧再给氧心肌细胞凋亡的bcl-2和p53信号通路研究

观察了心肌缺氧再给氧损伤的一氧化氮(nitric oxide, NO)和氧自由基机制. 新生Wistar大鼠心肌细胞置于95% N₂ /5% CO₂环境培养24 h, 然后置于95% O₂ /5% CO₂环境培养4 h造成缺氧再给氧心肌细胞损伤模型. 单纯缺氧组心肌细胞置于95% N₂/5% CO₂环境培养24 h, 但不再给氧. NO供体硝普钠(SNP, 5 mmol/L)、NO合酶抑制剂Nw-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME, 100 mmol/L)和其异构体Nw-硝基-D-精氨酸甲酯(D-NAME, 100 mmol/L)以及超氧化物歧化酶/过氧化氢酶(SOD/CAT, 各100 U/mL)分别于缺氧前加入培养基. 正常对照组心肌细胞置于95% 空气/5% CO₂环境下培养. 结果显示, 缺氧24 h能增加培养介质中NO, 硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和乳酸脱氢酶(LDH)水平, 再给氧降低培养介质中NO和 水平, 增加TBARS和LDH水平. 缺氧上调bcl-2和p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 而再给氧下调bcl-2蛋白表达水平, 上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平. 同时, 缺氧增加心肌细胞凋亡率, 而再给氧增加心肌细胞坏死率. NO供体硝普钠(SNP)增加培养介质中 和TBARS水平, 下调bcl-2蛋白表达而上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 增加DNA断裂、凋亡及坏死细胞率. L-NAME和 SOD/CAT分别降低培养介质中 和TBARS水平, 它们均能上调bcl-2蛋白表达而下调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 抑制DNA断裂、凋亡及坏死细胞率, 而D-NAME则无此作用. 以上结果表明, 在缺氧再给氧所致心肌细胞死亡过程中, NO和氧自由基参与下调bcl-2蛋白表达水平和上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 相应地激发细胞凋亡程序, 并提示一氧化氮及氧自由基诱导心肌细胞凋亡的机制与调节 bcl-2和p53和p21/waf1/cip1信号通路有关.     

Neotyphodium coenophialum和N.lolii的PCR检测*

以N·coenophialum和N·lolii及其近似种N·huerfanum、N·chisosum、N·aotearoae、N·sp·共6个种18个菌株及苇状羊茅和多年生黑麦草8个品种的供试种子,通过对Tub-2基因引物IS1~IS3和NC25基因引物F1~R1进行扩增,设计了种子中Neotyphodium属内生真菌套式扩增的通用引物Tub-2-F~Tub-2-R,设计了N·coenophialum和N·lolii的特异引物F3~R3     

p18INK4C基因缺失增强造血干细胞在亚致死剂量

观察p18^INK4C (p18)基因缺失对造血干细胞(HSC)在亚致死剂量照射小鼠体内长期植入的影响. 供体为p18基因缺失型(p18^-/-)纯系C57BL/6小鼠(CD45.2表型), 竞争性细胞来源于C57BL/6-Ly5.1(CD45.1/2)双表型小鼠, 受体为野生型(p18^+/+)C57BL/6-Ly5.1(CD45.1)小鼠. 竞争性骨髓移植(cBMT)实验根据受体小鼠照射剂量的不同分为3个剂量组(10 Gy, 5 Gy和1 Gy). 供体细胞和竞争性细胞1:1混合后移植, 移植后采集外周血和骨髓细胞用流式细胞仪检测各细胞比例. 造血恢复移植实验: 移植后检测外周血白细胞计数评价移植后造血恢复速度. 10和5 Gy照射剂量组, 供体细胞和竞争性细胞成功植入, 而1 Gy照射剂量组无供体细胞植入. 无论在10 Gy或是5 Gy照射剂量情况下, 供体细胞在受体内的比例均高于竞争性细胞. 移植后6周, 10和5 Gy照射剂量时外周血中供体细胞比例分别为竞争性细胞的1.46±0.21倍和1.64±0.43倍, 14周时分别为竞争性细胞的1.84±0.25倍和2.00±0.49倍, 26周时分别为竞争性细胞的3.13±0.79倍和3.24±1.33倍. 移植后6个月, 10 Gy照射剂量时骨髓细胞中供体细胞比例为竞争性细胞的7.68±4.42倍, 5 Gy照射剂量时为竞争性细胞的10.83±2.98倍. 移植后6个月, 在10和5 Gy照射剂量组之间骨髓中造血细胞植入率相当, 分别为(85.53±8.71)%和(80.87±2.87)% (P = 0.457). p18^-/-细胞与p18^+/+细胞相比, 移植后造血恢复的速度相当. p18基因缺失可以显著增强HSC在亚致死剂量照射小鼠体内的长期植入能力.     

人清道夫受体AII胞外部分在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达

清道夫受体A (SR-A)介导巨噬细胞无限制摄取修饰的低密度脂蛋白 (Mldl)形成泡沫细胞 ,继而形成动脉粥样硬化病灶 ,在动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用 ,被认为是治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。本文应用RT PCR方法扩增得到编码人Ⅱ型SR A胞外部分 (shSR AII)的Cdna ,将其克隆至毕赤酵母 (Pichiapastoris)分泌表达载体Ppic9k构建重组表达质粒P9k shSR AII。将重组表达质粒线性化后 ,电转化毕赤酵母GS115 ,用原位双膜法筛选获得高表达shSR AII的重组菌株GS115 P9k shSR AII。重组菌株经 1%甲醇诱导 ,SDS PAGE、Westernblot分析表明shSR AII获得了分泌表达。Ligandbindingblot结果表明表达的shSR AII具有与配基oxLDL结合的生物活性。U937泡沫细胞模型进一步表明shSR AII可通过竞争性结合oxLDL来抑制泡沫细胞的形成 ,为以shSR AII为靶点建立抗动脉粥样硬化药物筛选模型奠定了基础.     

以染料为底物的Trametes hirsuta降解反应体系的建立*

建立Trameteshirsuta的生长繁殖和对模式染料比布列希猩红脱色降解的反应体系 ,研究表明 :菌的生长与降解活动的适宜温度为 30℃ ,静培养 ;培养基组分对脱色降解的影响不大 ;从便于观察和缩短反应周期考虑 ,土豆液体培养基有明显的优点 ,可作为建立Trameteshirsuta反应体系的首选培养基。菌对比布列希猩红、直接深蓝L 3RB、活性艳蓝X BR、碱性紫 5BN和亚甲基蓝等均有较好的脱色降解效果。     

TFAR19基因对小鼠红白血病MEL细胞生长及其流变学特性的影响

通过脂质体介导基因转染的方法, 获得了稳定携带TFAR19基因的小鼠红白血病细胞系MEL-TF19. 经Western blot证实该细胞系有TFAR19蛋白表达. 生长曲线及流式细胞仪检测结果表明, 转染TFAR19基因后MEL细胞生长受到抑制, 并且在凋亡诱因的存在下使细胞凋亡率增高. 流变学研究结果显示, 转染TFAR19基因在加速MEL细胞凋亡的同时, 使细胞对低渗的抵抗力降低, 渗透脆性加大, 细胞表面电荷减少, 电泳率降低; 与细胞最大变形能力呈负相关的弹性模量K₁增加, K₂无明显变化, μ 明显减小. 以上结论从生物流变学角度为全面、深入地认识凋亡新相关基因TFAR19的功能提供了理论基础.     

黑麦草(Lolium perenne L.)内生真菌的检测、分离及鉴定*

从多年生黑麦草(LoliumperenneL.)5个品种———SR4000、Pinnacle、Topgun、CalypsoⅡ、Justus中分离出61个菌株。次培养后,所得形态稳定的菌株可分为4个形态群,依据其形态特征及APPCR的结果,确定其中的57个分离菌株为Neotyphodiumlolii。