大鼠p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建大鼠p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)cDNA序列的绿色荧光真核表达载体并鉴定其在人胚肾293(human embryo kidney 293,HEK293)细胞中的表达.方法:采用PCR方法从含野生型大鼠p75NTR的pDC316-RP75质粒中扩增目的片段,经EcoRⅠ和SaⅡ双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达栽体pEGFP-N1-RP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及免疫组织化学法鉴定大鼠p75NTR的表达.结果:重组质粒经酶切鉴定和序列分析证实含有大鼠p75NTR的编码序列,转染后经激光共聚焦显微镜及免疫组织化学染色观察表明重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的大鼠p75NTR片段.结论:大鼠p75NTR绿色荧光真核表达栽体构建成功并可在HEK293细胞中表达,为进一步研究奠定了基础.     

重组人神经生长因子rh-β-NGF真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为大量制备β-NGF,构建了一种稳定、高效表达重组人神经生长因子(Recombinant human nerve growth factor,rh-β-NGF)的真核表达载体及含该重组载体的HEK293细胞株。首先,构建重组质粒p CMV-β-NGF-IRES-dhfr并转染至HEK293细胞系,用MTX加压筛选和有限稀释法进行选择,获得高效表达rh-β-NGF的单克隆重组细胞株;随后逐步降低血清培养,最终使细胞株完全适应无血清培养基并稳定表达rh-β-NGF;SDS-PAGE分析该表达产物,可见相对分子质量约13 k Da的条带,纯度大于50%,经质谱法测定得到其肽图谱与理论序列完全匹配,接着利用离子交换层析和分子筛层析纯化rh-β-NGF;最后进行重组细胞株表达效率和表达稳定性检测,表明重组细胞株可稳定、高效表达rh-β-NGF,其分泌效率大于20 pg/(cell?d),并能诱导PC12细胞的分化,具有良好的生物学活性。     

肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。     

腺病毒E1B-19K基因过表达对HEK293细胞生长和代谢的影响

细胞凋亡是动物细胞大规模培养中影响活细胞密度和目的产品质量的重要因素,过表达抗凋亡基因是目前常用的提高工程细胞凋亡抗性的一种策略。拟在HEK293细胞中过表达腺病毒E1B-19K基因,挑取了不同E1B-19K表达水平的单克隆细胞,考察在不同培养条件下细胞的凋亡水平和代谢情况。E1B-19K的过表达可显著增强细胞在低葡萄糖、低血清和无谷氨酰胺3种培养条件下的抗凋亡能力,使凋亡细胞比例降低60%~80%;E1B-19K的过表达可使批次培养HEK293细胞的衰退期延迟2天,而对细胞的葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺等的代谢无显著影响。结果表明,过表达E1B-19K是一种有效减缓HEK293细胞在培养过程中凋亡的策略。     

人Bcl2基因真核表达载体的构建及其抗凋亡功能研究

目的:构建带myc标签的Bcl2真核表达载体,获得myc-Bcl2融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Bcl2编码序列,将其插入p CMV-myc载体,Western印迹检测表达情况;将重组质粒与空载体分别转染乳腺癌MCF-7细胞,通过流式细胞仪检测p CMV-myc-Bcl2重组质粒对细胞凋亡的影响。结果:双酶切和测序结果表明p CMV-myc-Bcl2真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后myc-Bcl2蛋白成功表达;流式细胞仪检测结果显示,myc-Bcl2明显抑制乳腺癌细胞系的凋亡。结论:构建了带myc标签的人Bcl2真核表达载体,为进一步研究Bcl2在细胞凋亡中的功能奠定了基础。     

GLT-1基因siRNA真核表达载体的构建及其在大鼠神经胶质细胞中的抑制效应

目的:研究特异性siRNA对大鼠神经胶质细胞中GLT-1基因的阻抑效果。方法:根据GLT-1基因的序列特点和RNAi设计原则,设计其shRNA的核苷酸片段。退火后将其克隆入pSupressorNeo,构建可表达大鼠GLT-1基因siRNA的重组真核表达质粒pSuppressorNeo-GLT-1;利用脂质体法将其转染神经胶质细胞后,用RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法等方法检测转染的神经胶质细胞中GLT-1基因的表达水平。结果:瞬时转染的神经胶质细胞中GLT-1基因的表达受到明显抑制,GLT-1蛋白含量明显下降。结论:pSuppressor-Neo-GLT-1质粒构建成功,瞬时转染神经胶质细胞后可以明显抑制GLT-1基因的表达。     

Prohibitin特异性MiRRNAi表达载体构建及其干扰效果测定

目的：构建携带prohibitin（PHB-1）基因的MiRRNAi真核表达载体pcDNA^TM 6．2-GW／EmGFP-MiR,并观察其转染HEK293细胞株前后PHB-1的表达变化。方法：根据GenBank中prohibifin的序列,设计特异的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链,克隆至pcDNA^TM6．2-GW／EmGFP-MiR质粒缺口末端,连接在质粒上生成含MiRRNAipcDNA^TM6．2．GW／EmGFP-MiR-PHB载体,测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至HEK293细胞中,用Westernblotting检测干扰后HEK293细胞内PHB-1表达的变化。结果：将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。Westernblotting检测结果证实构建的PHB-1 MiR RNA表达重组体可显著抑制HEK293细胞内PHB-1的表达。结论：成功构建了携带PHB-1基因的MiR RNAi真核表达载体。     

犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽.为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达.结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank 编号:NM-001024641)的同源性为99.7%.表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外.为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础.     

镉诱导HEK293细胞凋亡及其线粒体凋亡途径

本课题研究了氯化镉(CdCl_2)诱导HEK293细胞(人胚胎肾细胞系)的凋亡,初步探讨了凋亡过程中Caspase-3、Bcl-2的变化和凋亡诱导因子(AIF)的转移以及它们的意义。MTT法检测CdCl_2对HEK293细胞增殖的抑制作用;通过倒置显微镜、电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术、激光共聚焦观察细胞凋亡;应用Western blot法和荧光免疫法测定Caspase-3酶原、Bcl-2蛋白的变化以及检测AIF蛋白在细胞中的定位。结果显示:CdCl_2对HEK293细胞具有显著的生长抑制作用,并呈明显的剂量和时间依赖性。在琼脂糖凝胶电泳中,显示有凋亡细胞特有的DNA梯状条带,其中30μmol/L作用6-9h梯状条带最为清晰,时间过长或浓度过高则梯状条带逐渐模糊,表明镉浓度过高或处理时间过长,细胞有坏死。流式细胞仪检测也印证了这一结果。形态学观察可见明显的细胞凋亡特征。同时线粒体膜电位明显下降,发现Caspase-3酶原蛋白、Bcl-2蛋白含量减少,并具有时间依赖性;另外检测到线粒体AIF向细胞核转移。而Bcl-2转染后有一定的抑制凋亡作用。实验结果提示,CdCl_2能够诱导HEK293细胞凋亡,线粒体损伤导致AIF转移与细胞色素c释放,从而引发的非Caspases与Caspases凋亡途径可能在镉引发的细胞凋亡过程中起重要作用,而Caspase-3, Bcl-2起着重要的调控作用。     

甲型流感病毒M1基因真核表达载体的构建及其表达

研究旨在构建含有甲型流感病毒M1基因的真核表达载体,并探讨其在真核细胞中的表达.提取流感病毒Influenza A/FM/1/47 (H1N1) RNA,RT-PCR扩增M1基因并将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到Vero细胞,免疫荧光技术鉴定其表达.甲型流感病毒M1蛋白重组质粒pcDNA3.1-M1的成功构建,为开发研制流感病毒保守蛋白DNA疫苗奠定了基础.     

幽门螺杆菌VacA真核表达载体的构建及其诱导细胞空泡化和凋亡

目的：研究幽门螺杆菌空泡毒素作为单一毒力决定簇对真核细胞的作用。方法：用PCR扩增VacA基因片段,克隆入真核表达载体pEGFP—N1,构建重组质粒pEGFP—VacA,转染HeLa细胞,通过相差显微镜和电子显微镜观察细胞形态与结构的变化。结果：重组质粒转染HeLa细胞24h,10％一20％细胞的胞质内出现明显空泡,其中少数细胞发生凋亡改变。结论：成功构建了用于真核表达的重组VacA质粒,转染真核细胞后,观察VacA作用导致的细胞形态结构的变化,为研究VacA作为单一毒力决定簇对真核细胞的作用奠定了基础。     

大鼠大麻素Ⅰ型受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠大麻素型Ⅰ受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体并观察其在细胞中的表达。方法:大鼠CB1基因序列设计引物,以大鼠脑组织为模板扩增CB1基因编码区片段,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3中,构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,通过观察EGFP报告基因的表达以及免疫荧光,Western Blot方法鉴定CB1可在真核细胞中过表达情况。结果:构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP,单双酶切和测序验证正确。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞膜表达。免疫荧光试验也证明重组载体转染后,CB1基因和GFP共同定位于胞膜部分。Western Blot实验证明表达CB1蛋白。结论:成功构建了高表达的CB1-EGFP融合蛋白真核表达载体。     

UBAP1 基因真核表达载体的构建 及对人鼻咽癌细胞生长的影响

为研究鼻咽癌相关新基因 UBAP1 的功能,探讨其对鼻咽癌细胞生长特性的影响,构建了 UBAP1 真核表达载体并转染到鼻咽癌细胞株 HNE1 中,借助细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、裸鼠接种和流式细胞计数方法对转染细胞的生物学行为进行了检测 . 结果显示, UBAP1 基因转染细胞生长速度明显减慢,在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降,裸鼠接种试验显示, UBAP1 基因转染细胞 HNE1 生长速度受到抑制,流式细胞计数分析发现, UBAP1 基因表达升高能延缓细胞由 G0-G1 期进入 S 期 . 因此, UBAP1 基因的表达有助于 HNE1 恶性表型的逆转,初步证明 UBAP1 是一个鼻咽癌相关的抑瘤基因 .     

靶向NBS1基因的 microRNA真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建靶向NBS1基因的 microRNA真核表达载体,鉴定其转染宫颈癌细胞株Hela后的生物活性?方法:根据NBS1mRNA序列设计合成四对pre- microRNA片段,定向克隆到pcDNA 6.2- GW/ EmGFP-miR真核表达载体上,并将其转染至Hela细胞株中?采用菌落PCR和测序分析鉴定插入序列的完整性;采用实时定量PCR分析鉴定重组体对NBS1mRNA表达的干扰效果以确定其生物活性? 结果:构建的四组重组体插入片段的碱基序列完全正确?重组体能干扰Hela细胞NBS1基因的表达,四组重组体NBS1 mRNA表达量分别为: 0.24±0.17 (NBS1mi-1组)?0.12±0.12 (NBS1mi-2组)?0.41±0.97 (NBS1mi-3组)?0.48±0.93 (NBS1mi-4组),其中NBS1mi-2组表达最低? 结论: 构建的四组NBS1 microRNA重组体在Hela细胞株中都具有生物活性, 且NBS1mi-2组的干扰作用最强? 载体构建成功,为应用microRNA靶向NBS1的肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。     

雌激素受体a真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建雌激素受体a(ERa)的真核表达载体并在293T细胞内进行表达鉴定.方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增ERa基因序列,回收片段,BamHI、XhoⅠ双酶切片段及pcDNA3.0载体,将其连接并转化到DH5a感受态细胞中.酶切鉴定阳性克隆,转染293T细胞进行western blot实验,检测pcDNA3.0-ERa载体的表达.结果:获得了雌激素受体a的真核表达载体pcDNA3.0-ERa.结论:本研究成功构建了雌激素受体a的真核表达载体pcDNA3.0-Era,为研究雌激素及其受体在心血管系统中的作用提供了基础.     

人Dcp1a基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的定位

人脱帽酶Dcp1a(human m RNA decapping enzyme 1a)是m RNA降解过程中的重要成员之一,构建其真核表达载体,并对其表达和细胞内定位进行分析,可为进一步研究Dcp1a的功能提供基础。本研究以He La c DNA文库为模板,采用PCR方法扩增Dcp1a c DNA全长序列并克隆到pm Cherry-N1载体。转化大肠杆菌DH5α后,挑取阳性克隆提取质粒,分别进行Xho I/Sal I双酶切及测序鉴定。将重组质粒用Vigo Fect转染试剂转染He La细胞,随后用RT-PCR和Western-blot检测Dcp1a在He La细胞中的表达,并采用激光共聚焦显微镜观察Dcp1a的亚细胞定位情况。通过DNA测序分析证实目的基因Dcp1a的序列完全正确,人Dcp1a基因真核表达载体pm Cherry-N1-Dcp1a构建成功,并在He La细胞中获得表达;激光共聚焦显微镜观察显示Dcp1a蛋白定位在细胞质中,而且He La细胞中过表达Dcp1a在胞质中明显形成了P小体(processing body,P-body)。实验结果为进一步探讨该基因的功能及其与P小体的相关性奠定了基础。     

细胞凋亡基因的发现

细胞凋亡基因的发现李雨民,孙元明（中国医学科学院放射医学研究所天津３００１９２）细胞凋亡是一种具有特征性的形态变化和生化改变的细胞死亡过程,机体启动这一机制以清除无用和有害的细胞。近来细胞凋亡基因的研究取得了很大进展,８０年代以来Ｈｏｒｖｉｔｚ等在研...     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C1-PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位.方法:采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达栽体,脂质体Lip2000介导转染MDA-MB-231细胞,real-time PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位.结果:酶切和测序结果证实重组质粒含有PPARγ编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布.结论:成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA-MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核.     

核转录因子TR3小干扰RNA载体的构建及其效果鉴定

目的：构建核孤儿受体TR3的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并进行沉默效果测定。方法：根据TR3 mRNA序列和载体psiSTRIKE的粘性末端,设计合成TR3的干扰RNA序列,退火后克隆至psiSTRIKE,经测序鉴定后用阳离子脂质体将重组子和TR3高表达载体TR3-pcDNA共转染至HEK293细胞中,以Western blotting检测干扰后HEK293细胞内TR3表达的变化。结果：Western blotting检测结果证实构建的TR3 siRNA表达重组载体可显著抑制HEK293细胞内TR3的高表达。结论：构建了核孤儿受体TR3 siRNA真核表达载体。     

牛pAcGFP-FADD融合蛋白真核表达载体构建及在CHO-K1细胞中的表达

FADD是Fas/FasL系统的一个信号连接蛋白,通过传递凋亡信号,介导细胞凋亡.为了揭示FADD在牛卵泡发育过程中的调控作用,采用RT-PCR从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将其cDNA终止密码子删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建融合蛋白重组质粒,经BglⅡ/EcoR Ⅰ酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染CHO-K1细胞,观察有无荧光的表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、表达情况.结果表明,成功克隆牛FADD基因,通过PCR方法在FADD阅读框两端引入了Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ克隆位点,并于起始位点前加入Kozak序列,成功构建pAcGFP- bFADD融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染CHO-K1 24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染效率可达65%,通过RT-PCR扩增出654 bp的转录产物,并用Western blotting检测到51.4 kD目的蛋白的表迭.