地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)突变株的生化互补和力复霉素生物合成途径的研究——Ⅱ.力复霉素的生化互补图

用琼脂块转化的交叉互补方法以及液体共合成的初筛和复筛,将69株力复霉素产生菌,地中海诺卡氏菌的非活性突变株(rjf~-)分为五个类群,即类群Ⅰ至类群Ⅴ。根据供体菌与受体菌生化互补共合成力复霉素的特性,初步制出了力复霉素的生化互补图,为提取和研究力复霉素生物合成的中间产物,阐明力复霉素的生物合成途径打下了基础。     

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)突变株的生化互补和力复霉素合成途径的研究——(Ⅰ)力复霉素生化互补突变株的筛选

本文报导了由力复霉素产生菌,地中海诺卡氏菌诱变得到的非活性突变株,经共合成方法由6株非活性突变株配成8对有共合成能力的生化互补菌株,并证明互补菌株共合成产生力复霉素并不是由于酶的作用,而是由于一株非活性突变株产生一种力复霉素合成途径的中间产物,经另一非活性突变株转化为力复霉素。前者为供体菌,后者为受体菌或转化菌,供体菌在力复霉素生物合成途径上经突变而引起的阻断部位必然在受体菌的后面。 五株突变株生化互补的产物具有生物活性,并经紫外和可见光吸收光谱的测定,证明是属于力复霉素一类环桥抗菌素。     

红霉素链霉菌无活性突变株原生质体融合的研究

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株L156和生产菌株LDC2经诱变剂处理,得到了5个无活性突变株.用琼脂条法进行了共合成的互补测定,发现它们分属于3个不同类群,并初步确定了它们在红霉素合成代谢路线上发生障碍的前后顺序。我们选择了无活性突变株L156—19Em-和LDC2-4,Em-做新本,进行原生质体融合.通过溶菌酶处理时间与原生质体释放数量间关系的列比试验,不同培养基与原生质体再生频率关系的对比试验,和用琼脂块法检出融合体的试验,发现在30℃温溶中溶菌酶处理1小时即可达到最高的原生质体释放量。不同的再生培养基对于原生质体再生频率有较大影响,其中R2L培养基效果最好,其再生频率可达36％,不加特殊成份的一般斜面培养基(ZL培养基)也可以作原生质体再生,只是再生频率较低(1.2％)。用琼脂块法检出融合体是切实可行的,融合频率为1.6％。     

质粒在红霉素产生菌NRRL 2338中的可能作用

用溴化乙啶或吖啶橙等诱变剂处理红霉素产生菌Str. Erythreus NRRL 2338原株得到了八株无活性变株,运用在固体或液体培养基上共合成的方法,对它们在红霉素生物合成的阻断部位进行了分类,对这些变株所积累的中间物,用薄层层析的方法进行了分析研究,发现有一株变株失去了质粒,不产生气生菌丝及孢子,对红霉素敏感,对这些变株的遗传学及质粒特征的研究表明,质粒可能参与红霉菌的孢于形成及色素产生,并可能与红霉素生物合成的某些阶段有关。     

红霉素链霉菌的溶源转换研究

2-62菌株是一溶源性菌株,合成红霉素能力稳定,气生菌丝生长良好。经42℃培养后筛选得到的4株无活性菌株(Em-)便不再释放噬菌体,成为去溶源菌株,并对P4噬菌体敏感。当此菌株再次溶源化后,又恢复了合成红霉素的能力,表明p4噬菌体与红霉素产生密切相关。 经诱变获得的1-9及10-25Em-菌株,气生菌丝生长受抑制,呈光秃型,经连续传代20次仍保持菌落类型纯一。当1-9及10-25菌株成为1-9(P4)及10-25(P4)时,选择恢复气生菌丝生长的菌落用琼脂块法测定,均获得产生红霉素的性能,并都释放噬菌体。说明P4噬菌体具有溶源转换的性能,它与红霉素的生物合成及气生菌丝的形成等性状相关。     

青海盐碱环境中具抗肿瘤活性放线菌的筛选和多样性研究

从我国青海省采集盐碱土样或泥样,用添加1.0~3.0mol/L NaCl的GPY琼脂培养基和ISP2琼脂培养基分离到145株典型放线菌菌株。采用6种肿瘤细胞株对分离菌株的发酵产物进行体外筛选,得到26株抗肿瘤活性阳性菌株(17.9%),19株为拟诺卡氏属(Nocardiopsis)菌株,7株为链霉菌属(Streptomyces)菌株。在抗肿瘤活性、形态特征、生理生化特性和全细胞水解物氨基酸组分分析等实验结果的基础上,选取差异较大的8株抗肿瘤活性阳性菌株进行16S rRNA基因序列测定和系统发育多样性分析。结果表明,2株属于链霉菌属(Streptomyces)的1个已知物种和1个潜在新种;6株属于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),可能代表该属的4个新种。研究表明青海盐碱环境中存在产生抗肿瘤活性物质的重要放线菌资源,也提示其中蕴藏着较丰富的微生物多样性。     

柔红霉素产生菌SIPI-1482中dnmV基因功能的阻断及恢复

dnmV基因产物为柔红霉素生物合成途径中TDP-6-脱氧己糖C4酮基还原酶,破坏该基因能阻断柔红糖胺的合成,进而阻断柔红霉素的产生。从天蓝淡红链霉菌(S. coeruleorubidus)SIPI-1482基因组DNA中经PCR扩增出dnmV及其上游dnmU基因片段,并由此构建了用于阻断dnmV基因的同源重组质粒pYG817,转化SIPI-1482菌株后成功地破坏了dnmV基因,发酵结果显示阻断突变株不再代谢产生柔红霉素,为引入新的基因来改变代谢产物的糖基结构打下了基础。通过导入dnmV基因表达质粒可重建该突变株的生物合成途径,恢复产生柔红霉素,但产量比出发菌株要低。     

2株具抗菌活性的稀有放线菌的筛选和鉴定

从药用植物根际土壤样品中分离得到了一批放线菌菌株,通过对其进行了抗茵活性筛选,发现菌株45725具有较好的抗耻垢分枝杆菌活性,菌株06-2230具有较强的抗绿脓杆菌活性。菌株45725和06-2230在酵母-麦芽膏琼脂（ISP2）、燕麦琼脂（ISP3）、无机盐淀粉琼脂培养基（ISP4）、葡萄糖天冬素琼脂培养基（ISP5）和马铃薯培养基（PDA）上生长良好,基生菌丝丰富,无气生菌丝。2株菌的最适生长温度为28℃,最适生长pH值7．0～7．5。综合2株菌的形态学、生理生化、细胞化学分类特征和基于16SrRNA基因序列的系统发育分析和DNA—DNA杂交结果,菌株45725和06—2230分别是多形态放线菌属的2个不同种。     

春兰内生真菌的分离及其抑菌活性的初步研究

采用平板分离法从皖西大别山野生兰花的根、茎、叶中分离内生真菌32株,用琼脂块法对获取的菌株进行抑菌活性筛选,其中有4种兰花内生真菌对供试菌株有抑菌作用,占总分离菌株的12.50%,对抑菌活性较强的一株内生真菌进行形态学鉴定,结果表明它属于无孢类群。     

丹参植株内生菌的分离纯化及其抗病性研究

为探明丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)内生菌的种类,筛选拮抗农作物病害菌的生防菌株,从健康丹参植株中进行内生菌分离,依照形态特征以及16SrDNA序列对菌株进行初步分类鉴定,采用琼脂块法进行拮抗菌株筛选,并选取拮抗活性较强的菌株液体发酵进行体外抑菌试验。结果表明:(1)从丹参植株中共分离得到69株内生菌(真菌62株、放线菌7株),其中23株内生真菌属于无孢类群或现有条件不适合产孢,其余真菌菌株中串珠镰孢菌属(Fusarium moniliforme Sheld.)和交链孢菌属(Alternaria sp)为优势菌群;7株内生放线菌均为链霉菌属。(2)病原菌拮抗性实验表明,有44株内生菌对病原菌具有不同程度的拮抗活性,其中12株内生菌对2种及以上靶标病原菌具有拮抗活性,表明丹参内生菌具有一定的广谱抗菌性。(3)放线菌菌株A232的次级代谢产物对白色假丝酵母(Canidia albicans)和苹果腐烂菌(Valsa mali)都表现出较强的拮抗活性,通过形态、培养特征以及16SrDNA序列分析,鉴定其为Streptomyces luteoverticillatus。     

用紫外线和耐柔红霉素及其复合诱变一株天兰淡红链霉菌HM1482

柔红霉素是半合成表阿霉素等低毒高效抗癌药物的重要原料。用紫外线和耐柔红霉素及其复合诱变柔红霉素产生菌—天兰淡红链霉菌ＨＭ1 4 82的诱变效果 ,曾获一株高产诱变株 1 4 82 -77,在生产罐中应用 ,其柔红霉素产率较出发菌株提高 1 2 2 .6%。材料与方法 :①斜面与分离平皿培养基主要成份为可溶性淀粉、天冬素、Ｋ2 ＨＰＯ4 和琼脂等。②种子与发酵培养基主要成份为玉米粉、黄豆粉、葡萄糖、碳酸钙及微量(ＮＨ4 ) 2 ＳＯ4 、Ｋ2 ＨＰＯ4 等。产率 (效价 )测定采用ＴＬＣ、ＨＰＬＣ ,主要实验数据见表 1。　　　表 1　　产率测定数据表　　…     

硇洲岛褐蓝子鱼肠道抗菌活性菌株的分离及多样性

【目的】了解广东湛江硇洲岛褐蓝子鱼(Siganus fuscescen)肠道抗菌物质产生菌的多样性。【方法】采用传统的分离方法与牛津杯扩散法对褐蓝子鱼肠道菌进行分离纯化与抗菌活性测定,运用16S rRNA基因序列的系统发育分析对抗菌活性菌株进行多样性分析。【结果】根据形态观察和部分生理生化实验去冗余,从褐蓝子鱼肠道样品中分离到68株细菌,其中抗菌活性菌株19株,占分离株的27.9%。19株不同种类的活性菌株分属于细菌域的放线杆菌门(Actinobacteria)、变形杆菌门(Proteobacteria)与厚壁菌门(Firmicutes)的11个科、12个属。多数菌株属于厚壁菌门(8株,42.1%),其次是变形杆菌门(7株,36.8%)和放线杆菌门(4株,21.1%)。大多数抗菌活性菌株与其系统发育关系最密切的已知典型菌株之间存在一定的遗传差异(16S rRNA基因序列相似性为96.2%-99.9%),其中有4株代表潜在的新种。【结论】广东湛江硇洲岛褐蓝子鱼肠道中存在较为丰富的细菌抗菌物质产生菌,并蕴藏着较多的微生物新类群。     

陕西太白尾矿区根瘤菌多样性及抗性菌株筛选

以研究陕西太白金矿尾矿区根瘤菌的资源多样性和重金属、苯酚抗逆性菌株的筛选为目的,选取分离自尾矿废弃地及太白河边的8种豆科植物的108株根瘤菌及42株参比菌株,进行了生长温度范围,唯一碳源、氮源利用,生长初始pH,耐盐性,重金属和苯酚的抗性等151项表型性状分析。结果表明,供试根瘤菌的表型特性存在明显差异,在85%的相似水平上供试菌株聚成5个类群,其中类群I有26株菌,主要分离自天蓝苜蓿(Medicago lu-pulina);类群Ⅱ有12株菌,其寄主各不同;类群Ⅲ有3株菌,寄主均为金翼黄芪(Astragalus chrysopterus);类群Ⅳ有40株菌,主要分离自金翼黄芪;类群Ⅴ有4株菌,寄主均为截叶铁扫帚(Lespedeza cuneata)。类群Ⅳ与已知种R.mongolense聚在一起,其这4个类群未与参比菌株聚在一起,可能是新的表观群,其分类地位需进一步确定。一些菌株表现了较强的抗重金属和苯酚毒性的能力,其中1株菌能耐受0.15 mmol/L的Hg2 ,4株菌能耐受0.4mmol/L的Cu2 ,3株菌能耐受1.6 mmol/L的Zn2 ,5株菌能耐受900 mg/L的苯酚。     

盐地碱蓬内生中度嗜盐菌的分离与系统发育多样性分析

为了了解东营滨海盐地碱蓬植株内生中度嗜盐菌的多样性,采用传统分离鉴定技术和基于16S rRNA序列分析对样品中可培养细菌的多样性进行研究。根据其生理生化特征、16S rRNA序列测定和系统发育分析,分离获得的15株内生菌可分为4个类群,涉及Halomonadaceae科的Chromohalobacter属、Kushneria属、Halomonas属以及Bacillaceae科的Bacillus属。类群I中4菌株的16S rRNA序列与Chromohalobacter israelensis的最高相似性为95%。类群II共7株菌,归属于Kushneria属,是碱蓬内生中度嗜盐菌中的优势类群。类群III菌株的16S rRNA序列与一株尚无明确分类地位的Gammaproteobacteria亚门耐盐固氮细菌Haererehalobacter sp.JG11的相似性为99%。类群IV中的芽孢杆菌的16S rRNA序列与已知细菌的相似性为96%,很可能代表了Bacillus属的新种。各种水解酶类的分析表明,在分离的15株菌中有3株菌产蛋白酶,14株产酯酶,8株产DNA酶,11株产半乳糖苷酶,14株产脲酶。研究结果揭示,盐地碱蓬中存在较为丰富的中度嗜盐菌多样性和系统发育多样性,并且潜藏着较多的新的微生物类群。     

怀地黄活性内生菌的分离鉴定及抗菌抗肿瘤活性

利用平板分离法从怀地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)中分离出内生菌共130株,包括67株细菌、50株真菌和13株放线菌。利用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉作为供试菌株,通过对峙试验和平板点接法筛选出8株对3种供试菌株均具有较强拮抗作用的内生菌。经菌种形态观察、生理生化实验以及16S rRNA序列测定,这8株活性内生菌均为假单胞菌属的细菌,并分别与Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas thivervalensis、Pseudomonas chlororaphis、Pseudomonas koreensis和一个未定种具有最高相似性。对这8株活性内生菌进行液体发酵、不同有机溶剂抽提和抗菌抗肿瘤研究,结果表明它们的乙醇抽提物和乙酸乙酯抽提物均不同程度地对3种供试菌株和食管癌细胞系Ec9706具有抑制作用。其中2-2号菌株(Pseudomonas chlororaphis)抗菌抗肿瘤作用最强,具有重要的开发价值。     

海南近海30株抗B16细胞活性放线菌的16S rDNA多样性分析

从海南近海 ,包括文昌红树林、海口红树林以及洋浦港等地采集样品 ,经苯酚、SDS、加热等预处理 ,稀释涂布麦芽汁_酵母膏琼脂 (YE)、淀粉酪素琼脂 (SC)、葡萄糖天冬氨酸琼脂 (GA) ,或者直接将样品稀释涂布加有重铬酸钾的高氏一号琼脂 (Gause)和麦芽汁_酵母膏琼脂等进行平板分离。共获得 35 4株放线菌 ,其中有 76株具有不同程度的抗B16细胞毒活性。比较发现加热预处理法和重铬酸钾选择培养法对于广泛分离筛选抗肿瘤活性放线菌不失为一种快速、简便、行之有效的方法。YE、Gause培养基无论在分离到的放线菌总数 ,还是细胞毒活性菌株的比例上都显示了良好的效果。对 30株具有较强抗B16细胞活性的链霉菌进行了扩增性 16SrDNA限制性酶切片段多样性分析 (16SARDRA) ,表明这 30株链霉菌之间有较大的基因差异性。 0 5 0 6 4 2、0 6 0 386和 0 6 0 5 2 4等 3株菌序列分析进一步证明这 3株菌属于链霉菌属 ,其中菌株 0 5 0 6 4 2与其亲缘关系最近的Streptomycescattleya的相似性仅为 95 % ,因此可能是一个新种。     

贪婪倔海绵中抗菌活性细菌的筛选及初步鉴定

采用平板涂布法从我国南海三亚周边海域贪婪倔海绵（Dysidea avara）中分离海绵共附生细菌,采用金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母、宛氏拟青霉、黑曲霉7种指标菌进行抑菌试验筛选抗菌活性菌,同时对于得到的活性菌进行生理生化鉴定。共分离获得个149个细菌菌株,发现20株具有抑制真菌和革兰氏阳性细菌的活性,占细菌总数的13．4％。经过细菌形态观察和生理生化试验,发现此20株活性菌属于革兰氏阳性芽孢杆菌属（Bacillus sp．）。     

双歧杆菌的数值分类及代表性菌株同源性的分析

对不同来源的55株双歧杆菌进行了数值分类研究。这些菌包括13株参照菌株和42株新分离物。在这些菌株中19株来源于人体,25株来自动物源,11株分离自污水。有的菌株是从未曾报道过的动物来源分离到的。通过数值分析比较了75项性状（形态、生理生化和对抗生素敏感性等）,以不加权平均链锁聚类的方式进行族群归类。在70％Sm水平上划分成5个聚类群和12个亚群。对这些聚类群菌株间的关系进行了分析。在数值分类树状图谱的簇群归类中,人和动物来源的菌株基本上彼此分开,而分离自污水的菌株穿插在人或动物来源的聚类群中。在数值分类的基础上对各聚类群中的一些菌株的DNA中G＋Cmol％进行了测定。依据16SrRNA可变区序列的分析,以PCR方法合成的生物素标记探针,对某些代表性菌株的DNA片段同源性进行了分析．同种的菌株间与不同种菌株间的同源性显示有差别。     

红霉素生物合成的生物化学和基因学

从基因重组技术问世以来,对红霉素(大环内酯类抗生素)生物合成的生物化学和基因学的研究到目前已经累积了大量的研究结果。就这2个领域中对红霉素生物合成的研究历史、研究现状和研究前景(组合生物合成)作以简要的介绍。     

尼泊尔马桑根瘤内生菌纯培养物的质粒检测

采用胶内裂解法快速检测了21株马桑根瘤内生菌纯培养物和4株弗兰克氏菌参考菌株的质粒,其中有5株马桑分离菌株和1株参考菌株含有质粒。除马桑菌株和参考菌株各有1株携带2个质粒外,其它菌株均只含有1个质粒。这些质粒的分子量约为13～20kb。根据所含质粒的大小和数目,将21株马桑分离菌株划分成4个质粒类群。实验还对菌丝体生长,细胞酶解和裂解等条件对质粒检测效果的影响进行了探讨。