羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、表达产物纯化及生物活性

 Neurturin (NTN)是新近发现的一种神经营养因子 ,是 GDNF家族的成员之一 .将 5′端引入了羟胺切割位点的 h NTN基因克隆到硫氧还蛋白融合表达载体 p Thio His A,在宿主菌 BL2 1中获得了稳定、高效表达 ,表达产物以包涵体形式存在 .在变性条件下经羟胺切割、柱层析纯化后复性 ,获得纯度达 90 %以上的 rh NTN.经鸡胚背根神经节 (DRG)培养法测定具有生物学活性 .     

小肽多拷贝基因表达载体的构建及其高效表达(英文)

介绍一种快速、高效构建小肽多拷贝基因表达载体的策略 ,并构建了相应的表达载体pETE coT .用人工合成的编码 2 8个氨基酸残基的胸腺素α1基因为模型 ,采用限制酶EcoT14I识别序列CCAAGG为小肽基因两末端序列 ,利用其酶切后可产生非镜相对称粘性末端 ,一次连接反应就构建出一系列不同基因拷贝数的表达载体 ;在小肽基因两端分别引进编码FactorXa和羟胺蛋白切割位点的序列 ,表达出的融合蛋白可被FactorXa和羟胺剪切出不残留任何外源氨基酸的小肽 .不同拷贝数的小肽融合蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中均获得高效表达 .     

人甲状旁腺素(1-34)衍生物在大肠杆菌中表达、纯化及其生物学活性

为研究Gly hPTH(1 34)衍生物的生物学活性 ,用重叠PCR方法合成编码hPTH(1 34)的DNA片段 ,克隆到融合表达载体pGEX 2T的缩短型谷胱甘肽转移酶基因GST6 9△的 3′末端 ,构建正确读码框架的融合基因 .在两个基因间引入蛋白质羟胺切割位点序列 ,转入E .coliJM10 9中 ,IPTG诱导表达 .该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 2 0 %以上 ,主要以包涵体形式存在 ,盐酸羟胺切割表达产物 .分析表明 ,80 %左右的融合蛋白被裂解为GST6 9△和Gly hPTH(1 34) .经分子筛柱层析和反相层析分离纯化获得重组Gly hPTH(1 34)衍生物 ,纯度达 98%以上 ,回收率约为 10mg/升发酵液 ,分子量为 4 177,等电点 (pI)为 8 4 0 ,N端 16个氨基酸 ,除第一个为甘氨酸外 ,其余与天然hPTH(1 34)序列一致 .Western印迹结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物具有hPTH(1 34)的免疫学活性 .体外活性测定结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物能刺激人成骨细胞HOSTE85增殖、增加细胞内胶原合成、ALP活性增高和cAMP生成量增加 ,并呈量效关系 ,提示它具有与化学合成的hPTH(1 34)相同的生物学活性 ,N端多一个Gly对其活性无明显影响 .     

高效可溶性重组蛋白表达载体的构建

本研究构建了两种高效表达可溶性重组蛋白的原核表达载体。一种载体由HisSUMO序列与pET30a(+)载体连接而成(命名为HisSUMO Express),表达的融合蛋白用Ni-NTA纯化,用SUMO蛋白酶I切割后可获得不留任何残基的重组蛋白。SUMO-蛋白酶I价格较贵,为减少表达蛋白的成本,第二种载体即在His-SUMO和目的序列之间加入羟胺切割位点(命名为HisSUMO Economic)。在HisSUMO Economic中表达的融合蛋白用Ni-NTA纯化,羟胺液切割后可获得仅留一个甘氨酸残基的重组蛋白。以在常规表达载体中难以表达的鼠源成纤维细胞生长因子-21(mFGF-21)为例,经葡萄糖消耗实验检测其活性,验证两种表达载体的效果。结果表明mFGF-21在两种载体中均获得了高效表达,融合蛋白占菌体总蛋白的40%以上,Ni-NTA纯化后的融合蛋白分别利用羟胺切割液和SUMO蛋白酶I切割,纯化的mFGF-21成熟蛋白回收量约为54mg/L,回收率约为6%。经两种载体表达后的mFGF-21蛋白均具有生物学活性,可促进脂肪细胞消耗葡萄糖,为进一步研究提供了基础。     

人白细胞介素11 cDNA的克隆、融合表达及活性测定

取人胎肺做原代培养细胞,PMA诱导后,利用RT-PCR技术,扩增出了去掉N端信号肽序列的IL-11cDNA;经序列分析表明,该序列与文献报道序列高度同源,仅3个核苷酸有变化,氨基酸序列完全一致。将此IL\|11cDNA克隆入硫氧还蛋白基因融合表达载体pTRXFUS的trxA基因3′末端,利用其3′端的蛋白肠激酶切点,构建符合读码框的融合基因。该融合蛋白在大肠杆菌中表达量达20%以上。用IL-6依赖细胞株7TD1及MTT法测定生物学活性,达2.56×105 u/mL菌液,对融合蛋白进行了Western blot测定,并对表达条件作了初步研究。     

重组人神经生长因子β亚基的原核优势表达及纯化

目的:在原核系统内表达SUMO融合重组人神经生长因子β亚基(h NGF-β),并对其纯化。方法:将5'端引入了羟胺切割位点的h NGF-β基因克隆到表达载体p ET-SUMO中,IPTG诱导表达后,对表达的融合蛋白SUMO-h NGF-β包涵体进行亲和纯化,然后在变性条件下加入羟胺进行裂解,利用SUMO分子伴侣的功能与h NGF-β进行共复性,最后利用阳离子交换层析纯化获得重组h NGF-β。结果:融合蛋白SUMO-h NGF-β相对分子质量为39×103,表达量占细菌总蛋白的35%;在变性条件下经羟胺切割、共复性和阳离子纯化后,相对分子质量为14×103的重组h NGF-β复性率和纯度分别为30%和80%以上,Western印迹显示其具有良好的抗原特性。结论:h NGF-β与SUMO融合可以在原核表达系统中实现优势表达。     

坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因的原核表达与鉴定

通过PCR的方法从重组质粒pMD-apcAB中扩增坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因(apcA),并将其克隆到高效表达外源基因的原核表达质粒pTO-T7。将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot和质谱鉴定。结果显示:apcA全长486bp,表达的α亚基(apcA)为带有原核表达载体T7g10的12个起始氨基酸的融合蛋白,其分子量约为19.7KD。0.5mmol/L的IPTG在37℃诱导6h时,apcA的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上。Western-blot和质谱鉴定的结果表明获得的融合蛋白为重组坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基。       

重组C8orf32蛋白的表达、纯化及抗体制备

C8orf32是一种功能未知基因,其mRNA含量在乳腺癌组织中显著高于正常乳腺组织。将其开放式阅读框插入pGEX-6P1原核表达载体T7启动子控制下的GST编码基因下游,构建了C8orf32蛋白表达质粒pGEX-6P-C8。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达了GST- C8orf32融合蛋白。经带有GST标签的位点特异性蛋白酶切割除去GST-C8orf32融合蛋白的GST标签,获得了N端带有8个多余氨基酸残基的C8orf32蛋白,蛋白纯度为95%左右。N端氨基酸序列分析表明该蛋白N端氨基酸序列正确,质谱鉴定进一步证明所表达C8orf32蛋白的正确性。用制备的C8orf32蛋白免疫新西兰白兔,获得了能够正确识别C8orf32蛋白的抗血清。该蛋白及其抗体的成功制备,为进一步研究C8orf32蛋白的结构功能和体内分布打下了基础。     

高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO

目的:构建含有IL-1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验 证pHisSUMO表达载体的高效可溶性表达.方法:以质粒pMD18-T-IL-1为模板,利用PCR获得I L-1基因克隆并将其与表达载体pET、pTYB、pHisSUMO连接,重组质粒经鉴定后转化到大肠杆 菌DH5α中,并检测其蛋白表达情况.结果:仅在pHisSUMO表达系统获得了IL-1融合蛋白的 高效可溶性表达.利用Ni-NTA纯化后的融合蛋白经SUMO蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟 蛋白且不残留任何氨基酸残基.结论:实验证明pHisSUMO表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量.     

PSCA-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

旨在大肠杆菌中表达PSCA-HSPT0融合蛋白,并对其进行纯化.克隆人PSCA基因及HSP70基因,构建表达PSCA-HSP融合蛋白的工程菌,优化表达及纯化条件,对重组蛋白进行纯化.结果表明,成功构建重组表达质粒PSCA-HSP,重组蛋白得到可溶性表达,优化纯化条件后获得90%以上纯度的重组蛋白.本研究成功实现了PSCA与HSP的融合表达,为下一步肿瘤疫苗的研制奠定基础.     

毕赤酵母表达重组人白细胞介素11的纯化与鉴定

报道了毕赤酵母表达人白细胞介素11的下游工艺研究,并对其产物进行了分析鉴定。所用工艺流程为离心收集上清、超滤浓缩脱盐、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤。所得产物经SDSPAGE电泳、RPHPLC分析、N端和C端序列分析、质谱、等电点分析和生物学活性分析,结果表明：产品纯度大于97%,结构和性质与E.coli融合表达的Neumega完全一致。     

人白细胞介素11 cDNA的克隆、融合表达及活性测定

取人胎肺做原代培养细胞,ＰＭＡ诱导后,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,扩增出去了Ｎ端信号肽序列的ＩＬ１１ｃＤＮＡ,经序列分析表明,该序列与文献报道序列高度同源,仅３个核苷酸有变化,氨基酸序列一致。将此ＩＬ－１１ｃＤＮＡ克隆人硫氧还蛋白基因融合表达载体ｐＴＲＸＦＵＳ的ｔｒｘＡ基因３‘末端,利用其３’端的蛋白肠激酶切点。构建符合读码框的融合基因。该融合蛋白在大肠杆菌中表达量法２０％以上。用ＩＬ－６依赖细胞株７Ｔ     

人白细胞介素11的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

从人胚肺二倍体细胞ＫＭＢ１７抽提总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增到人ＩＬ－１１ｃＤＮＡ,克隆于ｐＢＳ－ＳＫ,以双脱氧链终止法进行序列分析;扩增去除Ｎ 端第一个氨基酸的ＩＬ－１１ｃＤＮＡ,克隆于硫氧还蛋白融合表达载体ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ,经过对表达质粒的改造,使融合表达的ＩＬ－１１能被肠激酶精确切割;表达产物经金属鏊合亲合层析后经肠激酶切,再通过阳离子交换层析纯化后,用其依赖细胞株７ＴＤ１检测活性．结果表明,克隆的ＩＬ－１１ｃＤＮＡ 序列与文献报道一致;表达的融合蛋白占菌体总蛋白的３０％ 左右,以可溶性形式存在;纯化产物具有维持依赖细胞株生长的能力．由此,获得了较高纯度的具有生物学活性的ｒｈＩＬ－１１,为中试生产奠定了基础．     

Purification and Characterization of Recombinant Truncated Human Interleukin-11 Expressed as Fusion Protein in <Emphasis Type="Italic">Escherichia coli</Emphasis>

Mature human interleukin-11 (HuIL-11) is a cytokine consisting of 178 amino acid residues that results from scission of the N-terminal signal peptide, consisting of 21 amino acid residaues, from the corresponding nascent polypeptide. A DNA fragment encoding a truncated HuIL-11 (trHuIL-11), with an additional 5 amino acid residues removed from the N-terminus, was cloned into vector pGEX-2T between the BamHI site and the EcoRI site. Upon transformation with Escherichia coli BL21, the construct over-produced a glutathione S-transferase (GST)-fused protein in a soluble form after IPTG induction. The fusion protein was initially fractionated with butyl-Sepharose 4 fast flow column and by affinity chromatography using a GSH-Sepharose 4B column. On-site enzymatic release with thrombin gave the target protein at 96% purity as judged by SDS-PAGE and HPLC. Expression of the interleukin as a GST-fused protein thus greatly improved downstream processing. Subsequent biological activity assay suggested that trHuIL-11 had similar activity profile to the naturally produced sample and may be a promising candidate for further development as biopharmaceutical.     

人白细胞介素11的定点聚乙二醇修饰

利用人白细胞介素11（hIL-11）无半胱氨酸（Cys）残基这一特点,通过定点突变将一个Cys残基引入hIL-11的N末端。然后,利用与Cys 巯基特异性反应的mPEG-马来酰亚胺将mPEG偶联到预先选定的位点,经层析纯化得到hIL-11的定点PEG修饰物。利用依赖型细胞株7TD1测定其生物学活性,结果表明,其体外生物学活性保持原有hIL-11活性的30%左右。定点聚乙二醇修饰方法为定向改造hIL-11,提高其药效的应用研究打下基础。     

Effects of recombinant human interleukin 11 on thrombocytopenia and neutropenia in irradiated rhesus monkeys

The effects of recombinant human interleukin 11 (rhIL11) on thrombocytopenia and neutropenia in irradiated rhesus monkeys were evaluated after administration different doses at different times. Twenty-three rhesus monkeys were exposed to a total-body irradiation (TBI) with a single dose of 3 Gy 60Co gamma rays. Either placebo, rhIL11 at a dose of 30, 60 or 120 microg/kg day(-1) on days 0-13, or rhIL11 at a dose of 60 microg/kg day(-1) on days 13-26 after TBI was administered to the animals. The results showed that the immediate treatment with rhIL11 but not treatment on days 13-26 resulted in much higher platelet nadirs than in the placebo-treated group. The accelerated recovery of platelets to normal levels after TBI was demonstrated in all groups treated with rhIL11, but the effects of rhIL11 were independent of dose. However, rhIL11 treatment could also accelerate the recovery of leukocytes to normal levels. The numbers of colony-forming bone marrow cells (CFU-E, CFU-Mix, CFU-MK and CFU-GM) in all groups treated with rhIL11 were increased 4- to 14-fold relative to those of the placebo group on day 30. We conclude that rhIL11 may directly promote megakaryocyte development and ameliorate myelosuppression in irradiated monkeys.     

平颏海蛇碱性磷脂酶A_2的融合表达、纯化及活性特征

 将编码平颏海蛇碱性磷脂酶A2 的基因 (PLA2 9)克隆于硫氧还蛋白基因融合表达载体pPETTRX的trxA基因的 3′末端 ,构建符合读码框的融合基因 .2 5℃下经IPTG诱导 ,该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达 ,表达量达 2 0 %以上 .利用金属螯合亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化 ,得到纯度 85%的融合蛋白 .经肠激酶切割和离子交换柱层析进一步纯化后 ,得到浓度 95%以上的成熟PLA2 9.对重组PLA2 9进行了Western印迹检测 .重组PLA2 9具有与天然PLA2 相近的酶活性 ;并具有对HL60等几种肿瘤细胞的细胞毒作用 ,这在海蛇PLA2 中是首次报道 .平颏海蛇碱性PLA2 融合表达及快速纯化系统的建立 ,为深入开展其结构与功能关系研究奠定了基础     

SAPGTP和PG为接头的5'IL6-TNFα衍生物融合蛋白

通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白中对 Ｉ Ｌ ６ 和 Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构的影响情况,从中选择了 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ接头．以 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ 作为接头的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和以 Ｐ Ｇ 为接头的５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构预测结果相似． Ｄ Ｎ Ａ 序列分析两种蛋白的接头序列均与设计的一致．５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ蛋白的大肠杆菌表达产物经初步分离、纯化及鉴定后,生物学活性及对高表达 Ｉ Ｌ ６ 受体肿瘤细胞的杀伤作用比较结果显示：在 Ｌ９２９细胞上,前者的生物学活性是后者的 ２７ 倍;在 Ｕ９３７ 细胞上,前者对肿瘤细胞的抑制率是后者的１３ 倍．它们对高表达 Ｉ Ｌ ６ 受体的 Ｕ９３７ 细胞杀伤作用分别是同样突变位点的人 Ｔ Ｎ Ｆα衍生物的３７ 和 ２９ 倍．实验表明, Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白优于以 Ｐ Ｇ 作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白．