肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

肝特异性表达HCV5＇NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的.以2235A-1质粒为模板,通过PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段,用小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段取代pHCV-neo4质粒(含HCV5＇NCR调控荧光素酶基因)的CMV启动子,构建了一种白蛋白启动子启动转录的HCV5＇NCR调控荧光素酶表达质粒(pA1b-HCV).该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高,表明成功地构建了肝特异性表达的HCv5＇NCR调控荧光素酶表达质粒.该研究为建立肝特异性表达的HCV5＇NCR转基因小鼠模型奠定了基础,对评价HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义.     

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株。方法PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc—ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB—GLuc活性检测功能。构建逆转录病毒,感染HP14．5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB—GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达。结果PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14．5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB—GLuc活性与免疫荧光结果一致。HP14．5ALB—Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB—Gluc活性升高一致。结论成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5′NCR调控荧光素酶基因的表达

目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5′端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用。方法:以质粒pCMVN CRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5′端20nt和43nt的HCV 5′NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5′NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5′NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCN1-d1、pCNl-d2)。以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平。结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功。各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNRluc相比差异无显著性(P＞0．05);pCNl-dl、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0．05)。结论:HCV 5′NCR的5′端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性。     

二恶英反应增强子调控的虫荧光素酶报告基因质粒的构建

为加强二恶英类化学物质的快速筛选和半定量检测,我们构建了一在二恶英反应增强子调控下的虫荧光素酶报告基因质粒。二恶英反应增强子来源于pHAV质粒,MMTV启动子来源于pCatM质粒,上述两者连接后与虫荧光素酶载体连接,转染人HepG2肝癌细胞,以2,3,7,8四氯代二苯并二恶英(TCDD)诱导报告基因表达后检测虫荧光素酶活性。结果表明该质粒中虫荧光素酶的表达受二恶英反应增强子的调控,且在一定浓度范围内虫荧光素酶的活性与TCDD的量呈线性关系。研究显示该质粒转染的细胞株有望用于快速筛选及半定量检测二恶英,可进一步加强研究作为二恶英类化学物质监测的常规方法。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5＇NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5'NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

人Tudor-SN基因启动子荧光素酶报告基因表达质粒的构建及活性检测

目的 将人类Tudor-SN基因的启动子序列片段定向连入pGL3-Basic质粒载体,并进行鉴定和启动子活性检测.方法 以HeLa细胞全基因组DNA为模板,PCR法扩增出目的基因,利用XhoⅠ和HindⅢ双酶切法将目的片段连接到pGL3-Basic载体上.再将构建成功的pGL3-Basic-Tudor-SN-promoter重组质粒和内参质粒β-gal瞬时共转染入宫颈癌HeLa细胞,培养48 h后检测萤火虫荧光素酶活性.结果 双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,转染重组质粒后可检测到萤火虫荧光素酶活性.结论 成功构建了人类Tudor-SN基因启动子重组质粒,为Tudor-SN蛋白基因调控机制的研究奠定基础.     

小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及功能鉴定

利用PCR技术扩增小鼠高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因启动子序列,构建小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因pGL3-basic-HMGB1.经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法将pGL3-basic-HMGB1转入巨噬细胞264.7中,并应用萤光素酶测定系统检测其活性.检测结果显示pGL3-basic-HMGB1具有启动子活性.小鼠HMGB1启动子荧光素酶报告基因pGL3-basic-HMGB1的成功构建,为进一步研究HMGB1提供基本材料.     

Tet-on和Cre/loxP系统双重调控HCV NS5B真核表达载体的设计与构建

目的:构建可受Tet-on和Cre/loxP系统双调控的HCVNS5B真核表达载体,为建立可严格调控HCV NS5B蛋白表达的转基因小鼠奠定基础.方法:以真核表达载体pBI-3为载体构建骨架,在其启动子下游依次插入luc报告基因、BGH pA和NS5B基因片段,并分别在luc报告基因上游和BGH pA尾下游引入一个loxP位点.结果:成功构建了可受Tet-on和Cre/loxP系统双调控的HCV NS5B真核表达载体pBI-3/luc-BGH pA-NS5B.结论:pBI-3/luc-BGH pA-NS5B真核表达载体的成功构建为可严格调控HCV NS5B蛋白表达转基因小鼠的建立打下了良好的基础.     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

FLT-1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建和鉴定

目的：为探索FLT-1启动子靶向调控活性分析,克隆FLT-1启动子基因序列,构建并鉴定肿-1启动子调控的荧光素酶报告基因重组体pGL3-FLT—Basic—luc。方法：应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增FLT-1启动子序列,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic—luc中,构建含有正确目的基因的报告基因重组体pGL3-FIT—Basic—luc,通过限性内切酶酶切、PCR及测序进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及基因测定证明,所克隆的基因产物与预期结果-致,序列无碱基突变。结论：成功构建了含有FLT-1启动子基因序列的荧光素酶报告基因真核表达载体,为下-步分析该启动子活性及血管疾病的基因治疗奠定基础。     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

HCV特异性反义RNA表达载体的构建及活性评价

反义RNA是反义技术的一个重要领域,为探索丙型肝炎病毒治疗新途径及验证转基因细胞模型HepG2.9706的有效性,设计了一条互补于HCV 5′NCR及翻译起始区(39713核苷酸)的反义RNA序列,将其插入pGL3载体SV40启动子下游,构建了HCV特异性的反义RNA真核表达载体(pHCV-asR)。通过PCR扩增、酶切反应及序列分析进行了初步鉴定,并将其转染HepG2细胞,通过RTPCR方法检测其在细胞中的表达并将pHCV-asR转染转基因细胞模型HepG2.9706,评价其对HCV 5′NCR的抑制活性。结果表明,构建的反义RNA表达载体插入序列正确,并能在HepG2细胞中表达;pHCV-asR在HepG2.9706中对HCV 5′NCR调控荧光素酶基因表达具有特异性的剂量依赖性抑制活性,最高抑制率可达57%。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5'NCR调控荧光素酶基因的表达

目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法:以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5'端20nt和43nt的HCV 5'NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5'NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCNl-d1、pCNl-d2).以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性(P＞0.05);pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0.05).结论:HCV 5NCR的5'端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

人A33基因5′调控区的组织特异性表达元件

在对人A33基因 5′调控区初步研究的基础上 ,进一步采用体外足迹法、电泳迁移率变更分析(EMSA)和定点突变等实验对A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域进行了重点研究 .在A33启动子的- 10 4～ + 2 5bp区域内存在两个转录正调控元件 ,它们分别位于转录起始位点上游 - 86～ - 6 8区(A)和 - 40～ - 19区 (B) .通过对转录因子数据库的查找 ,发现A区与转录因子GKLF (gut enrichedKr櫣ｐｐｅｌ likefactor)的结合位点吻合 ,而B区则没有找到与之相应的转录因子 .EMSA实验表明 ,A区与核蛋白的结合存在组织特异性 ,而B区的结合则无组织特异性 .推测A区所包含的顺式调控元件很可能是决定A33基因组织特异性表达的关键元件 .根据B区所处的位置和富含AT来分析 ,它极有可能是和通用转录因子及RNA聚合酶结合的区域 .A和B两个区域的点突变都可使A33启动子的活性丧失 85 %以上     

人A33基因5′调控区的组织特异性表达元件

在对人A33基因 5′调控区初步研究的基础上 ,进一步采用体外足迹法、电泳迁移率变更分析(EMSA)和定点突变等实验对A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域进行了重点研究 .在A33启动子的- 10 4～ + 2 5bp区域内存在两个转录正调控元件 ,它们分别位于转录起始位点上游 - 86～ - 6 8区(A)和 - 40～ - 19区 (B) .通过对转录因子数据库的查找 ,发现A区与转录因子GKLF (gut enrichedKr櫣ｐｐｅｌ likefactor)的结合位点吻合 ,而B区则没有找到与之相应的转录因子 .EMSA实验表明 ,A区与核蛋白的结合存在组织特异性 ,而B区的结合则无组织特异性 .推测A区所包含的顺式调控元件很可能是决定A33基因组织特异性表达的关键元件 .根据B区所处的位置和富含AT来分析 ,它极有可能是和通用转录因子及RNA聚合酶结合的区域 .A和B两个区域的点突变都可使A33启动子的活性丧失 85 %以上     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体的构建

目的:构建解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,为寻找调控UCP1表达的小分子化合物提供有效工具。方法:从小鼠基因组DNA中PCR扩增小鼠UCP1启动子上游2000 bp序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,构建p GL3-UCP1启动子。测序正确后,提取质粒,然后将上述载体与p RL-TK载体共转染至HEK293细胞、小鼠白色脂肪前体细胞和小鼠棕色脂肪前体细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果:通过PCR成功扩增获得了目的片段,并将其克隆至p GL3-basic中。与细胞内源UCP1表达水平相似,荧光素酶报告系统表明构建的p GL3-UCP1在棕色脂肪细胞中启动子活性最高,在白色脂肪细胞中活性较低,在HEK293细胞中基本没有活性。同时β3肾上腺素受体激动剂CL 316,243同样能够上调p GL3-UCP1的启动子活性。结论:成功构建了小鼠UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,并证明在棕色脂肪细胞中,该启动子具有很强的启动子活性,而在白色脂肪和HEK293细胞中,启动子活性很低。该启动子报告系统有望为寻找激活UCP1的小分子化合物提供重要平台。