一种测定SOD活力的新方法——碱性二甲基亚砜-鲁米诺化学发光法

本文介绍一种测定SOD(超氧化物歧化酶)活力的新的碱性二甲基亚砜——鲁米诺化学发光法。用碱性二甲基亚砜作为产生O₂^-_·体系,用鲁米诺作为指示O₂^-_·的化学发光剂,观察了不同浓度的NaOH、鲁米诺、pH、碱性二甲基亚砜加入量、测定时间及心绿染料对此法的影响。测定了山羊烟雾吸入伤后SOD活力和肺淋巴SOD清除量的变化。结果证明,本法灵敏度高、特异性强、操作简便、方法稳定,可快速、重复测定粗提取生物样品的SOD活力。     

甜荞品质与生态因子和农艺性状的相关性研究初报

试验研究了8个甜荞品种在全国19个不同地点的籽粒品质(黄酮和蛋白质含量)变化以及品质和产量与生态因子和农艺性状之间的相关性。结果表明:不同品种间及同一品种不同地点间甜荞籽粒黄酮、蛋白质含量均存在显著变异。黄酮含量与海拔、生育期平均温度,以及蛋白质含量与纬度,甜荞产量与株高、单株粒数、单株粒重均呈显著相关,相关系数分别为0.271^*、0.588^**、0.495^**、0.270^*、-0.330^**、0.212^*。通径分析显示,单株粒数是产量的主要因素,单株粒数多有助于提高产量; 生育期均温是黄酮含量的主要因素,荞麦生育期间均温适当偏低利于黄酮积累; 纬度是蛋白质含量的主要因素,选择纬度较高地区有助提高蛋白质含量。研究还发现不同品种对生态因子的敏感性不同。 关键词: 甜荞; 产量; 黄酮含量; 蛋白质含量; 相关分析; 生态因子; 农艺性状     

TRPO-AOT 反胶团体系萃取牛血红蛋白的研究

反胶团是表面活性剂溶解在非极性溶剂中形成的、围绕一个“水核”的纳米级聚集体。液液反胶团萃取蛋白质技术,因对目标物质选择性好、容量大和能保持其活性而得到广泛研究^[1-9].在反胶团萃取蛋白质的研究中,多数作者采用单一表面活性剂AOT^[2]或季胺盐^[3]的反胶团体系。两种体系的共同弱点是:体系受离子强度、pH值等静电因素的影响大,直接影响萃取率,为了克服它们的不足,有人在AOT体系中加亲和试剂增强反胶团对蛋白质的亲和性^[4],加磷酸类阴离子表面活性剂^[5]、天然表面活性剂磷脂^[6]等以增强体系的萃取性能e人在季胺盐的反胶团体系中加非离子表面活性剂作助剂提高蛋白质的萃取率^[7],有人则反阴、阳和非离子表面活性剂混合形成反胶团提高某种酶的萃取容量^[8],本文用中性磷氧萃取剂三烷基氧膦（TRPO）与阴离子表面活性剂琥珀二辛酯磺酸钠（AOT）混合溶解在异辛烷中形成反胶团萃取牛血红蛋白（BHb）,比较AOT、TRPO及AOT三体系对牛血红蛋白（BHb）的萃取性能。     

蛋白质溶液NMR结构测定的一些新进展

新的标记技术的进展和采用稀释的液晶作为溶剂以提供额外的结构信息,提高了核磁共振技术测定蛋白质溶液三维结构的精度,扩大了分子质量测定范围.目前已经利用多维 ¹⁵N,¹³C,²H标记NMR测定了许多分子质量为30 ku左右的蛋白质溶液结构,这一上限可能还会被进一步提高.     

钙离子通道A23187对血小板聚集和蛋白质磷酸化的影响

以 ³²P-Na₂HPO₄标记猪血小板,在阿斯匹林阻断花生四烯酸代谢,Apyrase去除分泌的ADP情况下,以A23187和PMA为血小板激动剂,staurosporine为PKC抑制剂,研究Ca²⁺和蛋白激酶C在血小板聚集中的作用.结果表明,a.A23187在1～20 μmol/L引起血小板聚集,相应地,明显地引起40 ku、20 ku蛋白质磷酸化,且存在剂量和时间效应关系.b.A23187和PMA在血小板聚集和蛋白质磷酸化上都存在着协同效应.c.1 μmol/L staurosporine可大部分抑制20 μmol/L A23187诱导的血小板聚集和20 ku、40 ku蛋白质磷酸化.结果提示,Ca²⁺激活血小板是建立在激活PKC的基础上,Ca²⁺通过激活PKC诱导血小板聚集,这是Ca²⁺激活血小板的主要途径.     

固相时间分辨荧光免疫螯合剂 BCPDA 的制备及其标记技术

报道了固相时间分辨荧光免疫螫合剂4,7-二氯磺基苯-1,10-菲罗啉-2,9-二羧酸(BCPDA)的制备方法,BCPDA 标记蛋白质及螫合 Eu³⁺方法,BCPDA-Eu³⁺标记物荧光光谱研究以及固相时间分辨荧光免疫分析法检测甲胎蛋白异质体(AFP-R-LCA)方法的建立.结果表明 BCPDA 能在温合条件下与蛋白质氨基结合并与 Eu³⁺螯合,BCPDA-Eu³⁺蛋白质标记物荧光特性、标记比度、生物结合活性与国外同类产品一致,所建立的检测 AFP-R-LCA 免疫分析法最小检测值0.6ng/ml,为提高我国非放射性同位素标记技术水平奠定了基础.     

拟南芥中PAP特异磷酸酶(AtAHL)的折叠识别与结构预测

通过现有的序列同源性比较、二级结构预测、三维结构预测和模拟方法,得到了拟南芥中PAP特异磷酸酶的三维结构.这是一种与酵母中的Hal2p蛋白质类似,并且N端为α＋β,C端为α/β结构域的多结构域蛋白质.分析预测所得结构,发现了Mg²⁺等金属离子的结合位点,推测了对Na⁺敏感的结构基础.这些结合位点与其生化功能相关.而且,通过结构与功能分析,讨论了蛋白质数据库(PDB)中同一个酶已有理论结构的不合理性.     

一种简易的免疫PCR方法的建立

免疫PCR为一种高敏感度检测抗原的新技术,操作程序大多沿袭ELISA方法.用戊二醛作连接剂,将蛋白质高效率包被在普通PCR管内壁,使免疫及PCR反应用普通PCR仪得以在管中连贯地进行.实验结果表明,标准曲线的线性关系好,与ELISA方法比较敏感度高出约10⁵.这一改良法的建立,可望促进免疫PCR的普及应用.     

氨基酸的微型双向薄层色谱快速分析

采用自制微晶纤维素—硅胶G(或H)混合固定相微型薄膜(5×5cm)双向色谱分离了标准氨基酸混合液、蛋白质水解物、去蛋白质血浆和新鲜尿液中的氨基酸,效果良好。双向色谱展开时间共只约1小时,绝大部分氨基酸分析灵敏度为10^-10—19^-11mol。     

FS36作为新型人源Hsp90抑制剂的发现

热休克蛋白90(Hsp90)通过对几百种蛋白质底物(客户蛋白质)进行合理的折叠、成熟其构象并且激活,在肿瘤细胞的生长和繁殖中发挥重要作用．因此,Hsp90成为非常有吸引力、有前途的抗肿瘤药物靶点,并且超过20种抑制剂已经进入临床实验阶段．我们在这里设计并合成了一个小分子抑制剂：FS36．收集了Hsp90^N-FS36复合物晶体结构的X射线衍射实验数据．高分辨率X射线晶体结构表明,FS36在ATP结合位点上与Hsp90^N相互作用,并且FS36可能替代核苷酸与Hsp90^N结合．FS36和Hsp90^N的复合物晶体结构和相互作用为后期设计和优化新型抗肿瘤药物奠定基础．     

猪脑突触体质膜(Ca2+-Mg2+)-ATPase的分离纯化与性质

以猪脑为材料,经匀浆、差速离心、蔗糖密度梯度离心分离突触体. 低渗破膜得到突触体膜. Triton X-100增溶后,经钙调蛋白亲和层析可得去脂的质膜Ca²⁺-ATPase. 用大体积亲和柱和大体积低Ca²⁺淋洗液淋洗,可得产率、纯度和活性均较高的质膜Ca²⁺-ATPase. 与大豆磷脂保温后,去脂的Ca²⁺-ATPase的水解活力可恢复达3.32 μmol/(mg·min).SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显示单一蛋白质带,分子质量约为140 ku,纯度在90%以上. 不同Ca²⁺浓度明显影响酶的活力.     

大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展

二硫键形成蛋白A（Disulfide bond formation protein A,DsbA）是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。综述了DsbA三维结构、进化过程、协助蛋白质体内外复性方面的研究进展。DsbA比硫氧还原蛋白具有更强的氧化性,其强氧化性来自于Cys³⁰残基异常低的pKa值和不稳定的氧化型结构,通过定点突变的研究表明了Cys³⁰残基是DsbA活性中心最关键的氨基酸残基之一。DsbA不论在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加,都能有效地催化蛋白质的折叠复性,同时DsbA还具有部分分子伴侣的活性。     

pH-比色法测定CaATPase活力

基于ATP被酶水解后H⁺生成的速度作为酶活力的指标,在560um波长和pH7.4,以酚红作指示剂,建立了pH-比色测定肌浆网CaATPase(Ca²⁺,Mg²⁺-ATPase)活力的分光光度法。方法简易,可观察反应进行的过程。SR CaATPase对底物ATP的K_m=97.4μmol/L;在22—42℃间求得活化能(E_Ca)=20.40千卡。用本法初步观察了汉防己甲素(简称汉甲)对酶的抑制作用。     

固定化镍离子亲和层析胶的制备及其性能鉴定

以Sepharose 6B为原料,在强碱性条件下用环氧氯丙烷活化,再与亚氨基二乙酸（IDA）的钠盐溶液反应,在活化好的胶颗粒表面接上很多手臂IDA;最后与硫酸镍溶液反应,使手臂IDA与Ni²⁺发生螯合反应,即得到固定化Ni²⁺亲和层析胶（Ni²⁺-IDA）.采用原子吸收法及从大肠杆菌表达产物中纯化重组人B淋巴细胞刺激因子（hBLyS）等方法检测制备胶的理化指标和纯化蛋白质的性能.结果表明用此法制得的亲和胶与相应商品胶的性能完全一致,而成本却不到商品胶的十分之一.     

江浙蝮蛇神经生长因子在大肠杆菌中的表达及纯化*

将江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas,A.h.P)神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)基因克隆于分泌型原核表选载体pET-22b⁺,以c端融合了6个组氨酸的形式在大肠杆菌B12l(DE3)中进行了IPTG诱导表达。SDSPAGE分析确定有一比理论值略大的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白质的20％左右,且表达蛋白质主要是以包涵体的形式存在。用6mol／L的盐酸胍溶解包涵体后,利用固定化金属离子(Ni²⁺)配体亲和层析一步纯化目的蛋白质,纯度可达80％左右。对该重组肽进行变复性研究。利用PCl2细胞进行生物活力测定,证明表达产物具有NGF生物活力。     

人促红细胞生成素基因的合成及在大肠杆菌中的表达

人促红细胞生成素(简称hEPO)是一种能够促进祖红细胞分化发育并进而促进红细胞生成的细胞生长因子,它在临床上可用以治疗某些贫血病人特别是由于慢性肾衰所引起的肾性贫血^〔1－3〕．hEPO是一种由166个氨基酸组成的糖基化蛋白质．它的前体还带有27个氨基酸的信号肽^〔4－6〕。有两对由Cys7-Cys161和Cys29－Cys33组成的二硫键,其糖基化位点为Ash--24。Ash一38．Asn一83和Ser一126^〔7－8〕。由于天然来源hEPO的量极少．因此通过基因工程的手段是当前获得大量hEPO的较好的途径^〔9－10〕。我们在前文中曾经报道用单链方法合成天花粉胰蛋白酶抑制荆基因〔11〕以及用单链和PCR相结合来合成绿豆胰蛋白酶抑制荆基因的方法〔12〕．我们在合成hEPO基固(包括带有信号肽的hEPO基因)时也采用了这两种方法：合成的hEPO基因在大脑杆菌、CHO细胞和昆虫细胞中均得到表达。本文报道hEPO基因的合成及在大肠杆菌中的表达结果。     

大豆液泡膜H+-ATPase功能与构象关系的初步研究

大豆液泡膜V型H⁺-ATPase是ATPases中的一种,它在植物细胞的生长发育中有重要的作用.利用竹红菌乙素(HB）和KI这两种分别猝灭蛋白质疏水区域内源荧光和亲水区域内源荧光的荧光猝灭剂,在不同pH值、温度条件下对纯化的大豆液泡膜V型ATPase进行荧光猝灭实验,初步探讨了V型H⁺-ATPase的水解活性同其蛋白质折叠状态间的关系.研究表明,通过比较不同pH值、温度条件下蛋白质疏水区域和亲水区域内源荧光的荧光猝灭常数（K_SV）,发现当环境pH值、温度偏离酶的最适pH值和温度时,蛋白质的内源荧光强度降低且疏水区域和亲水区域内源荧光的荧光猝灭常数（K_SV）降低,说明伴随着酶的水解活性降低,蛋白质的折叠状态发生了变化.我们认为蛋白质在膜内的折叠状态变化是酶失活机制的一个重要方面,为植物的抗冻和抗盐研究提供了一定的参考.     

15N标记蛋白GAL4(62)的2D NMR实验

利用自编的脉冲程序,采用预饱和和自旋锁定对水峰进行双重抑制的方法,得到了 ¹⁵N标记蛋白GAL4(62)的2D ¹H-¹⁵N HSQC、HSQC-NOESY、HSQC-TOCSY谱,并对这几个谱在蛋白质 ¹H谱的归属中所起的作用进行了讨论.     

色氨酸类似物标记法研究DsbA蛋白的结构环境

用生物标记的方法将色氨酸类似物标记在DsbA蛋白中的色氨酸位置,分析标记蛋白质的谱学性质、色氨酸结构环境和潜在应用前景.5-OH-Trp标记的DsbA蛋白具有315 nm激发的荧光发射光谱;¹⁹F-NMR 能分辨5-F-Trp标记的DsbA蛋白的两个F-Trp残基(Trp76和Trp126),Trp76化学位移变化反映二硫键交换引起的结构转化.进一步将利用标记蛋白的独特荧光和¹⁹F-NMR性质,研究DsbA蛋白的氧化还原及与底物蛋白的结合作用.     

抗腺苷酸激酶单克隆抗体的制备及鉴定

克隆了6株稳定分泌抗腺苷酸激酶(Adenylate kinase,AK)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并鉴定或测定了其中3株细胞所分泌抗体的亚型和分子量.通过测定抗体和固相及均相抗原的结合能力,发现McAb3D3与固定化及溶液中腺苷酸激酶的亲和常数分别为8.4×10⁸和7.0×10~4(mol·L^-1)^-1,而McAb4D8与固定化及溶液中腺苷酸激酶的亲和常数分别为9.6×10⁸和3.9×10⁶(mol·L.¹)^-1McAb3D3和McAb4D8与不同存在形式抗原之间亲和常数如此大的差别,说明这2个抗体更适合与固定化腺苷酸激酶的结合.由于蛋白质分子常因吸附在酶标板上而发生部分变性,所以用间接ELISA方法筛选出的单克隆抗体McAb3D3和McAb4D8可能是针对部分变性腺苷酸激酶分子的.这2种抗腺苷酸激酶单克隆抗体的制备及鉴定为我们进一步将其用于蛋白质折叠机制的研究奠定了基础.