牛乳铁蛋白肽转基因小鼠的构建

目的:探讨牛乳铁蛋白肽在转基因鼠乳汁中的表达及其抑菌活性。方法:将实验室构建并保存的包含山羊β-酪蛋白基因启动子和牛乳铁蛋白肽基因的乳腺特异表达载体PI-bcp-LfcinB,用Xho I和Nru I双酶切,得到含有全部表达盒的显微注射DNA片段,采用常规显微注射技术获得转基因小鼠。并通过对泌乳期转基因雌鼠乳腺组织的RT-PCR检测,确定了牛乳铁蛋白肽在mRNA水平的表达,同时利用琼脂板扩散法检测了转基因鼠乳汁中表达产物的抑菌活性。结果:获得了牛乳铁蛋白肽转基因小鼠,且转基因小鼠乳汁中能够表达具有抑菌活性的牛乳铁蛋白肽。结论:通过转基因动物乳腺可以获得具有生物活性的牛乳铁蛋白肽,为进一步研究抗菌肽转基因牛、培育抗乳房炎奶牛新品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。     

负压封闭引流技术在腹部带蒂皮瓣供瓣区的应用

目的:探讨负压封闭引流(vaccumsealingdrainage,VSD)技术在腹部带蒂皮瓣供瓣区中的治疗作用。方法:10例上肢深度创面大小为9×6 cm-14×9 cm,创面清创后行腹部带蒂皮瓣移植,皮瓣面积10×7 cm-20×15 cm,供瓣区应用VSD覆盖,医用半透性贴膜封闭整个术区,连接中心负压,持续低负压吸引,每日外用1000 mL生理盐水持续冲洗VSD。约3周后行皮瓣断蒂术,供瓣区植皮。结果:10例皮瓣全部存活,1例患者术后当天引流区域出现疼痛,经止痛治疗后未再出现。1例患者术后2周出现VSD堵塞,经处理后恢复正常引流。无VSD装置更换病例。供瓣区周边皮肤无浸渍及感染现象,VSD撤除后见基底肉芽组织生长新鲜,创面均无感染,移植皮片存活。结论:VSD技术可以有效保护供瓣区,刺激肉芽生长,为后期皮片移植闭合创面提供了良好条件。VSD技术可安全有效的应用于腹部带蒂皮瓣供瓣区。     

鼠伤寒沙门氏菌诱导昆明小鼠肠道感染模型的建立

目的:建立鼠伤寒沙门氏菌诱导昆明小鼠肠道感染模型。方法:先用5 mg/mL链霉素预处理2 d,提高小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的敏感性,然后正常饲养1 d,攻毒前禁水禁食4 h,再分别以不同剂量灌胃攻毒2次,间隔24 h。观察小鼠临床症状,并通过组织病理切片、透射电镜和免疫组织化学的方法,分别观察小鼠肠道组织病理变化、小肠上皮细胞超微结构变化及肠道淋巴细胞增殖状况。结果:攻毒后昆明小鼠会出现昏睡、食欲不振、寒颤,甚至死亡的现象,解剖后发现小鼠肠道充血膨胀。组织病理切片显示小鼠肠粘膜受损,小肠绒毛肿胀,排列杂乱,炎性细胞浸润;透射电镜观察超微结构显示小肠上皮细胞线粒体空泡化,嵴和膜发生融合消失,粗面内质网发生扩张;免疫组织化学的方法显示肠道感染后,淋巴结肿大,T淋巴细胞大量增殖。结论:该模型对探索鼠伤寒沙门氏菌引发肠炎的发病机制、病理生理、免疫等方面作用具有重要意义,并为特异性卵黄抗体被动免疫保护效果的后续评价奠定基础。     

低硒小鼠模型的建立及低硒对心肌的影响

目的建立低硒实验动物模型,观察低硒对心肌的影响。方法利用黑龙江地产酵母配制低硒小鼠饲料,使用配制的小鼠饲料喂养BALB/c幼鼠,经过4个月的喂养,测定血清、肝脏、心肌细胞的硒含量,观察心肌超微结构的变化,测定血清心肌酶的变化。结果利用黑龙江地产酵母配制的低硒饲料,硒含量为0.016 mg/kg,符合低硒标准。BALB/c鼠用该饲料喂养4个月,心肌、肝脏、血清硒含量分别为0.187 mg/kg、0.219 mg/kg、0.241mg/kg,符合低硒诊断标准。观察低硒鼠心肌超微结构,可见心肌细胞线粒体肿胀,细胞核出现了异型性,血清心肌酶较常硒鼠升高。结论利用黑龙江地产酵母成功配制了低硒饲料。经过低硒饲料饲养可建立低硒鼠模型。低硒可以引起BALB/c鼠心肌细胞损伤。     

烧烫伤创面感染的小鼠模型构建

目的探讨一种简单、稳定的烧烫伤创面感染的小鼠模型构建方法,以便进行相关烧烫伤创面修复研究。方法取30只BALB/c小鼠,采用自制木质烫伤板,沸水浴法烫取直径8 mm的圆形创面,烫伤时间分别为5 s、10 s、15 s。伤后48 h,取创面组织进行HE染色观察,筛选最佳创面烫伤时间。另取72只小鼠制成深Ⅱ度烫伤创面,采用擦刮法分别接种20μL菌浓度为1×106、l×107、1×108CFU/mL金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923的菌液。接种细菌后72 h,取创面组织HE染色观察创面炎症反应情况,并测定3、7、14 d的皮肤菌负荷,筛选最佳的细菌接种浓度。最后,按最佳条件建模后,观察创面的完全愈合时间以及创面愈中、愈后的组织学变化,以确定此创面感染模型是否建立成功。结果组织学结果表明,10 s为深Ⅱ度创面的理想致伤时间,最佳接种菌浓度为l×108CFU/mL,此时期,14 d内菌负荷均高于l×105CFU/g。该模型的创面愈合时间(21±0.95 d)较正常创面愈合时间(15.92±0.34 d)明显延长(P<0.01),炎性反应明显,愈后不佳。结论烧烫伤创面感染的小鼠模型构建成功,可作为感染创面防治研究的实验动物模型。     

人轮状病毒感染昆明小鼠乳鼠模型的建立

目的建立人轮状病毒G3型709株感染4d龄昆明小鼠乳鼠模型。方法通过灌胃病毒的方式造模,观察乳鼠被病毒攻击后不同时间其临床表现、小肠组织病理改变、小肠组织上皮细胞超微结构改变。酶联免疫吸附法检测轮状病毒抗原在乳鼠粪便中的表达,免疫荧光法检测轮状病毒在乳鼠小肠组织中的表达。结果4d龄昆明小鼠乳鼠被轮状病毒攻击24h后出现腹泻表现和小肠组织病理改变,72h最严重,之后腹泻率下降,病理改变减轻,第7天腹泻停止,病理改变消失。乳鼠小肠上皮细胞出现糖、脂肪代谢紊乱,其粪便和小肠组织中都可以检测出轮状病毒抗原表达。结论4d龄昆明小鼠乳鼠被人轮状病毒A组G3型709株经口攻击后病毒能够在其体内复制,出现腹泻表现。该病毒感染腹泻过程具有自愈特点。     

利用无传染性耻垢分枝杆菌建立小鼠结核病模型的探索

目的:利用耻垢分枝杆菌(M.smegmatismc2155)建立C57BL/6小鼠结核病模型。方法:每天以高剂量(5×107CFU)耻垢分枝杆菌给C57BL/6小鼠腹腔注射,连续感染4周,检测耻垢分枝杆菌对小鼠的致病性。分别于2周和4周处死小鼠,无菌条件下解剖小鼠取肺、脾脏组织匀浆,进行组织内细菌活力检测;通过嗜酸性染色进行分枝杆菌的鉴定;同时进行病理切片的制备,观察肺和脾脏组织的病理变化;最后进行菌体DNA的提取和基因检测,根据上述指标确定小鼠结核病模型的建立是否成功。结果:腹腔感染小鼠2周后,模型组小鼠只有脾脏组织匀浆液出现抗酸染色阳性菌落,肺部组织未见阳性菌落。腹腔感染小鼠4周后,模型组小鼠肺、脾脏组织匀浆液中均可见大量抗酸染色阳性的菌落;组织病理学观察结果显示:小鼠肺组织主要表现为以中性粒细胞为主的炎性病变;基因检测结果表明:模型组小鼠肺组织匀浆液中可检测到耻垢分枝杆菌特异性3-磷酸甘油醛脱氢酶(gap)基因,而脾脏组织未扩增出耻垢分枝杆菌特异性基因。结论:通过腹腔注射无致病性耻垢分枝杆菌方法,成功建立C57BL/6小鼠结核病发生模型,为结核分枝杆菌与宿主相互作用研究提供安全的疾病模型。     

黏蛋白1基因敲除小鼠模型的构建

黏蛋白1(MUC1)属黏蛋白家族成员,分布于上皮细胞膜表面,由于在免疫炎症反应以及肿瘤发生中的重要作用而日益受到重视.为了进一步深入研究MUC1的生物学功能,构建了Muc1基因敲除小鼠模型.首先,根据小鼠Muc1基因组序列设计基因剔除策略,将2个loxP位点分别插在外显子2和3两侧,构建基因剔除载体Muc1-ABRLFn-pBR322.以电穿孔方法将载体导入胚胎干细胞(ES细胞),用G418和更昔洛韦进行正负筛选获得4个同源重组的ES细胞克隆.挑选其中一个阳性ES克隆行囊胚显微注射,获得16只嵌合率大于50%的雄鼠;其次,利用嵌合雄鼠与C57BL/6J野生型雌鼠交配后获得11只floxP杂合子小鼠(10雄1雌),通过杂合子小鼠回交,并进一步与EⅡa-Cre小鼠交配,最终成功得到Muc1全身敲除小鼠,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.初步表型观察未发现Muc1基因敲除相关器官组织结构的异常改变.本研究为MUC1的生物学功能的挖掘,尤其是MUC1在肿瘤发生转移中的作用机制的揭示提供了实验平台.     

组织特异RNAi转基因小鼠模型的构建

RNAi是一种行之有效的基因沉默的新方法,被广泛地应用于基因功能的研究、疾病的治疗以及新型疫苗的研制等领域.本研究通过原核显微注射干扰载体的方法制备转基因小鼠.选用皮肤组织特异表达的人源角蛋白14（K14）基因启动子（2000bp）作为表达载体启动子,成功地驱动融合表达载体EGFP-shRNA进行干扰片段前体的转录,进而生成成熟的干扰片段,靶向小鼠BMP4基因使其发生沉默.所得到的转基因小鼠及其杂交后代经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明外源基因准确无误地整合到小鼠基因组.Northern杂交结果证明,小干扰RNA在皮肤组织中有较高水平的表达,在肺和肠组织中有较低水平的表达.研究结果表明,利用PolⅡ型（K14）启动子驱动shRNA融合转录本的表达,在特定组织高表达siRNA,从而达到抑制特定组织目的基因表达的技术路线是可行的.同时为利用K14启动子进行毛囊相关基因干扰研究积累了基础数据,为制备组织特异抑制基因表达的转基因大家畜提供了一个参考方法.     

2型糖尿病小鼠模型构建的研究进展

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的病因主要在于细胞控制动态平衡能力的缺失,以及这些细胞所构成的组织或器官功能的失调。为了更好地研究和治疗2型糖尿病,人们借助不同动物模型去了解不同细胞、组织和器官的功能。在动物模型的选择上,小鼠因为其基因和表型能很好地模拟2型糖尿病而被广泛使用。2型糖尿病小鼠模型种类繁多,包括:自发突变性模型、热量过量性模型、外科和化学诱导性模型、常用转基因小鼠模型、专门用于研究环境对基因影响性的模型、CRISPR-Cas9构建模型以及特定的糖尿病肾病模型。本文就2型糖尿病现有的小鼠动物模型及其构建的方式给予简要综述,以期帮助广大科研工作者了解并更好地选择2型糖尿病小鼠实验模型。     

人sCD40L转基因小鼠模型的构建

目的研究阻断CD40-CD40L共刺激信号通路对移植皮肤免疫排斥反应的影响。方法通过RT-PCR技术克隆了呈可溶性表达的CD40L分子胞外区(sCD40L),利用K14启动子构建了sCD40L皮肤特异性表达载体,并利用该载体制备了转基因小鼠。结果所克隆的CD40L胞外区片段其大小及序列符合预期;以哺乳动物表达载体PCI为骨架,通过DNA重组,获得了含K14启动子和sCD40L编码区的皮肤特异性表达载体K14-sCD40L;通过显微注射和胚胎移植,PCR筛选检测:49只G0代小鼠有1只小鼠扩增出特异性条带,阴性对照无条带。结论成功建立sCD40L转基因阳性小鼠。     

血管内皮细胞条件性敲除Cx43杂合子小鼠模型建立及其血管功能变化的研究

目的 建立血管内皮细胞连接蛋白43(connexin 43, Cx43)条件性敲除小鼠模型,并对其血管舒张/收缩功能进行检测。方法 将8只Cx43^flox/flox 小鼠与C57BL/6品系野生型(wild type, WT)小鼠交配,子代小鼠继续与C57BL/6小鼠回交9代进行基因背景转换;再将Cx43^flox/+小鼠与血管内皮细胞特异性表达Tie2-Cre重组酶小鼠(以下简称Cre小鼠)交配,获得Tie2-Cre/Cx43^flox/+小鼠。利用鼠尾PCR试剂盒进行基因型鉴定,Western Blot法和免疫荧光法检测小鼠肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)中Cx43表达。利用离体张力测定技术检测SMA血管舒张/收缩功能,包括去甲肾上腺素诱导的收缩反应性和乙酰胆碱诱导的舒张反应性。结果 PCR电泳和血管蛋白表达检测结果证实Tie2-Cre/Cx43^flox/+小鼠成功构建,肠系膜上动脉中Cx43蛋白表达与野生型小鼠相比明显降低(P<0.01)。与WT...     

中华眼镜蛇咬伤导致局部组织坏死的猪模型构建

目的 通过广西巴马小香猪建立中华眼镜蛇咬伤导致局部组织坏死的动物模型. 方法 选择健康的广西巴马香猪12头,分为蛇毒组和对照组各6头,每头猪按照本课题组前期获得的半数致死量为剂量依据,蛇毒组以浓度5 mg/kg,剂量0.2 ml/kg于实验猪右后侧大腿肌肉注射,对照组注射等量生理盐水.注射蛇毒后观察实验猪的生物学行为和...     

一种新型人TNF表达质粒的构建及在大肠杆菌中的高表达

在详细分析TNF结构及前人有关TNF结构与功能关系研究的基础上,应用PCR技术构建了一种新型人肿瘤坏死因子(TNF)分子的编码基因,并将该编码基因插入表达质粒,转化大肠杆菌,通过温度诱导获得了高表达.活性测定的结果表明,新型人TNF对L929细胞的细胞毒活性较原型人TNF升高了10³数量级.     

小鼠脑缺血再灌注模型的构建及条件优化

目的:构建小鼠的脑缺血再灌注模型,并对其进行优化。方法:通过对线栓法缺血再灌注脑损伤模型的各个因素的对比实验,在线拴位置、线径、进线深度、小鼠种类等方面对该方法进行了优化改进。结果:造模后的脑片经TTC染色,梗死区域清晰;神经功能评分的体征明显。现有条件下构建的小鼠MCAO模型,成功率可以达到80%以上,成活率可以达到90%以上。与对照组相比,小鼠MCAO模型组血清SOD活性及MDA水平有显著变化(P0.01)。结论:经改进和优化,小鼠脑缺血再灌注模型的成功率和成活率大大提高且症状明显,对缺血缺氧性神经损伤研究具有一定的参考价值。     

家兔新型动脉粥样硬化狭窄模型的建立及其动态观察

目的　为血管成形术后再狭窄的研究提供非球囊扩张和动脉造影的简单易行的新型动脉粥样硬化斑块狭窄动物模型。方法　选择日本大耳白兔 18只 (含正常组 6只 ) ,用电刺激血栓形成仪刺激颈总动脉并在术后高脂饲料喂养 6周 ,模型分别于术后 3天、1周、3周、6周处死颈总动脉取材 ,常规病理切片行HE、弹力V G染色 ,光学显微镜观察病理变化。结果　术后 1周内动脉有血栓形成 ,内皮剥脱和部分内弹力板断裂 ,内皮细胞增生 ,中膜局部平滑肌细胞有少量水肿、消失 ,外膜有中性粒细胞浸润 ;术后 3周以上则内膜明显增生 ,内膜下脂质沉积 ,中膜平滑肌细胞核有轻度减少 ,纤维组织及基质增生 ,以损伤部位更明显 ,外膜刺激部位有轻度增厚。术后 6周 6只动物颈总动脉均形成管腔狭窄。结论　用电刺激加高脂饲料喂养的方法可成功建立动脉粥样硬化狭窄的动物模型 ;该模型的病理表现与人类动脉粥样硬化的病理过程相似 ,且避免了二次球囊造模法形成的血管盲端     

链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型的构建

目的:探讨建立理想糖尿病动物模型的方法。方法:A组采用空腹腹腔一次性注射65mg/kg1%链脲佐菌素(STZ)溶液的方法;B组采用空腹腹腔连续五天注射45mg/kg1%STZ溶液的方法,建立KM小鼠糖尿病模型。结果:建模1周后测血糖,A组平均血糖浓度为16.2mmol/L,死亡率为15%,成模率为55%;B组平均血糖浓度为20.2mmol/L,死亡率为20%,成模率为80%。持续观察一个月,A组血糖值始终在建模初期血糖水平上微弱波动,平均血糖浓度为14.4mmol/L,B组平均血糖浓度一个月后上升至24.8mmol/L,皆未见到复转。结论:采用空腹腹腔一次性注射65mg/kgSTZ溶液的方法复制出糖尿病模型,造模方法简便、用药量小,但成模率较低,血糖水平稳定性较弱;采用空腹腹腔连续五天注射45mg/kgSTZ溶液的方法复制出糖尿病模型,血糖浓度维持在较高水平,成模率高,死亡率较低,可应用于糖尿病及其并发症研究的各个领域。     

条件性敲除APC基因小鼠肠道腺瘤模型的构建

腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因是家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)的致病基因,APC基因的突变导致小鼠多处产生肿瘤,但肠道条件性敲除APC基因后,小鼠的表型并不清楚。该研究利用Cre-LoxP重组酶系统,在肠道绒毛和隐窝上皮细胞条件性敲除APC基因,并对小鼠表型进行鉴定和分析。将Villin Cre小鼠和APC~(fl/fl)小鼠合笼得到Villin Cre;APC~(fl/+)小鼠;有意思的是后者进一步与APC~(fl/fl)小鼠合笼,却没有得到Villin Cre;APC~(fl/fl)小鼠。进一步解剖Villin Cre;APC~(fl/+)小鼠,发现其自发产生肠道肿瘤,并能携瘤生存,免疫组化显示瘤体组织激活了Wnt信号通路。结果表明成功地构建了小鼠肠道条件性敲除APC基因腺瘤模型,为进一步研究APC基因在肠道发育以及肠道肿瘤的作用提供了优良的工具。     

数字化血管三维模型对烧伤患者面部修复术术后皮瓣存活的影响

目的:探讨数字化血管三维模型对烧伤患者面部修复术术后皮瓣存活的影响。方法:选择2012年4月至2017年4月在我院接受组织瓣转移面部修复术的烧伤患者146例,分为对照组(n=64)和研究组(n=82)。对照组术前采用超声多普勒探测患者供区皮瓣的血管位置,走向并标记探测结果,根据多普勒探测结果结合术前设计行皮瓣转移术。观察组术前3~5 d采用CTA技术检查患者供区皮瓣面部受区血管位置、血管走向等,将检查结果通过计算机进行血管三维重建,根据皮瓣血管与受区血管重建模型修订手术方案后行皮瓣转移术。观察和比较手术时间、术后感染发生率、皮瓣断蒂时间、皮瓣血运障碍发生率和术后皮瓣坏死率。结果:研究组手术时间显著短于对照组(P0.01),两组术后感染发生率分别为7.81%和1.21%,研究组明显低于对照组(P0.01)。研究组的皮瓣断蒂时间为17.1±2.5 d,明显短于对照组(21.3±2.8 d,P0.01);对照组皮瓣血运障碍发生率为17.19%,研究组并未发现血运障碍病例。对照组术后皮瓣坏死率为7.81%,而研究组未出现皮瓣坏死病例,存活率为100%,明显高于对照组(P0.05)。结论:术前数字化血管三维模型的建立用于烧伤患者面部修复术可缩短手术时间,提高手术效率,降低术后皮瓣供血障碍的发生率及皮瓣死亡率,有利于患者术后恢复。     

转基因人源化ACE2裸小鼠模型的建立

目的 建立BALB/c-Nude裸小鼠为背景的人源化ACE2(hACE2)转基因裸小鼠动物模型。方法 利用hACE2转基因小鼠与雄性BALB/c-Nude裸小鼠杂交获得F1代,将F1代hACE2小鼠与BALB/c-Nude裸小鼠回交获得F2代,再将F2代hACE2小鼠互交获得F3代hACE2转基因裸小鼠。对F3代中hACE2转基因裸小鼠的生长发育、生理指标及免疫指标与C57BL/6J野生型小鼠、hACE2小鼠和BALB/c-Nude裸小鼠对比分析。结果 (1)hACE2转基因裸小鼠生长发育指标与C57BL/6J野生型小鼠、hACE2小鼠和BALB/c-Nude裸小鼠无明显差异。(2)hACE2转基因裸小鼠生理指标中,建立的hACE2转基因裸小鼠与BALB/c-Nude裸小鼠相似,病理解剖观察发现,小鼠体内均无胸腺。脏器系数结果与BALB/c-Nude裸小鼠比较,脾系数和肝系数出现显著性差异(P<0.05)。血常规检测指标与C57BL/6J野生型小鼠、hACE2小鼠比较,中性粒细胞百分比(NEU)、淋巴细胞百分比(LYM)和单核细胞百分比(MONO)均出现显著性差异(P<0....