利用原生质体融合研究凤尾菇中性菌株的交配反应

凤尾菇营养缺陷型突变型中性菌株与另一株营养缺陷型的正常交配型菌株进行了原生质体融合反应.融合子之间以及与亲本之间在菌落形态和菌丝生长速度上表现出了较大差异。融合子菌落角变的菌丝体从多核体转变为双核体,并且在菌丝体上产生了圆桶状的特殊结构而不是通常的锁状联合。初步观察表明这些结构似乎与细胞核的迁移有关.对融合子子实体的担孢子进行了遗传分析,结果确证子实体是由两个亲本菌株的融合子产生,同时也表明要对中性菌株交配反应中基因重组进行深入分析还需要进行更多的研究。     

凤尾菇和裂褶菌原生质体非对称融合研究

具有双重营养缺陷型的裂褶菌单核体突变菌株的原生质体经过灭活处理后作为供体与同样带有营养缺陷型标记的风尾菇单核体原生质体融合,得到大量生长速度和菌落形态差异较大的多核体和双核体融合子．这些融合子主要显示了供体菌株的特性,数次转接后,有的融合子从多核体转变成双核体,有的融合子完全恢复了供体亲本双核体的遗传特性,同时获得了一些有意义值得继续探讨的新的生理特性,如菌丝体在木屑 皮以及废棉培养料上生长速度较快,在平板培养基和木屑培养料上均较早较快地形成原基和子实体等．结果表明原生质体非对称融合是一种效率较高的融合方式,可以作为食用菌育种的一种有效途经．     

黑木耳交配型的研究

从黑木耳Auricularia auricula沪3菌株的子实体收集,分离,鉴定得到157株单孢子萌发的单核菌丝体,以其中73株孢子单核体为材料进行交配实验,经过三配交配反应,结果表明,木耳的交配型符合四极性交配系统的分布规律。根据四种交配反应情况把73株孢子单核体分为四组,并从四组中挑选出B17,B177,B101,B65作为四种交配型的标准菌株;与此同时,从沪3菌株的双核菌丝体制备的原生质体中获得53株原生质单核体,对这些单核体进行交配,确定出两种亲本交配型,以Y150（A1B1）和Y121（A2B2）作为标准菌株,将两个亲本交配型标准菌株与四个孢子单核体标准菌株进行交配反应,初步确定出四种孢子单核体的交配型分别为：B17（A2B2）,B177（A1B1）,B101（A2B1）和B65（A1B2）。     

黑木耳交配型的研究*

从黑木耳Auricularia auricula沪3菌株的子实体收集、分离、鉴定得到157株单孢子萌发的单核菌丝体,以其中73株孢子单核体为材料进行交配实验,经过三轮交配反应,结果表明,木耳的交配型符合四极性交配系统的分布规律。根据四种交配反应情况把73株孢子单核体分为四组,并从四组中挑选出B17、B177、B101、B65作为四种交配型的标准菌株;与此同时,从沪3菌株的双核菌丝体制备的原生质体中获得53株原生质体单核体,对这些单核体进行交配,确定出两种亲本交配型,以Y150(A1B1)和Y121(A2B2)作为标准菌株,将两个亲本交配型标准菌株与四个孢子单核体标准菌株进行交配反应,初步确定出四种孢子单核体的交配型分别为: B17 (A2B2)、B177(A1B1)、B101(A2B1)和B65(A1B2)。     

凤尾菇和裂褶菌原生质体非对称融合研究

具有双重营养缺陷型的裂褶菌单核体突变菌株的原生质体经过灭活处理后作为供体与同样带有营养缺陷型标记的凤尾菇单核体原生质体融合,得到大量生长速度和菌落形态差异较大的多核体和双核体融合子。这些融合子完全恢复了供体亲本双核体的遗传特性,同时获得了一些有意义值得继续探讨的新的生理特性,如菌丝体在木屑麸皮以及废棉培养料上生长速度较快,在平板培养基和木屑培养料上均较早较快地形成原基和子实体等。结果表明原生质体非对称融合是一种效率较高的融合方式,可以作为食用菌育种的一种有效途径。     

高等担子菌双重营养缺陷突变菌株的分离

带有单一营养缺陷的凤尾菇和裂褶菌的单核体菌株经亲和性交配,各自交配产生后代,从中分离出遗传特性稳定,生理特征表型正常的双重缺陷营养害变型菌株,为原生质体融合育种研究提供了可靠的亲本菌株。     

凤尾菇和盖囊侧耳原生质体非对称融合的研究

盖囊侧耳的双核体原生质体经过灭活处理作为供体与带有营养缺陷型标记的凤尾菇单核体原生质体受体融合,得到大量生长速度和菌落形态差异较大的融合子,这些融合子主要显示了供体菌株的特性,数次转接和进行原生质体再分离后,有的融合子再生菌株恢复了供体亲本的遗传特性,同时获得了一些新的生理特证。结果表明原生质体非对称融合可以作为食用菌原生质体融合育种的一种有效方式。     

利用原生质体融合技术选育防治植物病虫害的基因重组菌株

本试验选用抗菌蛋白产生菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis) TG26和晶体蛋白产生菌苏云金芽孢杆菌(B.thuringiesis subsp,pacifeus) AS1.904的营养缺陷型衍生株,在聚乙二醇的诱导下进行原生质体种间融合,获得了表现双亲遗传性状的种间融合菌株。融合率为7.52×10~6,融合子经传代10次,稳定率为19.5%。融合菌株的菌落和细胞形态与亲本株明显不同。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,融合菌株表达了亲本的抗菌蛋白和毒素蛋白。抑菌杀虫试验表明,融合重组菌株具有抑制多种植物病原菌和毒杀鳞翅目幼虫的能力。     

凤尾菇和盖囊侧耳原生质体非对称融合的研究

盖囊侧耳的双核本原生质体经过灭活处理作为供体与带有营养缺陷型标记的凤尾菇单核体原生质体受体融合,得以大量生长速度和菌落形态差交大的融合子,这些融合子主要显示了供体菌株的特性,数次转接和进行原生质体再分离后,有的融合子再生菌株恢复了供体亲本的遗传特性,同时获得了一些新的生理特证。结果表明原生质体非对称融合可以作为食用菌原生质体融合育种的一种有效方式。     

互补交配型配对诱导蛹虫草有性子实体形成

前期我们获得了优良性状蛹虫草Cordyceps militaris野生菌株W141436,其子实体虫草素含量高达3.72 mg/kg干重,子实体多糖高达6.7 g/100 g干重,但在大规模应用中发现它发生退化。针对蛹虫草人工栽培退化问题,我们提出蛹虫草子实体形成是有性生殖过程,其两种交配型发生交配是蛹虫草子实体形成的必要条件。本文基于交配型基因分子标记研究了优良性状蛹虫草野生菌株W141436的退化机制。具体地,采用单孢子分离的方法对蛹虫草野生分离株W141436的子囊孢子进行分离,得到了72个单孢菌株。进一步采用PCR方法对单孢菌株及亲本菌株进行了交配型基因类型鉴定。在72个单孢菌株中,28株为Mat1-1类型交配基因型,31株为Mat1-2类型交配基因型,13株含有与亲本相同的交配型基因。根据鉴定结果,对2株Mat1-1型(SP28、SP33)和2株Mat1-2型(SP15、SP32)菌株进行了栽培实验。结果表明,形成子实体的栽培用亲本菌株同时含有Mat1-1和Mat1-2两种交配类型基因,即只有含不同交配型基因的菌株具有发育为子实体的能力,而含同种交配型基因的菌株则不能发育为子实体。本研究为防止蛹虫草在大规模种植中退化提供了理论依据。     

赤霉素产生菌——藤仓赤霉菌融合重组的研究

以一对营养互补的缺陷型突变株作为亲本,酶法去除细胞壁制成原生质体,以等量相混,用30%PEG 4000诱导融合,在最低营养再生培养基上直接选择原养型融合重组子,重组频率约为10~-,同时产生一定数量的不稳定异核体,频率约为10~(-5)—10~(-6).融合重组导致色素产生和菌丝形态及赤霉素产生能力的多种变异.融合重组子中赤霉素产量的正变率为15.3%.其中RN2和RG14菌株的赤霉素产量比原养型出发菌株207提高25%以上.     

农抗5102产生菌原生质体融合育种的研究Ⅲ．融合子的遗传分析

本文报道了用聚乙二醇(PEG)方法,将农抗5102产生菌的两株不同营养缺陷型突变体WNF-2-l-135(afg^-leu⁺)的原生质体和WNF-2-1-90(1eu-arg+)的原生质体进行融合,在再生培养基上再生细胞壁并获得稳定的原养型融合子。经测定,其中三个融合子(FR-001,FR—005和FR-008)在营养特性、菌体形态和培养特征等方面与两个亲本都有一定差别,在抗菌活性方面,FR-001菌杆和FR-005菌杆具有两个亲本菌株所能产生的三种抗生素,即5102-1号、5102-2号和5102-3号抗生素,FR-008菌株只能产生5102-1号和5102-2号抗生素,而不能产生5102-3号抗生素。融合子所产生的这些抗生素的活性大多比原始出发菌体和亲本要强。除此以外,三个融合子还都能产生两个亲本所没有的对酿酒酵母具有活性的抗生素,而且这种抗生素的性质,三个融合子也都各不相同。     

光木耳和琥珀木耳种间营养缺陷型原生质体融合研究

利用~(60)Co—γ射线辐照木耳担孢子,获得了9株营养缺陷型突变体。采用光木耳[Auricularia auricula(L,ex Hook.)Underw.]组氨酸缺陷型菌株Aa-γH-9和琥珀木耳[Auricularia fuscosucinea(Mont.)Farlow]腺嘌呤缺陷型菌株Af-γH-1进行种间原生质体融合实验,根据营养互补原理,在基础培养基(MM)上检出融合子,获得了稳定的融合子,融合子频率为3.34×10~(-4)—3.76×10~(-4)。初步遗传分析表明:融合子细胞核为单核,是单核异核体,融合子氨基酸含量、酯酶同功酶酶谱均与双亲不同。     

表型与亲本不易区分的茯苓同核体菌株新类型

茯苓Wolfiporia hoelen是我国传统中药材之一,也是一种食药兼用的大型真菌,目前已规模化栽培,但由于其交配系统一直不明确,影响了种质改良。前期我们发现了茯苓的同核体,明确了茯苓的交配系统和生活史,并建立了以培养特性和分子标记区分同核体的方法,但未明确是否适用于茯苓种群的不同个体。在对多个菌株的研究中,发现了同核体表型与亲本不易区分的茯苓菌株。本研究主要以来自日本的菌株775 (NBRC 30628)为亲本,对其同核体菌株进行收集鉴定,并对同核体菌株的培养特性、交配现象和杂交等进行了研究。此类菌株的同核体菌株可通过与亲本对峙培养进行鉴定,但菌丝生长、菌落形态和吃料速度等与亲本没有显著差异,不同交配型的同核体之间交配时没有明显的交配现象。rpb2杂合位点标记可以用于鉴定该类型同核体菌株,且能验证是否交配。该类型同核体与之前发现的同核体类型之间可以进行杂交,杂交菌株可与两亲本都产生拮抗现象。该发现补充了之前建立的茯苓同核体鉴定方法,加深了对茯苓物种群体的了解,同时丰富了茯苓的育种资源。     

斑玉蕈不同交配型的原生质体单核菌株差异分析

对2个斑玉蕈菌株进行了原生质体分离与交配型鉴定,并对不同交配型单核体的代谢特性进行了研究。结果表明,2个斑玉蕈菌株均出现2种交配型,2种交配型比例不一致,且2个菌株的两种单核体的分离比例均不符合1∶1分离比,交配型比例上出现明显的偏差现象。2个菌株中,不同交配型单核菌株的菌丝形态有明显差别,代谢过程中的菌丝生物量及发酵液的pH、还原糖含量和电导率均存在差异,表明在这2个菌株中不同交配型单核菌株的菌丝形态及代谢特性与交配型因子相关。     

雪峰虫草的生物学特性及其人工培育

雪峰虫草Ophiocordyceps xuefengensis为近年来发现的真菌新物种,它是生长在活体植物大青的根或者茎中的疖蝙蛾幼虫体上的寄生菌。本文报道了从天然雪峰虫草子座中分离获得菌株,从培养性状、形态特征、分子证据(ITS序列)等方面对该菌株进行了鉴定并确证为雪峰虫草的无性型。PCR检测表明该菌株含有MAT1-2交配型基因,但不含MAT1-1交配型基因。我们成功培育了雪峰虫草子座。     

灵芝尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选和分子鉴定

【背景】营养缺陷型是一种应用广泛的分子标记,但是目前在灵芝中还未有研究和应用报道。【目的】为灵芝遗传转化研究、杂交育种和菌种鉴别提供亲本材料和技术支持。【方法】采用紫外光诱变、单单杂交、孢子单核化的方法从灵芝单核体菌株出发得到尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。【结果】获得8株稳定的尿嘧啶营养缺陷型单核体突变菌株和7株尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。【结论】灵芝尿嘧啶营养缺陷型菌株在添加外源营养物的基础上可恢复正常生长,可以为灵芝遗传转化体系的构建和灵芝育种提供材料。     

顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)原生质体融合研究

三个不同系谱的顶头孢霉菌原生质体融合研究表明营养互补的原生质体融台能形成平衡异核体,其融合频率随不同系谱的菌株而异。不同系谱的菌株间融合,其融合子的cPc效价同亲本的生产能力密切相关。本文报道了从高产菌株STC-2B的姐妹突变株之间的融合获得二株生长速度快、产孢子能力强、CPC价高的二倍体菌株。     

高效草菇分子标记辅助杂交育种方法的建立与应用

【目的】建立一种高效草菇分子标记辅助杂交育种方法,并将其应用于选育低温高产草菇的单孢杂交中。【方法】通过出菇试验筛选获得高产草菇菌株,与低温出菇菌株VH3一同作为杂交亲本;采用交配型基因分子标记区分草菇单孢子的交配型,并完成杂交配对工作;最后结合快速筛选耐低温草菇菌种技术与杂交子真实性的鉴定方法,在栽培出菇试验前剔除部分不耐低温的草菇杂交子。【结果】出菇试验表明,屏优1号的生物转化率最高,用作杂交育种的高产亲本菌株。单孢杂交配对后,最初的496株草菇可能杂交菌株经初筛后,只剩余172株较耐低温的杂交菌株,使后期出菇试验的工作量减少了65%;杂交子出菇试验表明,在28 °C出菇温度下,VV093杂交菌株的生物转化率显著高于两个亲本菌株,且农艺性状较好。【结论】建立了一种高效草菇分子标记辅助杂交育种的方法,包括亲本菌株的筛选、单孢交配型的区分、单孢杂交、杂交子的鉴定和筛选等,并在低温高产草菇单孢杂交育种中成功应用。     

掘氏疫霉遗传学研究——Ⅱ.交配型遗传与变异的研究

本研究以掘氏疫霉Phytophthora drechsleri Tucker野生型菌株的单游动孢子无性系为亲本,测定了自交、杂交后代交配型的遗传,经KMnO_4处理引起的交配型变异以及F_1代可自孕单卵孢株有性生殖后代交配型的遗传与变异。聚碳膜间隔配对诱导A_1和A_2菌株自交产生的卵孢子经H_2O_2处理刺激萌发(萌发率12～16％)获得单卵孢株。交配型测定结果表明,A_1和A_2亲本自交S_1代单卵孢株均保持与亲本一致的交配型。用KMnO_4处理上述卵孢子导致A_1和A_2亲本的部分S_1代单卵孢株出现自孕现象,少数A_1亲本自交后代改变为A_2交配型;从A_1交配型亲本的S_1代可自孕菌株产生的卵孢子萌发所建立的单卵孢株中,同时获得A_1和A_2交配型菌株。上述结果不支持Sansome关于疫霉菌A_1、A_2交配型分别由纯合、杂合基因控制的假说,进一步证明了Ko关于交配型抑制因子控制交配型表达的假说的合理性。掘氏疫霉种内菌株直接配对产生的卵孢子用H_O_2刺激萌发获得F_1代单卵孢株。测定结果表明,在F_1代出现A_1、A_2、A_1A_2、A~04种交配型的单卵孢株,其比例因不同亲本组合而有较大差异。 F_1代出现的A_1A_2菌株自孕产生的卵孢子经H_2O_2处理刺激萌发建立自交系,观察到A_1A_2交配型在有性生殖后代发生分离,各交配型比例因亲本不同而异。A_1A_2菌株的自孕能力在单游动孢子无性系后代可稳定遗传,认为F_1代出现的A_1A_2个体来自亲本的杂交。A_1A_2单卵孢株保藏4～6个月后大多仍具自孕能力,少数改变为A_2交配型。