土壤中高产蛋白酶菌株产酶条件及酶学性质

【背景】微生物蛋白酶已经成为工业用蛋白酶的主要来源,筛选具有特殊环境适应性的微生物成为生物酶资源的开发热点。【目的】通过对青藏高原土壤微生物产蛋白酶菌株的筛选、优化及相关特性研究,寻找新的蛋白酶资源,为高原菌种资源利用提供科学依据。【方法】采用形态学和分子生物学对筛选菌株进行菌种鉴定,利用单因素试验和正交试验对菌株进行发酵条件优化及酶学性质的探究。【结果】筛选出一株高产蛋白酶菌株XC2,经鉴定菌株XC2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。XC2最优产酶条件:可溶性淀粉4.0%,牛肉膏1.0%,K~+0.6%,培养温度34°C、初始pH 7.0、接种量2.0%的条件下200 r/min振荡培养13 h,所产蛋白酶活力最高为638.5 U/mL。XC2所产蛋白酶最适反应温度60°C,最适pH9.0;40-50°C、pH8.0-10.0条件下酶活稳定性较高;Mn~(2+)对酶活力有明显激活作用,而Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Fe3+对酶活力有明显抑制作用。【结论】枯草芽孢杆菌XC2有较强的产碱性蛋白酶的能力,具有较好的应用前景。     

家蚕肠道枯草杆菌产蛋白酶的发酵条件与酶学性质

肠道微生物分泌的蛋白酶可促进家蚕对桑叶养分的消化吸收,枯草芽孢杆菌是家蚕肠道内一种重要的产蛋白酶菌株。为提高枯草芽孢杆菌蛋白酶的高效利用,对该菌株适宜发酵条件及酶学性质进行了研究。结果表明：各因素对枯草芽孢杆菌产酶活性影响的大小顺序依次为：pH值〉培养温度〉培养时间〉装液量;最适的产酶条件为：pH=7,培养温度：30 ℃,培养时间：36 h;对枯草芽孢杆菌产蛋白酶进行初步提纯后并研究得出该酶反应的最适pH 10.0,最适反应温度为：60 ℃;该酶为碱性蛋白酶、不耐高温、不耐酸,但在35 ℃条件下热稳定性较好。     

碱性纤维素酶革兰氏阴性菌株筛选及酶学性质研究

用CMC平板筛选方法,从造纸厂碱性淤泥中获得透明圈直径大于30mm的产碱性纤维素酶革兰氏阴性菌H8005。液体摇瓶培养产生碱性CMC酶活力高达4．2IU／mL。酶学性质初步研究显示,H8005产生的CMC酶反应的pH值以8．0左右为适;在碱性条件下具有较高的酶活和一定的稳定性;反应温度以55℃左右为宜;且具有较好的温度稳定性。Mn^2＋与Fe^3＋对酶反应有促进作用,Cu^2＋和Pb^2＋对酶反应有抑制作用。该菌产生的纤维素酶在棉织品的水洗整理及洗涤剂工业中具有非常良好的应用前景。     

碱性纤维素酶革兰氏阴性菌株筛选及酶学性质研究*

用CMC平板筛选方法,从造纸厂碱性淤泥中获得透明圈直径大于30mm的产碱性纤维素酶革兰氏阴性菌H8005。液体摇瓶培养产生碱性CMC酶活力高达4.2 IU/mL。酶学性质初步研究显示,H8005产生的CMC酶反应的pH值以8.0左右为适;在碱性条件下具有较高的酶活和一定的稳定性;反应温度以55℃左右为宜;且具有较好的温度稳定性。Mn²⁺与Fe³⁺对酶反应有促进作用,Cu²⁺和Pb²⁺对酶反应有抑制作用。该菌产生的纤维素     

地衣芽孢杆菌TG116胞外蛋白酶产酶条件与酶学性质

【背景】从独角莲中分离得到的地衣芽孢杆菌TG116是一株对植物病原菌具有广谱抗性作用的生防菌株。【目的】优化TG116的产酶条件并探索其酶学性质,进一步了解其抗菌机制。【方法】采用Folin-Phenol显色法与响应曲面法,优化菌株TG116的产酶条件并研究其蛋白酶的酶学性质。【结果】菌株TG116产酶最适条件为:温度40.83°C,p H 8.01,发酵时间53.74 h,增加通气量可以显著提高酶活力。按照优化后的条件培养48 h后,上清液蛋白酶活力从57.46 U/mL达到了254.07 U/mL。酶学性质研究表明:该酶为碱性蛋白酶,最适反应pH为8.5,最适反应温度为50°C,具有良好的温度和pH稳定性,EDTA对酶活具有强烈的抑制作用,金属离子Mg~(2+)、Ca~(2+)、Na~+、Co~(2+)、K~+等对酶活也具有一定的抑制作用。【结论】菌株TG116具有良好的p H与温度稳定性,在实际应用中蛋白酶不易失活,可以分解真菌的细胞壁蛋白成分,破坏细胞壁结构,从而抑制甚至杀死病原菌,达到抗菌作用。     

磷脂酰胆碱特异性和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C酶学性质及其在油脂脱胶中的应用

通过基因工程方法将具有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)特异性磷脂酶C(PC-PLC)和磷脂酰肌醇(PI)特异性磷脂酶C(PI-PLC)基因分别在枯草芽孢杆菌WB800中进行胞外表达。对2种重组蛋白粗酶的酶学性质进行研究,并探究其用于油脂脱胶中的效果。结果表明:PC-PLC和PI-PLC均在30～45℃和中性偏酸的条件下具有较好的稳定性,2 h后残余活性仍在60%以上。Zn~(2+)、Mg~(2+)对PC-PLC的活性有促进作用,而Ca~(2+)对PI-PLC的活性有促进作用。油脂脱胶研究结果表明,PC-PLC的最适脱胶条件为50℃、pH 6.0、反应2 h、酶添加量为80 mg/kg;PI-PLC的最适脱胶条件为45℃、pH 7.0、反应2 h、酶添加量为60 mg/kg。PC-PLC和PI-PLC联合脱胶实验中大豆毛油中磷含量从531 mg/kg降至4.1 mg/kg,此时甘油二酯(DAG)含量增加0.95%。     

产低温纤维素酶放线菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究

从青藏高原采集的牦牛粪中,经过CMC平板分离得到一株产低温纤维素酶能力较强的放菌Tibet-YD5227-2,经16S rDNA序列比对分析将其初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.),目前尚无链霉菌产低温纤维素酶的研究报道。Tibet-YD5227-2液体摇瓶培养产生低温CMC酶活力高达145U/mL,最适产酶温度25℃,最适产酶pH值为8.0。酶学性质初步研究显示,Tibet-YD5227-2产生的CMC酶反应温度以35℃左右为适,反应的pH值以8.0左右为适,该菌株所产的纤维素酶在中碱性条件具有较强的稳定性;K+、Fe2+、Mg2+对酶反应有促进作用,Hg2+、Cu2+对酶反应有抑制作用。     

丁鳜肠道中枯草芽孢杆菌蛋白酶的生理生化性质的研究

目的:为改良丁鳜饲料成分,研究了从丁鳜肠道中分离的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蛋白酶的生理生化性质.方法及结果:枯草芽孢杆菌经发酵培养,破碎细胞,通过45%～85%饱和度的硫酸铵沉淀分离得到了一种碱性蛋白酶,SDS～PAGE显示该蛋白酶分子量为59kD;最适温度为40℃;温度的稳定性范围在50℃以下;最适pH9.8.低浓度的EDTA对该酶无明显抑制作用;Ca2+和Co2+完全抑制该酶的活性,Pb2+对酶活力有一定抑制作用.结论:新分离出的这种蛋白酶有助于进一步开发含有添加蛋白酶制剂的鱼饲料.     

细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的诱导型异源表达

【目的】实现地衣芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达,并研究该重组酶的酶学性质。【方法】克隆巨大芽孢杆菌木糖异构酶基因的启动子区域及其调控蛋白,构建一个大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭型诱导表达质粒,使用该诱导型启动子介导麦芽糖淀粉酶编码基因,实现其在枯草芽孢杆菌中的功能表达。对重组枯草芽孢杆菌的诱导条件进行优化,提高麦芽糖淀粉酶的产量。【结果】获得了诱导表达麦芽糖淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。最适诱导温度为45°C,最适诱导剂添加浓度为1%,最适添加诱导剂时间为接种培养9 h后。重组酶蛋白分子量大小为67 k D,对该酶的酶学性质研究发现,以可溶性淀粉为底物,反应生成麦芽糖和葡萄糖,其中麦芽糖含量为60.42%。重组酶最适作用温度为45°C,最适作用p H为6.5,Ca2+、Co2+、EDTA对该重组麦芽糖淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统可以实现麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导型表达,酶活最高可达296.64 U/m L发酵液,在工业上有着较好的应用前景。     

纤维素降解菌Aspergillus sp. YN1的产酶条件及酶学特性

从牛羊粪堆肥中筛选出一株纤维素降解菌Aspergillus sp.YN1,主要研究了液体发酵培养基中碳源、氮源、培养温度、起始pH、通气量以及接种菌龄对菌株YN1的羧甲基纤维素酶活(CMC酶活)及滤纸酶活的影响。研究结果表明,在优化条件下,该菌的CMC酶活、滤纸酶活在培养第3天分别达到0.53U/mL和0.15U/mL。在酶学特性研究中,菌株YN1的CMC酶的最适反应温度为70°C,最适反应pH4.0(酶促反应为30min)。用不同温度处理1h或不同pH处理2h,YN1的CMC酶在30°C?50°C或pH3.0?4.0之间仍可保持80%以上的酶活性,对热及酸表现出较高的稳定性。     

Pseudomonas sp. RT-1低温脂肪酶的纯化及酶学特性

Pseudomonas sp. RT-1是从低温环境下分离的低温脂肪酶产生菌,对该菌产生的胞外脂肪酶(PL-1)进行纯化,并对其酶学特性进行初步研究。Pseudomonas sp. RT-1的发酵上清液经60%(NH4)2SO4沉淀、12~14000截留相对分子质量(MWCO)透析袋透析、Sephadex G75分子筛和超滤浓缩后,得到了电泳纯的P-L1。SDS-PAGE电泳估算其表观相对分子质量为4.43×104。对其酶学特性研究表明:PL-1是低温碱性脂肪酶且对有机溶剂的耐受性较好。10~40℃内有较好的催化活性,最适作用温度为18℃;0~50℃该酶的稳定性较好,当温度超过50℃时则容易失活;最适作用pH为10.2,且pH在9~11时较稳定;该酶对有机溶剂的耐受性较好,10mmol/L的Ca2+、K+、Na+和Fe3+对PL1的酶活力有促进作用,其中Ca2+促进作用最大,提高了146.07%,而10mmol/L的Cu2+、Co2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+和Al3+对酶活力具有不同程度的抑制作用,其中Al3+抑制作用最强,抑制了98.55%;PL-1对C链长度小于或等于12的短链脂肪酸形成的甘油三酯具有较强的水解能力;1mmol/L的去氧胆酸盐(desoxycholate)和0.01%的Triton X100对酶活力具有提高作用,分别提高了30.74%和11.83%;0.01%的SDS和Tween-80、1mmol/L的EDTA和尿素对酶活都有抑制作用,其中EDTA的抑制作用最大,抑制了80%。     

利用海洋微生物降解有机磷农药MAP的研究

目的分离及筛选降解海水养殖区甲胺磷的降解菌,并确定最适的降解条件。方法从被有机磷污染的海水样中分离,以有机磷为唯一碳源反复驯化,分离筛选出1株高效降解甲胺磷的菌株M-1,并对其降解能力和所需条件进行测试。通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法从发酵液中分离纯化了有机磷农药降解酶。结果初步鉴定菌株M-1属于腊样芽胞杆菌。菌株M-1最适生长温度和pH分别为25℃和8．0。Zn^2＋（200mg／L）、Cd^2＋（50mg／L）与Pb^2＋（200mg／L）不影响菌株M-1对甲胺磷的降解作用,但Cu^2＋（50mg／L）、Cr^2＋（50mg／L）对菌株M-1有毒性作用。SDS-PAGE测得降解菌的有机磷农药降解酶的分子质量约为45kD。结论海洋微生物在甲胺磷污染的海水养殖区自净中起着重要作用。     

一株产纤维素酶菌株的分离、鉴定及产酶特性

【目的】筛选并鉴定一株产纤维素酶的菌株,初步探究该菌的产酶特性,为综合利用纤维素筛选菌源。【方法】在常温条件下,采用滤纸培养基对菌种富集,采用CMC-Na初筛纤维素降解菌,采用LB培养基分离纯化菌株,经形态学、生理生化特征试验、16S r RNA基因序列测定等分析筛选菌株的系统分类地位。单因素试验确定培养时间、培养温度、初始p H及Na Cl浓度对筛选菌株产酶活力的影响。【结果】从腐烂的玉米秸秆中分离出一株在常温下产纤维素酶细菌KZ-2,根据菌落形态特征、生理生化特征鉴定以及16S r RNA基因序列分析,初步鉴定KZ-2为肠杆菌(Enterobacter sp.),为潜在新种。产酶条件实验显示:该菌使用产酶发酵培养基120 h产酶量达到最大值,在25–35°C、初始p H 4.5–5.5、Na Cl浓度1.0%–2.0%范围内为最佳产酶条件,在最适条件下酶活可达80.93 U/m L。该菌株所产纤维素酶最适反应p H为7.0,最适反应温度为50°C。【结论】KZ-2是一株具有降解纤维素能力的细菌,在常温下即可分泌纤维素酶,并且该菌株为潜在新种,具有潜在的开发价值。     

一株东祁连山耐低温纤维素降解菌株的分离、鉴定及产酶特性

从东祁连山高寒草甸土壤中分离得到一株纤维素酶高产菌株【3-2。根据菌体形态观察、革兰氏染色反应及16S rDNA序列测定以及序列同源性比较,确定鉴定该菌为芽孢杆菌属的成员(Bacillus sp.)。对该菌的产纤维素酶条件研究结果表明:该菌在5℃~45℃、初始pH 4.0~9.0的环境下均能产纤维素酶。在初始pH为8.0、盐浓度为2.0%~3.0%之间、培养温度为20℃培养条件下最适产酶。在5℃时,相对酶活仍能保持60%。     

‘陇东’紫花苜蓿原生质体最佳分离条件

以‘陇东’紫花苜蓿（Medicago sativa L.cv.‘Longdong’）下胚轴愈伤组织为材料,研究酶液组合、酶解时间、酶液渗透压、愈伤组织继代培养时间及预处理措施对原生质体分离效果的影响。结果表明：获得产量最高（8.8×105个·g-1）、活力最高（88.55%）的原生质体最佳酶液组合为2%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.3%崩溃酶、酶解时间为10h、酶液渗透压即甘露醇浓度为0.55mol·L-1,愈伤继代培养天数为12d、预处理措施为4℃、黑暗条件下放置24h。     

微生物资源库中产纤维素酶菌株的筛选及其酶学性质研究

利用平板碘液染色法对中国高校工业微生物资源与信息中心(CICIM-CU)资源库中保藏的625株细菌和放线菌进行筛选,从中筛出112株具有纤维素酶产生能力的菌株,建立了一个产纤维素酶微生物资源库.对筛选得到的纤维素酶产生菌株进行16S rDNA鉴定后发现,其中的Streptomyces tanashiensis、Paen...     

极端耐热纤维素酶Cel74的表达、纯化与特性

从海栖热袍菌中克隆出编码热稳定性的纤维素酶基因,以热激载体pHsh为表达质粒,构建重组质粒phsh—Ceff4,并转化至大肠杆菌中进行表达。基因表达产物通过热处理和离子交换层析,重组酶纯度达电泳纯。对纯化的重组酶酶学性质研究表明,最适反应温度85℃,最适反应pH4．6,pH4．5—6．0之间酶的相对酶活在80％以上。Co^2＋对酶活性有促进作用,Ca^2＋、Mg^2＋、Zn^2＋不影响酶活性,而Cu^2＋、Ni^2＋、Mn^2＋对酶活性有抑制作用。     

头孢菌素C去乙酰基酶产生菌的筛选、酶学性质及产酶条件优化

以7-ACA为底物从土壤中筛选得到一株产头孢菌素C乙酰水解酶的微生物,初步鉴定为红酵母.酶学性质研究表明:静息细胞CAH的最适pH为7.0,最适反应温度为25 ℃;在温度低于40℃保存静息细胞时CAH的稳定性很好,在pH 5.5～8.0的范围内保存静息细胞时CAH比较稳定.产酶条件优化结果为:葡萄糖30g/L,国产酵母...     

生物催化法合成6-氰基-（3R，5R）-二羟基己酸叔丁酯

利用E.coli BL21／pCDFDuet-gdh—cr-X共表达全细胞催化6-氰基-（5R）-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原合成6-氰基-（3R,5R）-二羟基已酸叔丁酯。结果表明：在菌体用量4．85g/L、葡萄糖与底物质量浓度比为1：1、温度28℃、pH7．0条件下,80．0g／L6-氰基-（5R）-羟基-3-羰基己酸叔丁酯生物还原2h后,底物转化率可达99．0％,产物d.e．值大于99．5％。在考察范围内,NADP^＋用量对催化效率无显著作用。     

白蚁肠道内纤维素酶产生菌的筛选及其酶活性

从黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus Shiraki)肠道内筛选具有纤维素降解能力的细菌,并研究其酶活性。结果表明:筛选得到5株菌株,活力较高的菌株CMC-4被鉴定为土白蚁特拉布尔希氏菌Z-4(Trabulsiella odontotermitis ZJSRU-4)。同时对菌株T.odontotermitis ZJSRU-4进行了系统的研究,它具有完整的纤维素酶系统,主要产羧甲基纤维素酶(CMCase)和β-葡萄糖苷酶,滤纸酶的活力较低。在以羧甲基纤维素钠为碳源的培养基中培养36 h,发酵液中CMCase的比酶活达到20.8 U/m L,培养44 h,β-糖苷酶的比酶活达到18.2 U/m L。CMCase和β-葡萄糖苷酶作用的p H分别为6.0和6.5,它们作用的最适温度都为40℃。该菌对纤维质原料具有降解能力,具有潜在的应用价值。