识别序列为非回纹对称结构限制核酸酶的正确切割位点

限制性内切核酸酶的切割识别序列分为回纹对称和非回纹对称结构两类,由于DNA是互补双链,所以对于识别序列为回纹对称结构的限制酶,其识别序列在DNA的两条链上是一致的,可以写为一个,但对于识别序列为非回纹对称结构的限制酶来说,其识别序列应为两个,而一些工具书、参考书中仅写为一个。本通过一个酶切实验证明其识别序列为两个。同时希望通过本,敦促一些工具书、参考书更正其错误。     

识别序列为非回纹对称结构限制核酸酶的正确切割位点

限制性内切核酸酶的切割识别序列分为回纹对称和非回纹对称结构两类,由于DNA是互补双链, 所以对于识别序列为回纹对称结构的限制酶,其识别序列在DNA的两条链上是一致的, 可以写为一个, 但对于识别序列为非回纹对称结构的限制酶来说,其识别序列应为两个,而一些工具书、参考书中仅写为一个。本文通过一个酶切实验证明其识别序列为两个。同时希望通过本文,敦促一些工具书、参考书更正其错误。 Abstract:The recognizing sequence of restriction enzyme includes palindrome and nonpalindromic,and DNA is double helix complementary strands.So the recognizing sequences of palindrome enzyme in two strands of DNA were identical,and can be considered of one sequence.But for nonpalindromic restriction enzyme,the recognizing sequences of two strands of DNA were not identical.Therefore the true recognizing sequences are not only one.In this experiment,an enzyme cleavage reaction was carried out which confirmed that the true recognizing sites/sequences of nonpalindromic enzyme are two instead of one.     

病毒ki-ras表达质粒的构建

用重组DNA技术构建了病毒ki-ras表达质粒,用Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ酶解pUC-9DNA,小牛肠碱性磷酸酶脱磷酸,病毒ki-ras编码基因来源于Hi-Hi-3质粒DNA的Sat Ⅱ和Eco R Ⅰ酶切的0.6kb片段,用连接酶和DNA聚合酶Klenow片段将两个片段连接,转化大肠杆菌JM103,免疫筛选表达质粒,从156个转化克隆中得到两株表达质粒,其中一株pKras83的p21蛋白表达量为细菌总蛋白量的10％。     

利用CpG DNA甲基化酶M.SssⅠ共表达载体制备限制性内切酶NotⅠ

限制性核酸内切酶是DNA重组的重要分子生物学工具。由于其本身对DNA有切割作用导致其重组表达在技术上十分困难,产率低、提纯程序复杂。而商业化生产所采用的利用专一型甲基化酶保护宿主DNA的限制酶表达技术流程繁琐、实用性有限。为表达NotⅠ限制酶,采用来源于Spiroplasma sp.MQ1的DNA甲基化酶M.SssⅠ特异性甲基化CpG序列,甲基化后的DNA会免受识别位点中包含CpG序列的限制酶NotⅠ的切割。将甲基化酶M.SssⅠ导入大肠杆菌表达宿主ER2566后,M.SssⅠ基因在宿主中持续表达并甲基化宿主DNA成CpG甲基化样式;利用此表达体系制备限制性内切酶NotⅠ获得成功。并借助引入纯化标签经过简便的Ni亲和层析和阴离子交换层析2步层析洗脱纯化,制备了高活力高纯度的重组限制酶NotⅠ。此表达体系可应用于一系列识别位点中包含CpG序列的限制酶的表达。     

用衔接头PCR克隆新的胡萝卜Ⅱ型转化酶基因启动子

 为克隆新的胡萝卜 型转化酶基因启动子 ,将胡萝卜基因组 DNA分别用 Pvu 、Eco R 、Dra 和 Sma 酶切 ,酶切片段与一特殊的衔接头连接 .取连接产物作模板 ,以衔接头引物和基因特异引物做 PCR,得到的主要 PCR产物分别为 3.4kb、1 .3kb、0 .4kb和 0 .6kb.将 Eco R -衔接头体系的 PCR产物克隆和测序 ,并将其序列与 Gen Bank中的已知序列进行比较分析 ,发现了一个新的胡萝卜 型转化酶启动子序列 ,它含有类似于 TATA box和 CAAT box的元件 ,在启动子的远上游区域还含有多个 AT富含区 .该启动子的发现对于研究植物中糖代谢具有重要意义 .     

ut-PA抗PAI-1突变体的构建及在sf-9细胞中的表达

为使嵌合分子 ut- PA获得抗 PAI- 1抑制作用的性质 ,将删除了编码 u- PA中 R1 78- R1 79-H1 80 - R1 81的 1 2个核苷酸的 u- PA c DNA[u- PA( 1 ) ]的 Bam H - Eco R 部分酶切片段 ,克隆到含嵌合蛋白 ut- PA基因的转移载体 p VL 1 392 - ut- PA的相应位点中 ,构建了一个含有新的嵌合蛋白基因 ut- PA( 1 )的转移表达载体 p VL1 392 - ut- PA( 1 ) .在昆虫病毒表达系统 sf- 9细胞中表达该嵌合蛋白基因 ,表达上清具有纤溶性 ,用血纤维蛋白平板法和 S2 4 44 显色底物法分别测得活力为 2 4 8IU/ml和 380 IU/ml     

ut-PA抗PAI-1突变体的构建及在sf-9细胞中的表达

为使嵌合分子 ut- PA获得抗 PAI- 1抑制作用的性质 ,将删除了编码 u- PA中 R1 78- R1 79-H1 80 - R1 81的 1 2个核苷酸的 u- PA c DNA[u- PA( 1 ) ]的 Bam H - Eco R 部分酶切片段 ,克隆到含嵌合蛋白 ut- PA基因的转移载体 p VL 1 392 - ut- PA的相应位点中 ,构建了一个含有新的嵌合蛋白基因 ut- PA( 1 )的转移表达载体 p VL1 392 - ut- PA( 1 ) .在昆虫病毒表达系统 sf- 9细胞中表达该嵌合蛋白基因 ,表达上清具有纤溶性 ,用血纤维蛋白平板法和 S2 4 44 显色底物法分别测得活力为 2 4 8IU/ml和 380 IU/ml     

人Leptin的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用 RT- PCR自脂肪细胞 RNA扩增人瘦素 (leptin)基因的 c DNA片段 (约 50 0 bp)并克隆至克隆载体 p SK(+) ,获得重组质粒 p SK- OB,DNA序列分析显示获得的 Leptin基因和文献报道一致 .用限制酶 Eco R 和 Bam H 从 p SK- OB切下并插入原核表达载体 p BV2 2 0的相应限制酶位点 ,转化大肠杆菌 DH5α.转化菌株经 42℃诱导 ,SDS- PAGE检测和 Western印迹鉴定 ,获得高水平重组人瘦素的表达菌株 ,其表达量达菌体总蛋白的 30 %以上 .     

II型限制性核酸内切酶在真核生物染色体显带中的应用

限制性核酸内切酶（简称限制酶)能切割DNA双链。已知的限制酶有I, II和III型三类。II型限制酶能识别专一核普酸序列,并在识别序列内有固定切割点,是分子生物学研究和基因工程重要工具酶。1980年,以II型限制酶处理印度鹿染色体,沿染色体纵轴得到选择消化结果^[16]。目前,限制酶这一应用研究发展成称为限制性核酸内切酶显带（Restriction endonuclease banding）的最新显带技术,已应用于哺乳类、鸟类、两栖类、鱼类和昆虫等真核生物。限制酶显带与其他显带法相比有其特点,特别在揭示异染色质的异质性方面有其独到之处。本文介绍此项技术的发展与现状,并指出需要进一步探索的几个主要方面。     

Maxam-Gilbert DNA序列分析实验方法(续)

[~(32)P]-5末端标记DNA片段的制备在建立了限制性内切酶图谱后,即可拟订序列分析的计划,即选择好要进行5’末端标记的内切酶切点,以及用于分离DNA片段的两个     

食用真菌线粒体DNA的直接分析

该文报道了以限制酶HaeIII酶切13个食用菌栽培品种的总DNA,在琼脂糖凝胶上直接显现线粒体DNA带的结果。结合另外两种限制酶CfoI和MSpI的酶切结果和HaeIII在其它真菌中的研究报道,提出了利用识别四个GC对的限制酶酶切真菌总DNA,直接分析线粒体DNA的方法。     

分子生物学技术讲座（二）——分子克隆中所用的酶

限制性内切酶及其它DNA与RNA修饰酶是分子克隆技术的基本工具。1限制性内切醉和DNA甲基化酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的特定的DNA序列或附近的序列,并在此切割DNA双链。它可以分成3类：Ⅰ类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP的限制（切割）活性。Ⅰ类酶结合于识别序列,但随机切割DNA;Ⅲ类酶能在识别序列位点切割DNA。在分子克隆中1类和皿类酶都不常用。D类限制一修饰系统限制性内切醇和修饰（甲基化）酶不在同一蛋白分子中,限制性内切酶能专一地切割识别序列,并不依…     

鸡肝脏线粒体DNA的限制图谱

本文用六种限制性内切酶对鸡肝脏线粒体DNA(mtDNA)进行了酶解。Eco RⅠ、Bam HⅠ、SalⅠ、HindⅢ、BglⅠ在鸡肝mtDNA上分别有2、2、3、4、4个切点,BglⅡ不能切割鸡肝mtDNA。根据鸡肝mtDNA的单酶、双酶完全酶解以及部分酶解片段的分子量,建立了鸡肝mtDNA的限制图谱。     

杨尺蠖核型多角体病毒的DNA特性

本文报道了AciNPV-DNA的纯化及特性,证明纯化DNA具有典型紫外吸收光谱,在Sepharose 2B柱层析和超离心沉降分析中呈单一峰,Tm值为70.2℃,其(G+C)％=39.8％,增色效应为34％,限制性内切酶Pst Ⅰ,PvuⅡ,SaI Ⅰ,Eco R Ⅰ,BgI Ⅰ,XhoⅠ,Bgl Ⅱ酶切DNA,分别产生4,6,22,20,11,5,7个DNA片段,某些酶切电泳图谱中观察到亚分子片段,Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ双醇切DNA分子产生26个片段,Eco R Ⅰ酶切片段积加DNA分子量为56.55×10~6道尔顿,约85.70千碱基对,电镜观察DNA分子有线状和环状,环状分子长约27.38μ,分子量约为53.94×10~(?)道尔顿,以Eco R Ⅰ对1981～1985年林间连续复制回收的AciNPV的DNA同源性进行检测,结果无变化,AciNPV攻毒枣尺蠖幼虫所得枣尺蠖NPV,其DNA的Bgl Ⅱ图谱与AciNPV-DNA的Bgl Ⅰ酶谱有明显的差异。     

限制性酶

核酸限制性内切酶是识别双链DNA中专一序列的酶,主要从原核生物中提取。限制性内切酶可分为三类:第Ⅰ和第Ⅲ类酶在同一旦白中具有修饰作用(甲基化作用)和需要ATP的限制性裂解的活性。这两种酶都识别底物DNA中非甲基化的序列,不过第Ⅰ类酶的作用是随机的,第Ⅲ类酶则切DNA的专一位点。     

化学合成的DNA定位断裂工具

化学合成的 DNA 定位断裂工具是80年代初发展起来的一种新型非酶 DNA 定位断裂工具.它由 DNA 识别结合系统及化学断裂系统组成,能在人们预先设计的任何位点断裂 DNA 分子,具有制备简便、价格便宜、不受酶的天然专一性限制等优点.可应用于基因分离、染色体图谱分析、大片段基因的序列分析以及 DNA 定位诱变、肿瘤基因治疗与新的化学疗法等分子生物学领域.     

三种核型多角体病毒核酸同源性的研究

用分子杂交技术研究了黑点银纹夜蛾(Arqyrogramma agnata Stgr,)单粒包埋型核型多角体病毒(简称A,A,SNPV),斜纹夜蛾(Prodenia litura)多粒包埋型核型多角体病毒(简称PL MNPV)以及用A,A,SNPV感染斜纹夜蛾幼虫所获得的多粒包埋型核型多角体病毒(暂称PoI MNPV)三种病毒核酸的同源性,用SDS-Tris酚法分别提取病毒核酸,用内切酶Eco RⅠ酶解,比较了病毒核酸的酶解图谱及分子量,用〔α-~(32)P〕dATP标记的三种病毒核酸Eco RⅠ酶解片段作探针,分别与各病毒核酸的Eco RI酶解片段杂交,结果表明PoI MNPV与PL MNPV的病毒核酸同源,而A,A,SNPV DNA不与PoI MNPV DNA、PL MNPV DNA杂交,无同源序列。     

脱氧核酶:生物催化剂的新成员

具有酶活性的ＤＮＡ分子称为脱氧核酶(ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅ或ＤＮＡｚｙｍｅ) ,其发现是人类对于酶的认识的又一次重大飞跃。1 .脱氧核酶的几种结构Ｃａｒｍｉ等[1] 通过体外选择技术合成了一种依赖Ｃａ2 的具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子 (图 1 )。茎Ⅰ是结合部位 ,茎Ⅱ是催化部位。结合部位不同的碱基序列可以识别不同的底物 ;催化部位则相对保守。由于结合部位碱基配对是催化剂识别底物的基础 ,延长茎Ⅰ序列可以增加酶 底物复合物的稳定性 ,但序列过长则会造成ＤＮＡ分子自我构建 (ｓｅｌｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ)…     

一株产右旋糖酐酶青霉的分离及酶的纯化和性质

[目的]从土壤中筛选到一株新的产右旋糖酐酶的真菌F1001,为酶法制备药用级右旋糖酐提供新的右旋糖酐酶产生菌株.[方法]通过形态特征和ITS rDNA序列分析方法鉴定菌株.利用硫酸铵盐析、Sepharose 6B凝胶柱纯化,得到纯度较高的酶蛋白.以右旋糖酐70 kDa为底物,对右旋糖酐酶酶学性质及催化机理进行研究.[结...     

限制和修饰系统LlaBⅢ在构建抗噬菌体菌株中的作用

限制和修饰(restriction and modification,R/M)系统是指由限制性内切酶和甲基化酶组成的单亚基或多亚基复合酶系统,两者通常成对出现,具有相同的DNA识别位点,其作用相反.R/M系统在原核生物中普遍存在,在保护细胞免遭外源病毒侵害方面具有重要作用[1].