抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)2突变体在大肠杆菌中的高效分泌表达

构建抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)₂ 突变体 ,研究其在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的生物学活性。采用PCR法构建抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)₂ 突变体 ,并用双脱氧终止法测定DNA序列 ;采用 19L发酵罐高密度发酵抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)₂ 突变体 ,采用亲和色谱和分子筛色谱法纯化表达产物 ,并用SDS-PAGE和薄层激光扫描鉴定纯化产物 ;采用活细胞间接免疫荧光法测定纯化产物与靶细胞的结合活性 ;MTT法测定纯化产物对Raji细胞的生长抑制作用 ,并研究其作用机理。DNA序列测定结果表明 ,抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)₂ 突变体已成功构建 ,表达可溶性产物的产量达 360mg L ,具有与Raji细胞 (CD20⁺)结合的活性 ,并抑制Raji细胞的生长 ,其作用机理为诱导Raji细胞凋亡。此突变体有望成为治疗非何杰金氏B细胞淋巴瘤的药物。     

人肺腺癌细胞分化相关基因cDNAs的克隆

在用10^-5 mol/L全反式维甲酸(RA)诱导人肺腺癌细胞系GLC-82分化的基础上,以M13噬菌粒pSPORT1为载体,应用定向克隆技术,分别构建了未经RA诱导和RA诱导1d及4d细胞的3个cDNA文库.以含重组子的诱导文库单链DNA为靶标(Target)同未诱导文库的cDNA驱除子(Driver)进行消减杂交,富集RA特异性单链DNA,将富集的单链DNA回复为双链后转化感受态菌,建立细胞诱导分化过程中活化表达基因的cDNA消减文库,得到124个cDNA消减克隆.经同源性分析和与文库总cDNA作Southern印迹杂交,进而与RA诱导前后细胞的RNA作Northern印迹杂交,筛选出2个(RA5,RA28)诱导后呈早期瞬时表达和1个(RA42)呈早期并持续表达的cDNA克隆,cDNA全长分别为1.8,1.5和0.7kb.序列测定及初步功能分析结果表明,RA5,RA28和RA42这3个首次报道的序列,可能是人肺腺癌细胞分化相关基因的cDNA克隆.     

中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-γcDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-γcDNA序列存在多态性的推论.在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-γcDNA克隆到原核表达质粒pBV220 P_RP_L启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-γcDNA,其表达水平占全菌可溶性总蛋白的44.4%,初步复性后生物学活性测定结果表明γ-IFN表达量为0.45×10⁷～2.34×10⁷单位/L.     

牛生长激素cDNA的分子克隆

我们克隆了与牛生长激素Poly(A)⁺RNA互补的DNA(cDNA)。首先从小牛垂体中提纯总的Pply(A)⁺RNA,用AMV逆转录酶合成单链cDNA,以单链cDNA为模板合成双链cDNA,用多聚G及多聚c谱尾法将双链cDNA克隆到pBR322质粒的Pst I位点上,构建成牛垂体PoIy(A)⁺RNA的cDNA文库。以牛生长激素基因为探针,筛选出7个阳性菌落,经电泳鉴定有两个菌落(1号和2号)含有大于500bp的插入片段。1号克隆经酶切图谱、southeTn blot 杂交及序列分析证实含有牛生长激素的编码序列。     

人尿激酶原突变体的构建及其特性的研究

由于人尿激酶原（pro-UK）存在凝血酶和纤溶酶原激活剂抑制剂（PAI-1）的作用位点,在生产和治疗过程中容易失去活性。采用PCR介导的定点突变技术对pro-UK基因进行了突变,构建了3种人pro-UK突变体, 分别将蛋白序列中的凝血酶作用位点Arg¹⁵⁶突变成His¹⁵⁶,构建成pro-UKM1;将PAI-1的作用位点Arg¹⁷⁸、Arg¹⁷⁹、Arg¹⁸¹突变为Lys¹⁷⁸、Lys¹⁷⁹、His¹⁸¹构建成pro-UKM2;同时将凝血酶和PAI-1的作用位点突变构建成pro-UKM3。分别在CHO细胞中获得稳定表达。并对3种突变体进行了SDS-PAGE纤维蛋白自显影和Western blot分析,证明3种细胞表达的pro-UKM与天然尿激酶原带型一致,绝大多数为单链。体外溶栓试验表明,pro-UKM1对凝血酶有抵抗性,pro-UKM2对PAI有抵抗性,pro-Ukm3能有效抵抗凝血酶和PAI的活性抑制。特别是pro-UKM3具有开发成新型溶血栓药物的潜力     

人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV₂-PrUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV2-dhfr-或MMTV—dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr^-)。利用选择培养基选择出二氧叶酸还原酶基因表达阳性(dhfr⁺)的转化细胞灶。用溶解圈法测定尿激酶型纤溶酶原激活剂(u—PA)的生物活性,其中两株显著高于其他株细胞,命名为CLF-14和CLF-8,表达水平依次为24Iu／10⁶细胞／48h,16Iu／10⁶细胞／48h。用ELLSA测定CLF一14和cLF-8细胞上清,表现为强阳性,阳性值比阴性对照值(P／N)大于10,CLF-14和CLF-8细胞表达量分别为0．14-o．22μg／10⁶细胞／48h和0．08-O．14μg／10⁶细胞／48h。分泌产物能被抗尿激酶(UK)血清抑制,而不被抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的抗血清和正常兔血清抑制。     

肾癌相关基因克隆——肾癌cDNA消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术,构建人肾癌与正常肾差异表达的cDNA消减文库.分别从肾癌及正常肾细胞系中提取poly(A)⁺RNA,依次合成单链及双链cDNA,经酶切成平均大小为400～600 bp的片段,将肾癌cDNA分为两组,分别与两种不同的接头衔接,再与正常肾cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增.构建成功具有高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,非特异性cDNA片段被有效地消减,特异表达的cDNA得到富集.文库扩增后得到6 500个克隆,随机挑取350个制备质粒,酶切分析均得到400～600 bp插入片段.所构建的人肾癌cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆肾癌特异性表达的未知新基因奠定了基础.     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。     

日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA的克隆、表达及保护性免疫评价

根据GenBank日本血吸虫(Schistosoma japonicum)琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白(SjSDISP)不完整的表达序列标签(BU804141)以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物, 以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板, 采用锚式PCR策略, 对SjSDISP cDNA不完整的3′端和5′端进行扩增、测序, 用序列比对拼接电子软件比对, 基于重叠区进序列合并, 获得1071 bp的SjSDISP全长cDNA. 序列分析推断该片段含有编码SjSDISP基因的完整阅读框, 编码278个氨基酸残基. 将其编码基因克隆到原核表达载体pQE30上, 在大肠杆菌M15中获得准确、高效表达, 表达产物分子量约为32 kD. 用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对表达产物进行Western blot检测, 在预测位置上出现明显的识别条带. 用纯化的重组蛋白rSjSDISP免疫小鼠, 进行动物免疫保护性评价, 在虫荷、每克肝卵、每克粪卵和每雌子宫内卵数方面, 与佐剂对照组比较差异均具有显著性(P<0.05, P<0.01). 结果表明, 日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白酶(SjSDISP)全长cDNA成功克隆并在大肠菌中得到表达; 表达产物具有良好的抗原性和动物免疫保护效果, 是一种潜在的具有部分免疫保护性的抗日本血吸虫病疫苗候选分子.     

人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞(CH0)中高效表达研究

通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CH0细胞内高效表达了人尿激酶原(Pr0-UK)cDNA。首先将pro—UK cDNA插入到sR α启动子的下游,构建成表达质粒pMGl0102,在cos－7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2－dhfr线性化后用磅酸钙共沉淀法转染CH0－dhfr-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro—UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12．5—100IU／10⁶cells／d．再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500Iu／10‘cells／d。2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro－UK具有与天然pro—UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60％以上)。     

一个糖尿病肾病相关新基因的筛选、克隆和序列分析

利用Affymetrix寡核苷酸基因表达谱芯片对2型糖尿病肾病模型动物——db/db小鼠的肾脏基因表达谱进行了研究.在此基础上,利用末端快速扩增法和RT-PCR方法,对筛选出来的一个糖尿病肾病相关表达序列标签(EST)进行了cDNA克隆和表达分析.得到了一长为1.4 kb的cDNA,并暂时命名为mdnr411(mouse diabetic nephropathy related mRNA No.411).序列分析和网上数据库比对说明,这是一个新的cDNA序列.利用DNA序列分析软件对此cDNA阅读框进行的预测性分析表明,此cDNA包含了一个完整的阅读框序列.其编码的蛋白质由90个氨基酸残基组成.以氨基酸序列进行的同源性搜索表明,此多肽只与Archaeoglobus fulgidus 的Na⁺/H⁺ antiporter (napA-2)具有局部的同源性.以上结果表明,mdnr411是一个功能完全未知的小鼠糖尿病肾病相关新基因.mdnr411 cDNA的成功克隆,为进一步研究其生物学功能及其在糖尿病肾病发生、发展过程中的作用创造了条件.     

人肿瘤坏死因子及其突变体的基因工程下游工艺研究

研究了重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα)及其突变体[Lys²]-人肿瘤坏死因子[Lys²]-rhTNFα)的基因工程下游工艺。rhTNFα和[Lys²]-rbTNFα的温控表达工程菌株在B-BTaunE 10型15L自控罐中经发酵每升可得50g湿菌体。rhTNFα和[Lys²]-rhTNFα的表达水平仍能保持在50％以上,且表达产物为可溶性蛋白。所得菌体经超声破菌、硫酸铵沉淀,然后依次用DEAE—Sepharose FF、CM-Sepharose FF和Sephacryl S-200柱层析进行分离纯化,由每升发酵液菌体最终可得1g左右的纯品,纯度达到98％左右,rhTNFα的比活为～1.5×10⁸IU／mg,[Lys²]－rhTNα的比活为～6×10⁸IU／mg。     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

将编码血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区1-3 loop 316个氨基酸残基的cDNA插入到含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母载体中,构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His⁺Mut^s表型转化子,经摇瓶培养,1%甲醇诱导表达4 d后,SDS-PAGE结果显示,培养上清中Flt1(13)表达量达总蛋白的30%以上。ELISA及Western blot实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有结合VEGF的能力和抑制VEGF对HUVEC细胞的促增殖功能。     

cDNA微阵列技术分析NAG7基因对鼻咽癌细胞基因表达谱的影响

运用cDNA微阵列技术分析NAG7基因重表达对HNE1细胞基因表达谱的影响.抽提HNE1细胞和pcDNA3.1(+)/NAG7/HNE1细胞总RNA,分离polyA mRNA,将mRNA逆转录为cDNA,并在逆转录过程中用³³P-dATP进行标记,与含有16 150个基因和表达序列标签(EST)的cDNA表达阵列膜杂交,获得基因表达图谱.Array Gauge软件分析NAG7基因的重表达所导致的鼻咽癌细胞HNE1基因表达谱改变,并用RNA印迹对微阵列杂交结果进行验证.结果分析表明,2倍以上的差异表达基因或EST 179个,其中表达上调的91个,表达下调的88个;已明确基因表达产物的上调基因29个,下调基因37个.在差异表达基因中,涉及基因转录调控、信号转导、细胞生长、细胞代谢和细胞凋亡等基因.RNA印迹证实生长阻滞特异蛋白1（gas 1）基因表达上调.特别值得关注的是, 先前的蛋白质组研究结果亦发现NAG7基因可导致生长阻滞特异蛋白1表达上调,说明gas 1基因在NAG7重表达的HNE1细胞中具有重要作用,这为深入研究NAG7基因的作用环节和机理提供了重要的线索.     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGI在CHO细胞中的高效表达

为了得到t—PA组合突变体FrGGI在CHO细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子(enhancer)去除．构建了FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。酶切线性化后．采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr^-)。氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞,混合加压．挑选克隆。在1×10^-7mol／L MTX压力下。获得表达水平达1 500～2500Iu/106细胞·24h的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好．倍增时间约为36h．且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。     

不含信号肽序列人尿激酶原全长cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

从pro—uK全长cDNA中切下包括信号肽序列的N端371bp片段,经Fnu4HI不完全酶切将信号肽序列去掉,回收304bp片段,该片段再与人工合成的含HindⅢ、EcoRV内切酶位点和起始密码ATG的寡核苷酸片段连接,转化得一重组质粒,该中间质粒经酶切和序列分析证明构建正确后再与pro—UK cDNA其余片段相连按,得到全长pro一UK cDNA。我们将所得不含信号肽序列的pro—UK cDNA重组到带有PRPL启动子的原核表达载体pHv220中,转化大肠杆菌JM101,42℃诱导6h,菌体超声破碎后其上清及不溶性成份均可测出尿激酶活性。用ELISA法检测尿激酶抗原性表现为强阳性;纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定活性可达500－1000IU／L,经复性活性可达60000lU／L,虽表达产物可被抗尿激酶血清特异中和,经相差显微镜及电镜观察均证明表达蛋白绝大部分以包涵体形式存在。Western blot分析证明表达产物为单链pro-UK,分子量约为47kDa,与国外文献报导一致。     

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和活性研究

利用PCR方法从抗CD20单链抗体（ScFv）表达载体上扩增抗CD20抗体轻链可变区基因（V^L）、重链可变区基因（V^H）,同时在抗体的可变区引入突变,然后将V^H、V^L基因重组到Fab′表达载体pYZF1中,构建抗CD20嵌合抗体Fab′片段表达载体,并在大肠杆菌16c9中进行高效可溶性分泌表达。经大量的筛选,获得一个产量和活性均有所提高的突变克隆。其突变位点在轻链可变区的CDR1区,即G77→A（Ser→Asn）。突变的抗体的表达量为每克干菌3.8 mg,而未突变抗体的表达量为每克干菌1.3 mg。突变体的亲和力常数K_a为2.2×10⁹ L/mol,约为突变前的2倍。竞争性免疫荧光抑制实验表明,突变的Fab′片段能竞争性抑制鼠源性抗CD20抗体HI₄₇和CD20表达细胞Raji细胞的结合,使HI₄₇的结合阳性率由98%下降至37.55%,体外细胞生长抑制试验亦证明突变的Fab′片段的抑制活性明显高于未突变的抗体。     

人干扰素α 2b-胸腺肽α 1融合基因在家蚕细胞中的表达和活性研究

根据细胞因子协同作用的特点,采用重组DNA技术构建了人干扰素(IFN)α2b-胸腺肽(THY)α1融合基因,克隆到pBacPAK8上,获得重组转移载体pBacPAK-IFN-THY.与线形化Bm-BacPAK6病毒基因组DNA共转染家蚕细胞,经过体内重组,筛选到重组病毒Bm-BacPAK-IFN-THY.将Bm-BacPAK-IFN-THY感染家蚕细胞进行表达.DNA印迹证明IFN-THY已插入Bm-BacPAK6中（4 kb左右的杂交带）;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质印迹证明IFN-THY在家蚕细胞中得到了表达（分子质量为23 ku左右）,且具有IFN蛋白的免疫原性;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示96 h的表达产物IFN活性为3.72×10⁴ U/ml,120 h表达产物IFN活性为3.10×10⁵ U/ml,48～72 h表达产物IFN活性较低;48～120 h表达产物的玫瑰花结形成率均在10％以上.结果表明融合基因在家蚕细胞中得到了高效表达,表达的融合蛋白具有IFN-α2b和THY-α1的双重生物活性.     

抗CD5单链抗体基因克隆和表达

以分泌抗CD5单克隆抗体的杂交瘤细胞poly(A) mRNA为模板,通过RTPCR扩增出抗CD5单克隆抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL) cDNA片段组装出抗CD5单链抗体(ScFv) cDNA片段。该ScFv片段被克隆到pCANTAB 5E载体上,以E.coli TG1为宿主,进行噬菌体表面呈现。通过Molt4细胞表面分子CD抗原,对噬菌体表面呈现的ScFv进行免疫亲和富集筛选。经细胞ELISA鉴定,得到4株高亲和力克隆。DNA序列分析得知,单链抗体全长732碱基,其中VH为339碱基,VL为300碱基。抗CD5 ScFv在E.coli HB2151中以可溶形式分泌表达,产物主要分布于周质之中,占周质中总蛋白的20%。     

人端粒结合蛋白TRF1的克隆、表达和抗体制备

利用RT-PCR技术,从HeLa细胞的cDNA文库中扩增到人端粒结合蛋白1(hTRF1)基因编码区序列,克隆至pUCm-T载体,测序正确后,构建带His₆-tag原核表达载体pET-28c-TRF1,经IPTG诱导表达的His₆-TRF1融合蛋白分子量约为65kD,Western-blot证实表达产物可特异地与TRF1抗体sc-6165结合。用Ni^2＋NTA胶亲和层析纯化可得到电泳均一的融合蛋白,免疫新西兰纯种大白兔,获得特异性好的多克隆抗体,该抗体可用于免疫荧光染色和Western-blot方法检测哺乳动物细胞内源性的TRF1分子。