乙肝表面抗原基因在酵母GAP启动下的高表达

乙型肝炎危及中国及世界各地人们的健康,它是由乙型肝炎病毒所引起的。几年来临床证明乙肝表面抗原蛋白(HBsAg)疫苗能有效预防此病传染。基因工程疫苗已迅速发展,HRsAg基因在酵母细胞、哺乳动物细胞及重组牛痘病毒中的表达都已获得一定成功。我实验室继乙肝病毒DNA克隆鉴定以来,也在上述各细胞系统获得     

隐匿性乙肝病毒表面抗原Y100C位点替换的表达及其作用研究

目的:探讨隐匿性乙肝病毒表面抗原Y100C位点突变与乙肝病毒隐匿性感染的相关性.方法:分别构建含有隐匿性乙肝病毒表面抗原Y100C位点替换基因和野生型表面抗原基因的表达载体,转染HeLa细胞,培养一定时间后用ELISA方法检测细胞中HBsAg的表达情况,并进行统计学分析.结果:含有点突变基因的重组载体转染的细胞培养上清和提取物中HBsAg的表达量均低于含有野生型基因表达载体转染的细胞,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:HBsAg蛋白Y100C位点替换降低了HBsAg的合成及分泌,可能参与隐匿性异性肝炎的发生和发展,下一步的研究可结合HBV全基因的研究,以期更好的阐明隐匿性乙型肝炎的机制.     

一种新的乙型肝炎病毒表面抗原结合蛋白的筛选、表达及其生物学活性的初步研究

为了研究乙肝病毒侵染肝细胞过程中的功能蛋白 ,通过印迹免疫分析技术从人肝cDNA噬菌体表达库中筛选出一株编码乙肝表面抗原结合蛋白 (hepatitisBsurfaceantigenbindingprotein ,HBsAg BP)的cDNA克隆 .基因测序结果表明 ,该cDNA具有独立的开放阅读框架 ,编码 1个由 344个氨基酸残基构成的可溶性蛋白分子 ,属于免疫球蛋白超家族成员 .将该基因克隆到原核表达载体pTriplEx后 ,在E .coliXL1 Blue菌株中获得 4 4kD的重组蛋白 .重组蛋白经Western印迹和ELISA实验证明具有与乙肝表面抗原特异性结合的能力 .进一步经流式细胞仪实验显示 ,在纯化的重组蛋白存在的情况下 ,天然的HBsAg与肝细胞株HepG2的亲和力显著增高 .结果显示 ,该乙肝表面抗原结合蛋白可能是介导乙肝病毒对肝细胞亲和侵染的可溶性辅助受体 .     

新生儿国产重组(酵母)乙型肝炎疫苗免疫效果考核

为了考核新生儿接种国产重组(酵母)乙型肝炎(乙肝)疫苗后的免疫效果,并与血源乙肝疫苗效果比较。对1997年出生并接种重组(酵母)乙肝疫苗的新生儿隔年随访一次,采血检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg),乙肝病毒表面抗体(抗-HBs)和乙肝病毒核心抗体(抗-HBc),1998年以后对乙肝免疫人群开展急性乙肝发病监测。显示五年期间3次随访检测HBsAg阳性率平均为1.5%,较免前本底的HBsAg阳性率呈较大幅度下降,疫苗保护率为83%(95%可信区间为76.97%~89.02%),无论母亲HBsAg阳性或阴性,使用不同乙肝疫苗的儿童HBsAg阳性率没有统计学差异。接受重组(酵母)乙肝疫苗免疫的对象中,无一例急性乙肝病例报告。重组(酵母)乙肝疫苗有较好的近期保护效果和免疫原性,与以前使用血源乙肝疫苗效果相当。     

用“NOE”制剂消除小鸭的鸭乙肝病毒携带状态的研究

本文报告了用鸭乙肝动物模型筛选四种药剂,结果证明“NOE”制剂能部分的(5/10)消除小鸭携带的鸭乙肝病毒。初步证明在用药后二周,可使50％(5/10)小鸭携带的鸭乙肝病毒表面抗原(DHBsAg)阴转。     

乙肝疫苗的大量生产

<正>前言 用人血浆分离的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)作疫苗,目前分别在法国和美国以双盲法进行抗乙肝病毒感染的自动免疫临床试验。 这些结果与Maupas早期研究的以福尔马朴处理的高纯化HBsAg疫苗的功效相符合。现在对这类疫苗大量需求,我们在这里报道了按照法国国家卫生实验室制定的要     

表达乙肝病毒融合表面抗原基因SA-28的二倍体酵母工程菌的选育

将乙肝病毒融合表面抗原基因SA-28的单倍体酵母工程菌Y19/YFD158和与其不同接合型的单倍体酵母菌Y95接合,筛选到二倍体酵母工程菌Y95xY19/YFD158。对两种工程菌的研究表明：二倍体工程菌发酵密度为单倍体工程菌的3倍;表达质粒在二倍体酵母中的稳定性明显高于单倍体工程菌;二倍体工程菌对融合抗原的表达量为单倍体的3倍以上;表达质粒在二倍体细胞中的平均拷贝数略低于单倍体工程菌。     

带preS1的乙肝表面抗原融合蛋白的亲和纯化

乙肝表面抗原大分子蛋白ＬＨＢｓ的ｐｒｅＳ１区域２１～４７位肽段为肝细胞受体的结合位点;由ｐｒｅＳ１诱发的抗体有可能阻断病毒对肝细胞的侵蚀。因此,含有ｐｒｅＳ１的新型乙肝疫苗可能会引起机体更广泛、可靠的保护作用。但基因工程表达产物用于生产的一个关键问题是产品的纯化。用抗ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１单抗制成了亲和凝胶载体,并用它纯化了基因工程表达的带ｐｒｅＳ１的乙肝表面抗原融合蛋白．此法有操作简便;纯化效果好,回收率高等优点．一步层析产品纯度可达９０％以上,回收率在５０％左右,具有很好的应用前景。     

鱼山镇1岁以上人群不同年龄组乙肝表面抗原携带率与乙肝疫苗接种关系的调查

研究鱼山镇乙肝疫苗接种率不同人群的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带率的差异。将该镇所有户籍登记在册人员按出生日期分成3组,再按随机抽样法对每个年龄组抽取一定数量的人组成样本,调查乙肝疫苗接种史;对每位参加者采集静脉血5ml,无菌分离血清,使用固相放射免疫试剂和酶联免疫试剂检测乙肝病毒表面抗原和抗乙肝病毒表面抗原抗体(HBsAb,抗-HBs)。小年龄组、中年龄组、大年龄组乙肝疫苗接种率依次为80.00%、50.46%、25.36%,差异具有统计学意义(χ2=262.24,P<0.005);小年龄组、中年龄组、大年龄组HBsAg携带率依次为2.07%、11.93%、17.87%,差异具有统计学意义(χ2=77.48,P<0.005);小年龄组、中年龄组、大年龄组HBsAb依次为43.38%、24.77%、10.95%,差异具有统计学意义(χ2=107.28,P<0.005)。乙肝疫苗接种率在小年龄组、中年龄组、大年龄组依次降低,HBsAg携带率依次增高,HBsAb阳性率依次降低。因此,接种乙肝疫苗对人群有较好的保护作用,人群乙肝疫苗接种率越高,HBsAb阳性率越高,HBsAg携带率越低。     

pH和溶解氧浓度对重组酵母表达乙型肝炎表面抗原的影响

观察酵母基因工程菌生产目的基因表达产物——乙型肝炎表面抗原的发酵,细胞生长和乙型肝炎表面抗原表达是两个相互影响的过程,因此,存在着pH的调节序列。溶解氧浓度的控制对重组质粒稳定性以及目的基因的高表达具有较大影响,实验获得控制溶解氧浓度为70％饱和度的条件,可使重担质粒保持73％以上的稳定性,并且．乙型肝炎表面抗原达到98．6的相对浓度。     

4例乙肝表面抗原阴性乙肝病毒DNA阳性标本结果分析

目的 探讨4例乙肝病毒HBV-DNA阳性标本乙肝表面抗原(HbsAg)阴性的原因.方法 4例HbsAg阴性HBV-DNA阳性标本和1例HbsAg阳性HBV-DNA阳性标本,碱裂解法提取乙肝病毒基因组,采用巢式PCR扩增s基因全长片段,T-A克隆后测序,根据s基因序列推导氨基酸序列,分析乙肝表面抗原α决定簇区域的氨基酸变异情况.结果 与参考株比较,5例血清中HBV-DNAs基因均出现不同位点碱基突变,导致乙肝表面抗原α决定簇区域的氨基酸突变主要为:1号标本R122K、I126A、S143T;2号标本R122K、I126N、Q129N;3号标本R122K、I126S、T131N、M133T;4号标本R122K、I126S、T131N、M133T及5号标本的R122K.结论 乙肝表面抗原α决定簇区域126位氨基酸突变可能会影响HbsAg的检测结果.     

抗乙型肝炎表面抗原不同亚型单克隆抗体细胞腺的建立和鉴定

乙型肝炎病毒表面抗原主的的５个不同亚型,是乙肝病毒不同遗传变种表面的表达,通过四次细胞融合获得了抗－ａ、抗－ｄ抗－ｙ、抗－ｗ亚型的单克隆抗体,并作了鉴定及初步应用,为进一步对乙肝亚型分型试剂的研制打下了良好的基础。     

抗乙型肝炎表面抗原不同亚型单克隆抗体细胞株的建立和鉴定

乙型肝炎病毒表面抗原主要的５个不同亚型,是乙肝病毒不同遗传型变种表型的表达,通过四次细胞融合获得了抗－ａ、抗－ｄ、抗－ｙ、抗－ｗ亚型的单克隆抗体,并作了鉴定及初步应用,为进一步对乙肝亚型分型试剂的研制打下了良好的基础     

乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2 S基因在PichiaPastor妇酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2 S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞：KM71,G418筛选多拷贝整合克隆。经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS—PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高, 表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYME MONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg／100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2 S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。     

乙肝病毒表面抗原Pre-S1的N端片段溶液构象研究

利用二维核磁方法对乙肝病毒表面抗原Pre S1N端 2 0～ 47肽段进行溶液构象研究 ,并用距离几何方法搭建分子结构 ,最后用分子动力学模拟方法对结构进行优化 .分析结果发现该肽段存在 4个 β turn ,位置与免疫学定义的抗原抗体结合位点相符 .     

基因工程乙肝病毒表面抗原纯化工艺研究

基因工程乙肝病毒表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）是由重组哺乳动物细胞ＣＨＯ系分泌表达的,经过纯化制备基因工程乙肝疫苗。目前在国际上,对从ＣＨＯ细胞培养液中分泌的ｒＨＢｓＡｇ,纯化工艺主要采用多步柱层析和超滤技术,而在国内,ＣＨＯ系ｒＨＢｓＡｇ的大规模生...     

DNA疫苗预敏蛋白疫苗增强策略对乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫应答的影响

目的:观察核酸疫苗预敏,乙型肝炎病毒HBsAg蛋白疫苗增强的免疫对Balb/c小鼠免疫应答的影响.方法:以TransfectionTM脂质体将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗pSW3891/MHBs/adr(简称为adr),及空载体pSW3891(简称vector)体外转染293T细胞.免疫印迹法(Western blot)检测adr,vector的体外表达;动物体内研究选用Balb/c小鼠共18只,每组6只,编号后随机分为3组,即空载体质粒组(vector+vector组)、adr核酸疫苗+HBsAg蛋白疫苗(adr+protein组)、HBsAg蛋白疫苗+HBsAg蛋白疫苗(Protein+Protein组);于第0周肌肉注射法分别以vector、adr及HBsAg蛋白疫苗免疫小鼠,于第4周肌内注射法分剐以vector、HBsAg蛋白疫苗、及HBsAg蛋白疫苗免疫小鼠.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清HBsAg特异性抗体、酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测小鼠脾细胞HBsAg多肽特异性IFN-γ分泌细胞.结果:adr体外转染293T细胞后,能够表达乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs);体内研究结果显示:除vector+vector组外,adr+protein组、Protein+Protein组小鼠均能检出血清抗-HBs,Protein+Protein组抗-HBs终点滴度比adr+protein组高,但无统计学意义;三组中vector+vector组没有检测到特异性INF-γ分泌的脾细胞,而adr+protein组、Protein+Protein组小鼠均能检出,且adr+protein组特异性细胞数量显著高于protein+protein组(P＜0.001),具有统计学意义.结论:乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗预敏.能明显增强Balb/c小鼠对乙型肝炎HBsAg蛋白疫苗细胞免疫应答水平.     

利用免疫蛋白质组学方法筛选高效的疫苗

由福建省医学分子病毒学研究中心研发的我国第一种拥有核心自主知识产权的基因工程疫苗——重组戊型肝炎疫苗,正式获准进入Ⅰ／Ⅱ期临床试验。该疫苗也有望成为世界上继乙肝疫苗之后第二个基因工程病毒疫苗,为病毒性肝炎的防治揭开了崭新的一页,对于我国生物制药产业具有里程碑式的意义。     

乙型肝炎疫苗接种与康泰疫苗事件引发的思考

<正>乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(乙肝病毒)引起的严重危害人民健康的传染病,主要通过血液、医源、性生活和母婴等途径传播,是急慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因.成人感染乙肝病毒多数都可以痊愈,但婴幼儿感染则多数成为慢性持续性感染者.1979年全国乙肝流行病调查人群中乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)平均携带率为9.76%,儿童4岁时HBsAg携带率就已达或接近高     

应用杆状病毒载体在昆虫细胞系统中表达乙型肝炎病毒表面抗原基因

构建了同时带有乙型肝炎病毒表面抗原基因和大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体质粒pVL941lacHBS。应用磷酸钙沉淀技术将pVL941lacHBS DNA转入事先用AcNPV感染过的Sf9细胞,在显色剂X-gal存在下,筛选无多角体的蓝色蚀斑。经过若干次蚀斑纯化,最后获得含乙肝病毒表面抗原基因和β-半乳糖苷酶基因的重组杆状病毒R-AcV941LS。 用R-AcV941LS感染Sf9细胞,在感染后72～96小时,用RPHA和RIA分别检测组织培养上清液和细胞裂解液中的乙型肝炎病毒表面抗原含量。结果,组织培养上清液为3.83μg/1×10~6～2×10~6细胞;细胞裂解液为4.39μg/1×10~6～2×10~6细胞。乙型肝炎病毒表面抗原的合成总量为8.22μg/1×10~6～2×10~6细胞。免疫电镜观察显示表达产物呈约22nm的球形颗粒。小鼠免疫接种实验结果表明,以R-AcV941LS感染Sf9细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原与在哺乳动物细胞系表达的乙型肝炎病毒表面抗原具有相近似的免疫原性。