一种新的简单有效的斑马鱼胚胎心脏富集和提纯方法

目的:设计一个从斑马鱼胚胎得到大量完整高纯度心脏的新方法,从而用于测定早期心脏的基因表达。方法:收集上百颗心肌特异表达绿色荧光(cmlc2-GFP)的转基因斑马鱼的胚胎放入冰浴的10%胎牛血清L-15培养基中,用一个5 m L注射器反复抽吸迫使胚胎卵黄囊和心包腔破裂,在荧光显微镜下用微量毛细吸管收集游离的心脏,同时用单独的EP管收集身体组织,最后用荧光定量PCR技术(RT-PCR)验证提纯心脏组织的生物活性和特异性。结果:提取的大部分胚胎心脏的形态是完整的,约200颗胚胎心脏中提取了300 ng总RNA。提纯的活性心脏组织不仅高表达心脏特异性基因(cmlc2,myh6),而且几乎不表达非心脏组织的特异基因(six3b,ifabp)。结论:利用这个简便方法富集和提纯斑马鱼胚胎心脏可以得到高度纯化并具有生物活性的心脏组织。     

增大显微摄影中有效景深的一种简易方法

在显微摄影时,如果在不同平面观察到一些互为补充的结构,而且这些结构对研究者来说都是需要的,则常常拍摄几张不同平面的照片,然后通过剪辑复合出整体结构。这样拍摄出的照片会给读者增加理解的困难,发表文章时也常浪费版面。为了克服这种局限,我们采取了一些简易的改进方法,现介绍如下:     

Bodipy-C12在癌细胞过氧化物酶体中富集

目的:研究并比较Bodipy标记的月桂酸(Bodipy-C12)在癌细胞与正常细胞中的亚细胞定位。方法:在多种癌细胞和正常细胞的培养基中加入Bodipy-C12(1μg/m L),利用共聚焦显微镜活细胞定时间隔拍摄,结合不同细胞器的分子标记蛋白,观察Bodipy-C12五分钟内在不同细胞器中的定位。结果:在人肝癌细胞系HepG2细胞中,Bodpy-C12信号不仅仅存在于线粒体和脂滴,同时富集于过氧化物酶体中。我们分别采用Pex3-GFP、Pex14-GFP、GFP-Pex16、GFP-SKL和GFP-Pmp34等特异性定位的过氧化物酶体蛋白,确认Bodpy-C12信号富集于过氧化物酶体。此外,过氧化物酶体中Bodpy-C12信号的富集发生在更多的癌细胞系中,例如结肠癌细胞HCT116和乳腺癌细胞MCF7。不同的是,在正常细胞系如3T3-L1,NRK和COS7中,Bodipy-C12信号存在于线粒体和脂滴中,但未在过氧化物酶体中检测到。结论:Bodipy-C12信号存在于正常细胞和癌细胞的脂滴和线粒体中,且其在癌细胞过氧化物酶体中富集,而不存在于正常细胞的过氧化物酶体中,预示癌细胞中过氧化物酶体脂代谢的差异。     

一种显示植物染色体C带的有效易行的实验方法

在植物染色体分带技术中 C 带技术应用最广,它是显示染色体上结构异染色质区的一种方法,至今已在许多植物中获得了 C 带,并已应用于染色体的研究。现介绍一种有效易行的染色体显带方法,此法以蚕豆子叶为材料,用 NaHCO_3进行分带处理,具体做法如下。材料和方法(一)材料以蚕豆品种为材料     

分段DNA shuffling: 一种大分子海藻糖合酶有效的定向进化方法

[目的]红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)海藻糖合酶(Trehalose synthase,M-TreS)将麦芽糖转化生成海藻糖只需一步反应,且具有很好的热稳定性及pH耐受性,是潜在的工业生产海藻糖的酶源.为了提高该酶的性能,有必要对其进行定向进化.[方法]M-TreS基因(M-treS)大小为2 889bp.该蛋白质分子本身具有很大的进化空间,但是却不宜进行全长基因Shuffling.分段DNA shuffling是为大分子蛋白质(基因≥2 000 bp)的进化而设计的一种方法.该方法分为三步:(1)用两对引物分别扩增目的基因的上游片段和下游片段;(2)上下游片段各自进行Shuffling; (3)利用重叠延伸PCR连接上下游突变群,建立完整基因的突变文库.[结果]结合易错PCR,通过该方法经一轮进化获得一株酶活力是野生型1.6倍、催化效率是野生型2倍的突变株.序列分析表明,该突变株共有6个位点发生了氨基酸的替代,其中一个来自易错突变,2个来自同源重组,3个为随机突变.[结论]分段DNA shuffling是进化大分子蛋白质的有效方法.     

一种从苏铁叶片中有效提取RNA的方法

由于苏铁（ Cycas revoluta） 叶片中含有大量的多糖多酚等次生代谢物, 常规RNA 提取方法很难获得优质的RNA。在常规的CTAB 法中加入了硼砂和β- 巯基乙醇来消除多酚和多糖的干扰, 得到了一个从苏铁叶片中有效提取RNA 的方法, 每克鲜叶片可获得约930μg RNA。A260 280 和A260 230 的纳米波长的吸收比值都约为2 , 表明RNA 的质量较好。获得的RNA 可用于Northern blot 和反转录PCR 等分析, 也说明RNA 的质量比较好。此外, 改进的提取方法也适合于含有次生代谢产物的其它植物, 同样可以获得优质RNA。     

交联酶聚集体--一种无载体酶固定化方法

对一种崭新的无载体酶固定化技术——交联酶聚集体(Cross-linked Enzyme Aggregates,CLEAs)技术进行了文献综述。CLEAs技术是一种将蛋白质先沉淀后交联形成不溶性的、稳定的固定化酶。研究结果显示其活性和稳定性可与交联酶晶体(Cross-linked Enzyme Crystals,CLECs)技术相媲美。由于其制备不需要复杂耗时的结晶、纯化步骤,一般实验室都能实行,因而更有利于研究和应用的普及。该文就CLEAs的制备、在水溶液中的活性和稳定性在有机溶剂中的活性和作用机理及研究进行了介绍讨论。     

四膜虫培养中消除酵母菌的一种新方法

我们多年来利用梨形四膜虫作为细胞生物学方面的实验材料,取得较好的效果。但在培养过程中有时被酵母菌污染,一个梨形四膜虫常被上千个酵母菌包围着,极大地影响了实验的观察。为了消除这类杂菌的污染,我们曾采用过多种药物处理,用0.2％的双抗(青霉素和链霉素)多次处理均无效。改用0.2—1％的庆大霉素处理,不但未使污染消除,反而使绝大部分梨形四膜虫被药物杀死,而酵母菌却安然无恙,且继续生长繁殖。后来,改用梯度热处理消除法,取得良好的效果。方法以下:     

一种改进的DNA限制酶谱分析法——末端杂交分析法

本文介绍了末端杂交分析法,并就其优缺点与其他酶谱分析方法进行了比较。     

限制酶介导整合技术：一种克隆新基因的新策略

限制酶介导整合（REMI）技术是近年发展起来的一种研究新基因的方法,已被用于盘基网柄菌、酵母和丝状真菌等微生物细胞与发育过程的研究。结合质粒拯救技术,可快速分离质粒两侧未知的基因组DNA序列,进而对该序列做进一步分析和研究。我们简要介绍了REMI技术的基本原理、影响因素、缺点及其应用。     

一种筛选拟南芥突变体的有效方法

经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理的拟南芥种子,接种于MS培养基上,垂直放置培养4天后,将幼苗转移至胁迫培养基中,以倒置幼苗180°所形成的弯曲生长根作为指标筛选拟南芥耐营养胁迫突变体。利用这种方法,成功地筛选到一个耐低钾的隐性单基因拟南芥突变体。本方法同样适用于其他类型突变体的筛选。 Abstract：his paper introduces a root-bending assay for isol ation of Arabidopsis mutants tolerant to nutrition stress. Seeds of wild-ty pe Arabidopsis thaliana (ecotype Landersberg erecta) were mutagenized wi th ethyl methyl sulfide (EMS),and M2 populations were screened for mutants. Fo ur-day-old seedlings with 1-to 1.5-cm-long roots were transferred from the vertical agar plates onto to a second agar medium that was supplemented with det erminate stress. The seedlings were arranged in rows, and the plates were orient ed vertically with the roots pointing upward. After another 4 days, the root be nding seedlings were selected for putative mutants and transferred to soil to gr ow to maturity.Seeds from the putative mutants were screened again to determine the true mutants.By using this root-bending assay we have isolated a low-K+-tolerant (lkt1) mutant which is caused by single recessive nuclear mutation. F or lkt1 mutant screening,K+concentration of the medium was 100μmol/L because root growth of wild type seedlings was completely inhibited at or below this con centration.This root-bending assay is also applicable to other type of Arabid opsis mutant isolation.     

一种平末端连接的有效方法

转化效率与质粒大小成反比,而当质粒大于１５ｋｂ时,转化效率将成为限制因素,此时提高连接效率极为必要,特别是对于具有普遍性而效率又低的平末端连接。我们在连接反应体系中,加入相应的产生平末端质粒载体的限制性内切酶Ｈｐａ Ｉ、或ＥｃｏＲ Ｖ,与不加Ｈｐａ Ｉ,或ＥｃｏＲ Ｖ的连接反应相对照,连接产物转化大肠杆菌ＪＭ１０９后,产生的转化子比率分别为１９．９％和１０．３％（ｐＦｐ７）,３２．６％和９．７％（     

一种快速有效分析烟草花冠中花青素苷的方法

花青素苷（anthocyanins）成分和含量的分析是花色研究的重要内容之一。该文利用高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱技术（HPLC-ESI-MS）, 建立了一种快速有效地分析烟草（Nicotiana tabacum）花冠中花青素苷成分及含量的方法。在保证良好分离效果的基础上, 将分析时间缩短至15分钟, 大大提高了分析速度, 降低了成本, 并成功应用于转基因烟草花冠中花青素苷成分的分析。为不具备高效分析仪器（如超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS））的一般实验室研究花青素苷合成相关基因在烟草中的异源表达提供了一种有效且实用的分析方法。     

从棉铃虫体中提取总RNA的一种有效方法

昆虫组织细胞中含有大量的RNA酶 ,在提取其RNA时 ,防止RNA酶的降解 ,是保证所得RNA片段完整的关键。目前提取动物组织细胞总RNA的方法主要采用“异硫氰酸胍 酚 氯仿抽提”一步法操作 ,但从昆虫组织细胞中提取RNA尚无明确的方法。本实验根据昆虫组织细胞中RNA的分子结合其它蛋白等次生物质的特性不同 ,适当的调整该方法 ,从棉铃虫中提取到了完整、无降解、纯度高的RNA ,适用于Northern杂交和cDNA合成等分子生物学操作     

消除病原菌的酶

在自然界 ,生物之间的拮抗关系是客观存在的 ,科研人员利用这种关系为医疗服务 ,用于治疗疾病。对一切病原菌 (致病菌 )都有可能通过两条途径以治之 :一是利用致病菌的天然拮抗体来治疗 ;二是籍助酶的特定功能来消灭病原体。就前者而言 ,如常见的肺炎病症是肺炎链球菌 (Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ)侵染的结果 ,对它的致命拮抗体 ,主要有两类 :一是肺炎链球菌的噬菌体 ;二是肺炎链球菌的蛭弧菌 (Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ)。两者的功能是一致的 ,均营寄生生活 ;不过肺炎链球菌噬菌体是细菌病毒 ,而蛭弧菌则完全具有真细…     

一种酶可在工业硝化反应中取代硝酸

英国沃里克大学的研究人员从一种细菌中提取的酶可以在芳香烃硝化反应中取代硝酸。这项研究不仅可以改善工业上的芳香烃硝化反应，还有助于防治马铃薯疮痂病。     

介绍一种观察血液凝固的实验方法

取四凹玻片一块,在凹上方依顺序标上1、2、3、4字样。按下表滴加各种物品,待3％Cacl_2最后滴加后,立即用4枚大头针分别混匀,并记下时间。然后每隔30秒钟(室温低1分钟)用相应大头针挑凹内液体一次(沿一个方向),如出现纤维状细丝,则表示开始凝固。记录凝固     

一种保存实验用松花粉的方法

在中师生物学“观察松的叶和花”的实验中,松花粉观察这项内容常常不能进行。主要原因是讲授裸子植物一章的时间(10月底),错过了松的开花时间(春季);即使事先采集,用一般方法(如干藏法、有机溶剂藏法、蔗糖溶液藏法)保存松花粉,实验时花粉的气囊已经干瘪,     

介绍一种渗透作用实验的方法

介绍一种渗透作用实验的方法回方法步骤１．１处理好２个蛋壳取长形的近似大小的鸡蛋２个，将鸡蛋钝端处的蛋壳轻轻敲裂，在蛋的另一端即尖端用尖剪刀剪去蛋壳，使之成为一个整齐的小孔，然后稍用力摇动鸡蛋的蛋黄、蛋白，倒出蛋壳，并用水冲洗干净。再在蛋壳的钝端敲破处...