一种乙肝表面抗原结合蛋白可作为疫苗佐剂

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein, SBP)是本实验室发现的一种可以与乙肝表面抗原HBsAg特异性结合的人源蛋白,该蛋白已经被证实具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用.目前,我们已经利用毕赤酵母表达系统获得了能够分泌表达SBP的毕赤酵母表达菌株.本研究通过对上述菌株的发酵产物进行超滤和亲和层析纯化,获得了一定量的高纯度重组SBP蛋白,并利用酶联免疫吸附检测(ELISA)法和表面等离子体共振(SPF)法分别对重组SBP进行了体内外生物学活性的初步检测,证实其具有与HBsAg结合的能力,并求得了二者之间的亲和常数.将重组SBP作为乙肝疫苗增效剂与乙肝疫苗共同免疫小鼠,SBP增效组小鼠与对照组相比,血清中HBsAg抗体显著升高,表明SBP在体液免疫方面对乙肝疫苗具有显著的增效作用.上述结果表明,SBP有望作为乙肝疫苗的免疫佐剂,在乙型肝炎防治方面有重要意义.     

N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的表达及免疫原性的影响

目的：研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响。方法：通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（MHBs）中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr—dN4、Adr-N4—5、Adr—N4．6、Adr—N4．7。用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗（pSW3891／MHBs／Adr,简称Adr）及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达。采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB／c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫．用ELISA法检测小鼠血清中抗．HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肽特异性分泌IFN-T的脾细胞数量。结果：蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr—N4．5、Adr—N4—6、Adr-N4—7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4—5、Adr-N4—7可将表达产物分泌到细胞外。ELISA及EISPOT结果表明：Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr—N4—5、Adr．N4—7相比无统计学差异（P〉0．05）,与Adr-dN4和Adr—N4—6组相比有显著的统计学差异（P〈0．05）。结论：在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能。HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的。     

N- 糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的 表达及免疫原性的影响

目的:研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响。方法:通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7。用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/Adr,简称Adr)及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达。采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB/c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫,用ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肽特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量。结果:蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4-5、Adr-N4-7可将表达产物分泌到细胞外。ELISA及EISPOT结果表明:Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr-N4-5、Adr-N4-7相比无统计学差异(P>0.05),与Adr-dN4和Adr-N4-6组相比有显著的统计学差异(P<0.05)。结论:在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能。HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的。     

毕赤酵母工程菌表达乙肝表面抗原结合蛋白(SBP)的发酵纯化工艺研究

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein,SBP)是以HBsAg为探针,通过人肝cDNA噬菌体表达库筛选的一种人源蛋白。SBP可特异性结合乙肝表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen, HBsAg),增强乙肝疫苗的免疫效果,是一种潜在快速高效的免疫佐剂。成功构建了分泌型高表达SBP的毕赤酵母工程菌。对该菌株进行了放大规模发酵表达,并对纯化工艺进行了研究。在发酵实时检测过程中,自诱导剂甲醇加入开始,SBP蛋白的分泌表达量随时间推移而逐渐增加,发现于38h达到最佳水平且此时杂蛋白含量最少,是放罐收集菌液的最佳时间。18L发酵液在低温离心除菌体和沉淀物后可得到15L的上清液,再利用截留量为5kDa的超滤膜包将上清液浓缩至2L,将浓缩后的上清液依次通过S200分子筛柱和TDEAE阴离子交换柱进行分离纯化,可得到300ml浓度为1.125mg/ml、纯度达98%的目标蛋白液,发酵液得率为22.5mg/L;最后将蛋白液定量分装冻干低温保存。所获得的放大规模SBP发酵诱导表达条件和SBP蛋白的分离纯化工艺,为SBP蛋白大规模生产奠定了坚实的基础。     

乙肝表面抗原结合蛋白SBP在毕赤酵母中的表达纯化及功能鉴定

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein,SBP)是本实验室发现的一种人源蛋白,该蛋白与人乙型肝炎病毒HBV表面抗原HBsAg存在特异性的结合能力。此前的研究证实SBP具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用。为进一步研究该蛋白的生理功能和作用机制,利用毕赤酵母表达系统进行了SBP的表达菌株构建,筛选得到了SBP的高效表达菌株。发酵产物经过分离纯化,最终得到了大量高纯度的真核来源的目的蛋白。通过SDS-PAGE、高效液相色谱、Western blotting和质谱鉴定,证实所得到的蛋白具有较高的纯度和完整性。通过ELISA方法初步证实了其与乙肝表面抗原具有较好的结合能力。该研究为进一步进行SBP的体内外功能研究及免疫增效研究打下了基础。     

一种新的精子结合蛋白HBRP在原核表达及其活性研究

为了发现和研究牛精浆(bovine seminal plasma,BSP)蛋白及其相关蛋白在受精及受精卵发育中的重要作用,我们克隆了人类生殖相关新基因HBRP(Human BSP—Related Proteins),本通过基因重组技术,构建了GST—HBRP融合蛋白表达质粒,在大肠杆菌中获得大量表达,并检测了该蛋白对PKC活性的影响。     

一种与核酸复合的脱落酸结合蛋白

用抗脱落酸 (Abscisicacid ,ABA)结合蛋白 (ABBP)血清作为探针筛选玉米cDNA表达文库 ,从 2 0 0 0 0 0个独立噬斑中 ,仅获得 1个编码多肽的cDNA克隆 ,它与动物的某些核酸结合蛋白基因的同源性高达 6 0 %～ 6 5 % .此外 ,获得 1 2 0个编码玉米 1 7SrRNA的cDNA克隆 .鉴于此 ,对经ABA亲和纯化所得的ABBP及其抗血清进行了复查 .发现rRNA伴随ABBP而存在 ;该抗血清除能识别ABBP外 ,还能识别rRNA ,推断某些ABBP具有与核糖核酸结合的性质 ,即能与rRNA形成复合物     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及其产物活性的初步检测

构建了pSV2DHWS2S质粒,使dhfr扩增基因及乙型肝炎病毒的Pre-S_2+S基因分别在两个SV40早期启动子的调控之下。此质粒转化到CHO-dhfr~-细胞,经克隆、加氨甲喋呤(MTX)筛选、扩增,建立了3个高效分泌HBsAg中蛋白及主蛋白的克隆细胞系。检测了其中的M6细胞系生物学特性。结果表明,免疫电镜下可观察到22nm的颗粒;该细胞用转瓶连续培养60天,每2天收、换液1次,每升HBsAg平均产量为2.9mg。经初步纯化,在SDS-PAGE中显示23k、27k主蛋白带及33k、36k中蛋白带。主蛋白及中蛋白的反相血凝(RPHA)滴度分别为64和128;中蛋白的ELISA滴度为320。部分品系小鼠免疫后能产生滴度为8的抗Pre-S_2抗体。3只家免中仅有1只在免疫后第1、2周可测出Pre-S_2抗体,而3只兔的S抗体滴度都较高,持续时间也较长。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在墨西哥酸浆中的表达及其免疫原性的初步研究

以墨西哥酸浆子叶作为外植体,与农杆菌EHA105（含质粒p130HBs)共培养3天,通过延迟筛选的方法用潮霉素加压直接诱导成芽,抗性芽经诱导生根获得转化植株。经PCR、Southern点杂交等分子检测,证实目的基因已整合到墨西哥酸浆基因组中。ELISA检测证实了在墨西哥酸浆中表达的HBsAg具有较好的活性。初步比较了目的基因在转化植株、不同器官的表达水平差异。取注射注免1次但抗体水平明显下降的Babl/c小鼠,口服饲喂加强免疫,有明显的特异性抗体回升反应。表明转基因墨西哥酸浆疫苗作为口服加强免疫具有重要的理论和实用价值。     

Expression and Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Transgenic Potato Plants

Transgenic potato plants expressing the gene of hepatitis B surface antigen (HBsAg) under the control of the double promoter of 35S RNA of cauliflower mosaic virus (CaMV 35SS) and the promoter of patatin gene of potato tubers have been obtained. Biochemical analysis of the plants was performed. The amount of HBsAg in leaves, microtubers, and tubers of transgenic potatoes growing in vitro and in vivo was 0.005-0.035% of the total soluble protein. HBsAg content reached 1 microg/g in potato tubers and was maximal in plants expressing the HBsAg gene under the control of CaMV 35SS promoter. In transgenic plants expressing HBsAg gene under the control of tuber-specific patatin promoter, HBsAg was found only in microtubers and tubers and was absent in leaves. Western blot analysis of HBsAg eluted from immunoaffinity protein A-Sepharose matrix has been performed. The molecular weight of HBsAg peptide was approximately 24 kD, which is in agreement with the size of the major protein of the envelope of hepatitis B virus. Using gel filtration, it was determined that the product of HBsAg gene expression in potato plants is converted into high-molecular-weight multimeric particles. Therefore, as well as in recombinant HBsAg-yeast cells, assembling of HBsAg monomers into immunogenic aggregates takes place in HBsAg-transgenic potato, which can be used as a source of recombinant vaccine against hepatitis B virus.     

毕赤酵母发酵生产颗粒性乙肝表面抗原的条件优化

乙型肝炎病毒的流行对人们的生命健康造成了极大的威胁, 而有效准确的诊断和预防性疫苗是阻止其流行的主要手段, 乙肝表面抗原是诊断试剂和疫苗的主要成分。本试验在构建稳定表达HBsAg的毕赤酵母菌株后, 对其发酵条件进行了研究。采用摇瓶分批培养方法, 探讨了不同培养基、溶解氧、诱导物甲醇的浓度以及pH值等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响。在10 L发酵罐上采用分批补料培养的方法研究了进行扩大培养生产重组HBsAg。结果表明, FBS无机盐合成培养基是理想的工业发酵培养基, 溶解氧对菌体的生长与表达有显著的影响, 甲醇诱导最佳终浓度为1% (V/V), 发酵的最适pH值为5.4~6.0。发酵罐放大培养后, ELISA和 SDS-PAGE分析表明重组HBsAg获得了高效表达, 最终菌体生物量达到310 OD600, 表达量达到27 mg/L。电子显微镜观察表达重组乙肝抗原可以自组装为22 nm类病毒颗粒, 为HBV的新一代早期血清学诊断和疫苗的大规模生产提供了一定的参考。     

带有PreS的重组乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达

带有ＰｒｅＳ区的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）有望成为新一代更高效的乙肝疫苗。利用毕赤属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统,表达了带有ＰｒｅＳ区免疫决定簇的理组乙肝表面抗原Ｓ１Ｓ、ＳＳ１和Ｓ２Ｓ。对表达产物的性质鉴定表明,产物可以形成２具有相应的Ｓ、ＰｒｅＳ１或ＰｒｅＳ２抗原性的颗粒,表达水平高于啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）表达系统。     

乙肝病毒PreSl片段与乙肝表面抗原羧端的融合表达

我们利用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）得到了编码乙肝病毒肝细胞受体结合位点ＰｒｅＳｌ（２１￣４７）的基因片段,并将它分别融合到Ｓ基因中相应于第１７５,１８８和２２３位氨基酸残基处。所得到的融合基因插入痘苗病毒表达载体ｐＧＪＰ－５后,在哺乳动物细胞ＣＶ－１中进行了暂时表达,对融合蛋白的表达、分泌和抗原性的研究表明,３种融合基因均能表达具有Ｓ和ＰｒｅＳｌ双重抗原性的融合蛋白,但融合位点对表达水平和分泌性质有     

HBsAg Mab胶体金探针制备与鉴定的实验研究

目的：研制合格的乙肝表面抗原单克隆抗体（HashgMab）标记的胶体金探针。方法：采用柠檬酸三钠还原法制备15nm的胶体金;所制备的胶体金通过透射电镜和紫外分光计度计鉴定其大小和均匀度。通过CVAI曲线,确定胶体金标记HBsAgMab蛋白用量;采用斑点免疫吸附试验对探针进行鉴定。结果：制备的15nm胶体金颗粒均匀;紫外分光光度计400—700nm扫描结果最大吸收波长为518nm,峰宽较窄;纯化的HBsAgMab浓度为65mg／mL;在PH为8.2时,每毫升胶体金的蛋白最适保护量为32．5μg;采用斑点免疫吸附试验鉴定探针质量合格,可保存3个月。结论：制备的HBsAgMab胶体金探针质量合格,为进一步研究提供手段。     

Structure of Hepatitis B Surface Antigen from Subviral Tubes Determined by Electron Cryomicroscopy

Hepatitis B virus consists of an icosahedral core containing the double-stranded DNA genome, enveloped by a membrane with embedded surface proteins. The crystal structure of the core protein has been solved but little information about the structure of the surface proteins has so far been available. There are three sizes of surface protein, small (S), medium (M) and large (L), which form disulfide-bonded homo- and heterodimers. The three proteins, expressed from different start sites in the coding sequence, share the common C-terminal S region; the M protein contains an additional preS2 sequence N-terminal to S, and the L protein a further preS1 sequence N-terminal to M. In infected individuals, the surface proteins are produced in huge excess over the amount needed for viral envelopment and are secreted as a heterogeneous mixture of isometric and tubular subviral particles. We have used electron cryomicroscopy to study tubular particles extracted from human serum. Helical Fourier-Bessel analysis was used to calculate a low-resolution map, although it showed that the tubes were quite disordered. From the symmetry derived from this analysis, we used single-particle methods to improve the resolution. We found that the tubes had a diameter of approximately 250 Å, with spike-like features projecting from the membrane. In the plane of the membrane the proteins appear to be close packed. We propose a model for the packing arrangement of surface protein dimers in the tubes.     

聚乙二醇伴随式离子交换层析分离重组乙肝病毒表面抗原

对由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的多聚亚基蛋白HBsAg在离子交换层析过程中容易因亚基解离而导致蛋白解聚和丧失生物活性的难题,实验中选择聚乙二醇（PEG）作为保护剂伴随式（Polyethylene Glycol-Accompanied）离子交换层析分离纯化HBsAg。实验表明,在流动相中加入1% PEG10000(W/V)作为纯化伴侣, HBsAg的回收率由55% 左右提高到80%以上,纯化倍数基本保持在12左右。对纯化产物进行SDS_PAGE分析表明,1% PEG10000的纯化伴侣伴随式离子交换层析能全部保留HBsAg的糖基化蛋白单体（27kD和30kD）,高效液相色谱联用多角度激光散射(High Performance Size Exclusion Chromatography_Multiangle Laser Light Scattering, HPSEC-MALLS )进一步分析阐明了PEG能促使HBsAg颗粒尺寸分布更均一,结构更接近天然乙肝表面抗原。     

乙肝病毒X 蛋白通过CREB 上调HBx结合蛋白促进肝癌细胞迁移

乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）对肝癌的发生发展具有十分重要的作用. HBx 具有促进肝癌迁移的作用,但其作用的分子机制不清. 本研究对 HBx 促进肝癌细胞迁移的分子机制进行了探讨. 伤口愈合和 Boyden’s chamber结果表明,HBx 可明显促进肝癌 HepG2 细胞迁移. 在稳定转染 HBx 的 HepG2（HepG2-X）细胞中转染 HBx 结合蛋白（hepatitis B X-interacting protein,HBXIP）的 RNA 干扰片段,可明显抑制 HBx 的促迁移作用. 免疫组化和实时定量 PCR 结果表明,HBXIP 在肝癌组织中显著高表达,并且与 HBx 表达成正相关. 荧光素酶报告基因和免疫印迹结果表明,HBx 显著增强 HBXIP 的启动子活性和蛋白质表达水平. 应用 HBx 的 RNA 干扰处理 HepG2-X 细胞,HBXIP 的启动子活性和蛋白质表达水平明显下降.将 HBXIP 启动子区的cAMP效应元件结合因子（CREB）结合位点突变后,HBx 上调 HBXIP 的作用消失. 应用 CREB 的 RNA 干扰处理肝癌细胞,在启动子水平和蛋白质水平上, HBx 对 HBXIP 的上调作用被显著抑制. 染色质免疫共沉淀结果表明,HBx 能够通过 CREB 结合到 HBXIP 的启动子上,进而发挥激活 HBXIP 的功能. 本研究结果表明,HBx 促进肝癌细胞迁移的作用是通过 CREB 上调 HBXIP 实现的. 这一发现对进一步揭示 HBx 促进肝癌细胞迁移的分子机制具有重要意义.     

Platycodin D2 Improves Specific Cellular and Humoral Responses to Hepatitis B Surface Antigen in Mice

Platycodin D2 ( 1 ), a less hemolytic saponin from the root of Platycodon grandiflorum than platycodin D ( 2 ), was evaluated for the potential to enhance specific cellular and humoral immune responses to hepatitis B surface antigen (HBsAg) in mice. It significantly increased the concanavalin A (Con A)‐, lipopolysaccharide (LPS)‐, and HBsAg‐induced splenocyte proliferation in HBsAg‐immunized mice (P<0.05, P<0.01, and P<0.001, resp.). HBsAg‐specific IgG, IgG1, IgG2a, and IgG2b antibody titers in the serum were also markedly enhanced by 1 compared to the HBsAg control group (P<0.01 or P<0.001). Moreover, 1 significantly promoted the production of Th1 (IL‐2 and IFN‐γ) and Th2 (IL‐4 and IL‐10) cytokines from splenocytes in the HBsAg‐immunized mice (P<0.001). The adjuvant potential of 1 on splenocyte proliferation, serum HBsAg‐specific IgG2a and IgG2b antibody response, as well as Th1‐cytokine secretion from splenocytes in the HBsAg‐immunized mice was higher than that of Alum. The results suggest that 1 could improve both cellular and humoral immune responses to HBsAg in mice. Hence, 1 might be a promising adjuvant for hepatitis B vaccine with dual Th1‐ and Th2‐potentiating activity.     

PDGF受体结合域与乙肝病毒核心抗原的融合表达

化学合成血小板源性生长因子受体结合域１３肽基因,并与乙肝病毒核心抗原基因５′端融合,序列分析表明化学合成的１３肽基因及融合后基因的阅读框架正确．将融合基因亚克隆于ｔａｃ启动子控制的ｐＥＴ３ａ表达质粒中并于大肠杆菌中表达．表达产物经ＥＬＩＳＡ、ＷｅｓｔｒｅｎＢｌｏｔ鉴定表明,融合蛋白已被表达,其单位分子量与推算值一致．电镜观察证明所表达的融合蛋白能形成颗粒．