棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的研究(五)

应用微热量计研究了棕色固氮菌固氮酶铁蛋白与MgATP或MgADP络合的热力学状况。在25℃,1大气压下铁蛋白与MgATP饱和络合时的焓(⊿H~0)变化为-4.78千卡/摩尔,自由能(AGO)变化为-6.66千卡/摩尔,熵(⊿S~0)变化为+6.31卡·度/摩尔。在铁蛋白与MgATP络合时,随着MgATP浓度的增加,-⊿H~0也随之增加呈S型曲线,铁蛋白与MgADP饱和络合时⊿H~0为-5.45千卡/摩尔,AGO为-6.89千卡/摩尔,⊿S~0为+4.82卡·度/摩尔。熵的增加表明MgATP或MgADP与铁蛋白络合后,引起铁蛋白构型的变化。铁蛋白与MgATP或MgADP饱和络合时的TASO分别为+1.88千卡/摩尔和+1.44千卡/摩尔。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白特性的研究(三)

应用亚铁螯合剂研究了棕色固氮菌固氮酶铁蛋白中Fe_4S4_簇与Mg·ATP的关系。未变性铁蛋白与螯合剂无反应。Mg·ATP和PCMB促进铁蛋白中的铁与螯合剂的反应。Mg·ADP抑制Mg·ATP的作用。加入Mg·ATP或PCMB后1小时内有75％以上的铁被螯合,20小时内几乎全部被螯合(97％以上)。单独的ATP,ADP,Mg~( )无作用。氧钝化铁蛋白中铁能直接与螯合剂反应,Mg·ATP或PCMB浓度与反应速度的关系符合S型动力学。用Hill作图法得到斜率的为2,说明在铁被螯合前Fe_4S_4簇上(或附近)的两个位置已参与反应。Brdicka反应和羟甲基化作用结果表明钼铁蛋白与铁蛋白巯基二者的相互作用。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白某些特性的研究(二)

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白能与Mg-ATP结合,而钼铁蛋白则不能。每分子铁蛋白结合2个分子Mg-ATP。结合常数K为13.3～15.6μM。铁蛋白与不同浓度ATP结合时符合S型动力学。铁蛋白引起结合Mg-ATP后构型变化。在未变性的铁蛋白的12个半胱氨酸残基中,只有4个可被羧甲基化,加入Mg-ATP或低浓度对氯汞苯甲酸后,只有2个半胱氨酸残基被羧甲基化。对氯汞苯甲酸抑制铁蛋白活性,先加Mg-ATP再加列氯汞苯甲酸,能保持部分活性。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白两种聚合体的研究

 棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白八聚体相当于两个钼铁蛋白四聚体的聚合体。在细胞生长过程中,胞内钼铁蛋白两种聚合体的相对含量出现规律性变化:在对数期,细胞固氮酶比活力成上升趋势,而钼铁蛋白主要以高活力的四聚体形式存在;在对数期结束至稳定期,细胞固氮酶比活力下降至一个低水平的稳定值,此时的钼铁蛋白基本上为八聚体形态。在细胞固氮生长时,向培养基中加入过量氨可明显地导致钼铁蛋白由四聚体向八聚体的转化。我们推断,生长过程中胞内钼铁蛋白聚合态的变化可能是调节固氮酶活力的一种方式。胞外,钼铁蛋白的两种聚合态可以相互转化。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的提纯及其某些特性的研究

用DEAE-纤维素和凝胶过滤法,可将棕色固氮菌固氮酶铁蛋白组分提纯43倍,比活性述512毫微克分子NH3／毫克蛋白·分。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检定,呈均一状态,不含色氨酸、钼。每分子铁蛋白含3．89个原子Fe,分子量约64,000。氨基酸组分分析结果表明,铁蛋白中酸性氨基酸含量为碱性氨基酸含量的一倍。在380—650毫微米区内有宽的吸收带,但无明显吸收峰。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的几种化学修饰方法

用对氯汞苯甲酸或二巯基双二硝基苯甲酸修饰巯基。用三硝基苯磺酸、重氮四唑和焦碳酸二乙酯分别修饰氨基、酚式羟基和眯唑基。在一定范围内,被修饰钼铁蛋白在特征波长吸收值的上升和重组活性的下降与修饰剂用量的增加和时间的延长相一致,超过该范围后则光吸收和活性都保持不变。由于无氧凝胶过滤去除多余的修饰剂时未加连二亚硫酸钠,甚至正常钼铁蛋白的重组活性下降了24.2％,修饰后的铝铁蛋白活性下降范围为23.4～41.4％不等。     

棕色固氮菌突变种UW45的固氮酶钼铁蛋白(NifB-Av1)结晶

经两次DE52和Sephacryl S-300柱层析,从棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW45粗提液(37 677 mg蛋白)中纯化得到628 mg的NifB-Av1.经考马斯亮蓝R-250染色的SDS凝胶电泳分析表明,该蛋白基本达到SDS凝胶电泳纯,组成它的亚单位的种类与Av1(α和β亚单位)相似.NifB-Av1不能与NifB-Av2重组成具放氢活性的固氮酶,但可使与其保温重组的FeMoco显出高活性.在合适条件下,NifB-Av1可在结晶溶液中析出棕色短斜四棱柱晶体,目前所得最大晶体的二维边长均为0.1 mm.能否出现晶体以及出晶时间、晶体数目、大小、质量和形状等,与沉淀剂溶液各组分的种类和浓度、结晶方法、实验操作等因素密切相关.初步结果表明,所得晶体为NifB-Av1单晶.     

棕色固氮菌缺失nifE的突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)缺失nifE的突变种DJ35中,分离纯化得到缺失FeMoco的钼铁蛋白(ΔnifE Av1).在一定条件下结晶得到深棕色短斜四棱柱晶体.结晶溶液中各组分的浓度以及结晶方法等对其晶核数目、晶体大小和质量有明显影响.目前用气相扩散的悬滴法所得的最大晶体的二维边长分别为0.12 mm和0.13 mm.     

棕色固氮菌缺失nifE的突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii Lipmann)缺失nifE的突变种DJ35中,分离纯化得到缺失FeMoco的钼铁蛋白（△nifEAvl)。在一定条件下结晶得到深棕色短斜四棱柱晶体。结晶溶液中各组分的浓度以及结晶方法等对其晶核数目,晶体大小和质量有明显影响,目前用气相扩散的悬滴法所得的最大晶体的二维边长分别为0.12mm和0.13mm。     

缺失nifH的棕色固氮菌突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养的缺失nif H的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ54中,分离纯化出部分纯的缺失FeMoco的钼铁蛋白(△nifH Av1).用相同纯化方法分别从DJ35和UW45突变种中纯化的△nifE Av1和NifB- Av1的纯度明显高于△nifH Av1的纯度.在合适的结晶条件下,可得到这三种蛋白的深棕色短斜四棱柱晶体.△nifH Av1与NifB- Av1一样,晶体形成所需的时间比△nifE Av1的长.而它结晶所需的沉淀剂和缓冲液最适浓度则与△nifE Av1的相同.SDS-PAGE鉴定表明,结晶的△nifH Av1与OP Av1的组成相似.这表明,在△nifH Av1溶液中形成的晶体可能就是该蛋白质的晶体.     

缺失nifH的棕色固氮菌突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养的缺失nifH的棕色固氮菌(AzotobactervinelandiiLipmann)突变种DJ54中,分离纯化出部分纯的缺失FeMoco的钼铁蛋白(ΔnifHAv1)。用相同纯化方法分别从DJ35和UW45突变种中纯化的ΔnifEAv1和NifB-Av1的纯度明显高于ΔnifHAv1的纯度。在合适的结晶条件下,可得到这三种蛋白的深棕色短斜四棱柱晶体。ΔnifHAv1与NifB-Av1一样,晶体形成所需的时间比ΔnifEAv1的长。而它结晶所需的沉淀剂和缓冲液最适浓度则与ΔnifEAv1的相同。SDS-PAGE鉴定表明,结晶的ΔnifHAv1与OPAv1的组成相似。这表明,在ΔnifHAv1溶液中形成的晶体可能就是该蛋白质的晶体。     

棕色固氮菌nifZ与固氮酶钼铁蛋白P—cluster合成的关系

与野生型固氮菌（OP）MoFe蛋白相比,缺失nifZ的棕色固氮菌（AzotobactervinelandiiLipann）突变种的△nifZMoFe蛋白对乙炔的还原活性和Fe／Mo比值都显著降低。在相同实验条件下从这两种MoFe蛋白中抽提出的FeMoco在催化活性和金属组成方面都很相似,而这两种蛋白的圆二色（CD）谱则有显著差异,除在540－750nm外,△nifZMoFe蛋白在可见光区域380－540nm的△ε明显降低并在430nm附近处出现一个奇特的尖负峰;而在紫外区域的208nm和222nm负峰的高度却明显增加。△nifZMoFe蛋白可在合适浓度的PEG8000和MgCl2溶液中结晶出来,而晶体大小和出现沉淀多少与上述CD谱的负峰有关。这表明：棕色固氮菌nifZ与MoFe蛋白P-cluster的合成有关,并由此影响蛋白质的构象、稳定性和结晶过程。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白纯净铁钼辅因子的制备和性质

建立了以挥发性酸碱(TFA/NH_4OH)和NH_4OH碱化的NMF从棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白分离提取纯净铁钼辅因子(FeMo—co)的方法。得到了纯净FeMo-co的NMF制剂,从而证明了Tris、ClNa~ 、柠檬酸、HPO_4~(-2)、S_2O_4~(2-)以及氨基酸残基不为FeMo—co的有效分离和结构稳定所必需。制备的纯净FeMo—co的Fe/Mo比为8,比活为230nMC_2H_4/min/MoMn。由于分离制备的FeMo—co制剂除抽提溶剂NMF外不含任何其他成分,所以是进行FeMo—co结晶和结构研究的理想材料。     

用酒石酸解离棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白获得的含钼铁组分

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白结晶,经处理先后出现一个与福林试剂呈颜色反应的洗脱峰Ⅰ和一个与茚三酮试剂呈颜色反应的洗脱峰Ⅱ。洗脱峰Ⅰ、Ⅱ均含有钼和铁。钼和铁的洗脱峰位基本上与蛋白或肽的洗脱峰位相符合。 两个洗脱峰中的成分都能激活棕色固氮菌突变株UW45无细胞抽出物的非活性组分Ⅰ,比活分别为17.8和6.8毫微克分子乙烯/分/毫微克原子钼,并能在硼氢化钾存在下自身催化还原乙炔,比活分别为16.9和50.9毫微克分子乙烯/分/毫微克原子钼。 峰Ⅰ与峰Ⅱ的组成不同,峰Ⅰ是一种组分,峰Ⅱ是两种组分的混合物。峰Ⅰ组分是不同于固氮酶钼铢蛋白的一种蛋白质。洗脱峰Ⅰ组分的分子量是5000道尔顿,洗脱峰Ⅱ两种组分的分子量分别是2100和1850道尔顿。经测定,峰Ⅰ组分和峰Ⅱ中分子量为2100道尔顿的组分含有钼、铁。因此,通过酒石酸处理可以从上清液中得到两种含钼铁的组分。这两种组分的红外吸收光谱也是明显不同的。 酒石酸处理后的沉淀再用N-甲基甲酰胺抽提获得的组分,具有恢复棕色固氮菌突变株UW45乙炔还原活性的能力。经纸层析鉴定,与Shah法制备的铁钼辅因子相类似。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白中含钼铁活性小分子组分的解离

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白结晶,经酒石酸解离后得到一个含钢铁小分子组分,与棕色固氮菌突变株uw_(45)无细胞提取液的重组比活为6.8nM Mo natom~(-1) min~(-1)。它是由二种物质组成的混合物,其分子量分别为2100和1850道尔顿,分子量为2100道尔顿的成分含钼铁。酒石酸处理后的沉淀,再用N—甲基甲酰胺抽提得到的含钼铁组分具有恢复突变株uw_(45)乙炔还原活性的能力。经纸层析鉴定与用Shah法制备的铁钼辅因子相类似。由于Shah和Smith法制备的两种铁钼辅因子还原乙炔和氰化钾的比活不同,而且分子量也有大小,说明这两种铁钼辅因子结构可能不尽相同。     

棕色固氮菌突变种UW45的固氮酶钼铁蛋白（NifB-Av1）结晶

经两次DE52和Sephacryl s一300柱层析,从棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变利UW45粗提液(37 677mg蛋白)中纯化得到628 mg的NifB^-Av1。经考马斯亮蓝R-250染色的SDS凝胶电泳分析表明,该蛋白基本达到SDS凝胶电泳纯,组成它的亚单位的种类与Av1(α和β亚单位)相似。NifB^-Av1不能与NifB^-Av2重组成具放氢活性的固氮酶,但可使与其保温重组的FeMoco显出高活性。在合适条件下,NifB^-Av1可在结晶溶液中析出棕色短斜四棱柱晶体,目前所得最大晶体的二维边长均为0．1mm。能否出现晶体以及出晶时间、晶体数目、大小、质量和形状等,与沉淀剂溶液各组分的种类和浓度、结晶方法、实验操作等因素密切相关。初步结果表明,所得晶体为NifB^-AV1单晶。