酿酒酵母中亚硫酸盐转运基因SSU1的分子进化分析

SSU1基因是涉及亚硫酸外排及SO₂耐受性的重要因素之一。为了研究酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)中SSU1对SO₂耐受性及其分化机制, 文章探讨了SSU1基因在酿酒酵母中的遗传特征及进化规律。基于SSU1基因序列的聚类分析表明, 酿酒酵母群体可通过该基因分为3个亚群, 且与其分离的地理位置无关; 基于群体数据的McDonald-Kreitman 检验表明, SSU1基因在酿酒酵母中受到适应性选择的作用; Ka/Ks检验表明, 在酿酒酵母中, 不同的亚群间有Ka/Ks显著大于1 的值, 且PAML的支系模型检验到正选择作用在群体中特定的支系上; PAML的支系-位点模型检验获得9个潜在正选择作用位点, 其中有4个发生在受正选择作用的特定支系中; 基于ssu1p蛋白结构的分析表明, 在特定支系存在的正选择作用位点中, 除345(R/K)位点上两氨基酸替换均为碱性氨基酸外, 其他3个位点均是极性氨基酸/疏水性氨基酸之间替换, 考虑不同区域的氨基酸pKa值对其维持正常的功能有着重要的作用, 在该类位点的替换可能影响到ssu1p蛋白对SO₂的转运作用。     

酿酒酵母乙醇耐受性的研究进展

生物乙醇作为一种可再生的清洁能源,正在引起人们的广泛关注.酿酒酵母是乙醇生产中最常用的发酵菌株,但是乙醇耐受性往往成为限制酿酒酵母菌乙醇产量的重要因素.选育耐受高浓度乙醇的酵母菌株对于提高乙醇产率具有重要意义.然而传统的菌株改良方法具有育种周期长,突变方向不定等缺点.主要综述了近年来国内外对酿酒酵母菌耐受乙醇的分子生物学机理方面的研究成果,进而总结了提高酿酒酵母乙醇耐受性的基因工程、代谢工程.     

酿酒酵母乙醇耐受性机理研究进展

酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)一直是主要的生物乙醇和酿酒业发酵菌株, 具有发酵速度快、乙醇产量高特性。然而, 产物乙醇积累造成的毒性效应是限制乙醇产量的主要因素之一, 研究酿酒酵母乙醇耐受性为解决这一工业难题奠定了理论基础。本文从乙醇对酵母细胞生理、细胞结构和组分的影响, 以及酿酒酵母乙醇耐受性的遗传基础方面综述了酿酒酵母乙醇耐受性机理的研究进展。     

工业用糖蜜酿酒酵母菌株耐受性分析研究

采用休止细胞梯度生长法, 对工业糖蜜酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株进行高浓度酒精、高温和高渗透压, 以及糠醛毒性、苯酚毒性、乙酸毒性和抗生素G418毒性的耐受性分析。结果表明, 所测定的工业酵母菌株对这些逆境条件的耐受性有明显的差别; 其中AS2.1189和AS2.1190对测定的胁迫条件均表现出相对较好的耐受性; 396对乙酸毒性和G418毒性具有很好的耐受性; 2610对高温表现出较强的耐受性。     

乙醇耐受性酿酒酵母菌株选育的研究进展

酿酒酵母是工业发酵生产乙醇的重要菌种,但是其发酵产物乙醇对酿酒酵母有明显的抑制作用.选育乙醇耐受性酿酒酵母是克服高浓度乙醇的抑制作用,提高乙醇产量的一条重要途径.本文对近年来国内外选育乙醇耐受性酵母的研究作一综述,旨在为乙醇耐受性酵母的选育提供参考.     

调控酿酒酵母类异戊二烯合成途径强化芳樟醇合成

芳樟醇是一种重要单萜,广泛应用于食品、医药、日化等工业领域.然而芳樟醇在植物中含量低且难提取,限制了其大规模生产.目前通常以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae作为单萜生物合成宿主,其内源类异戊二烯合成途径提供合成单萜物质的前体——香叶基二磷酸(GPP).由于该途径代谢通量较低,导致GPP供应不足,极大地降低了异源单萜的合成效率.为了调节该途径的代谢通量,构建酿酒酵母整合表达载体pRS305-tHMG1和游离表达载体pYLIS-IDI1,并分别转入酿酒酵母CEN.PK2-lC中,获得酿酒酵母工程菌LS01和LS02.同时将载体pYLIS-IDIl转入酿酒酵母工程菌LS01中,构建酿酒酵母工程菌LS03.GC-MS检测结果显示,通过提高异戊二烯二磷酸异构酶(IDIl)和羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶活性区域(tHMGl)的表达水平,最终使芳樟醇产量提高1.3倍至(127.71±7.68) tg/L.结果表明,通过调控类异戊二烯合成途径,强化GPP合成前体供给,可以显著提高酿酒酵母中芳樟醇的产量.     

酿酒酵母乙酸耐受性相关的微卫星分子标记筛选

【目的】筛选与酵母乙酸耐受性状紧密相关的微卫星分子标记。【方法】以两株表型差异菌株YHA和YLA作为亲本构建F2代菌株共计160株,选取15个微卫星位点通过PCR方法在40株子代中扩增产物,利用SPSS 11.5软件分析耐酸性状与微卫星序列间的相关性。【结果】找到3个与乙酸耐受性性状相关的微卫星位点,其中位点14P2与酵母乙酸耐受性状有极显著的正相关性(P<0.01),15P2和15P3与酵母乙酸耐受性具有显著的负相关性(P<0.01和P<0.05);此外对于微卫星位点14P2,耐酸亲本YHA在该位点的基因片段(344 bp)在子代耐酸菌株中出现频率达到70.6%,而不耐酸亲本YLA的基因片段(331 bp)在子代不耐酸菌株中出现的频率达91.3%。【结论】微卫星14P2的等位基因在子代菌株中的遗传具有明显的偏好性,该微卫星位点与某种耐酸基因存在一定的连锁遗传,为酵母分子标记辅助育种提供了有价值的遗传标记。     

酿酒酵母SRP40基因对细胞耐受性影响的研究

【目的】本论文研究酿酒酵母srp40³⁹突变基因对酵母细胞异丁醇耐受性的影响。【方法】首先,以酿酒酵母野生型W303-1A和突变株EMS39染色体DNA为模板克隆野生型SRP40基因和srp40³⁹突变基因;然后,将野生型SRP40基因和srp40³⁹突变基因分别连接到质粒YCplac22上,构建质粒YCplac22-SRP40和YCplac22-srp40³⁹。将质粒YCplac22-SRP40、YCplac22-srp40³⁹以及YCplac22空质粒分别转化入野生型酿酒酵母W303-1A中,分别得到W303-1A-SRP40工程菌、W303-1A-srp40³⁹工程菌和W303-1A-control工程菌。将3株工程菌分别置于含1.0%异丁醇、1.3%异丁醇、8.0%乙醇和0.5%异戊醇的CM培养基中进行发酵,测定细胞密度(OD₆₀₀)和生长情况,并计算2–10 h的比生长速率（μ）。将3株工程菌于55°C热激4 min后做稀释...     

工业用糖蜜酿酒酵母菌株耐受性分析研究

采用休止细胞梯度生长法,对工业糖蜜酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株进行高浓度酒精、高温和高渗透压,以及糠醛毒性、苯酚毒性、乙酸毒性和抗生素G418毒性的耐受性分析.结果表明,所测定的工业酵母菌株对这些逆境条件的耐受性有明显的差别;其中AS2.1189和AS2.1190对测定的胁迫条件均表现出相对较好的耐受性;396对乙酸毒性和G418毒性具有很好的耐受性;2610对高温表现出较强的耐受性.     

重构酿酒酵母N-糖基化途径生产人源化糖蛋白

【目的】为了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生产人源化的糖蛋白,必须对N-糖基化途径进行基因工程改造。作者通过敲除一些酵母N-糖基化途径中的特异性糖基转移酶,得到一株可以用于继续表达人类糖基转移酶的重组菌,并通过生长适应性进化技术回复其细胞生长能力。【方法】首先运用酵母遗传学和分子生物学技术敲除酿酒酵母的α-1,3-甘露糖基转移酶基因(ALG3)、α-1,6-甘露糖基转移酶基因(OCH1)和α-1,3-甘露糖基转移酶基因(MNN1)。采用蔗糖酶(invertase)活性染色实验初步检测N-糖链的变化,然后通过高效液相色谱和甘露糖苷酶酶切实验对其糖链结构进行鉴定。重组菌通过在高温条件下进行生长适应性进化,筛选出生长能力回复突变的菌株。【结果与结论】构建了Δalg3Δoch1Δmnn1菌株得到人类糖基化中间体Man5GlcNAc2,并对上述三缺陷型菌株进行适应性进化提高其细胞生长能力和环境适应能力。此外,作者还发现,该重组菌存在少量Man6GlcNAc2结构的糖链。经体外α-1,2-甘露糖苷酶切处理后,糖链Man5GlcNAc2和Man6GlcNAc2均转化为Man3GlcNAc2,表明形成Man3GlcNAc2之后的甘露糖之间均通过α-1,2-糖苷键连接。Δalg3Δoch1Δmnn1菌株的构建获得了生产人源化糖蛋白的酿酒酵母表达系统,为进一步糖基化改造和工业应用提供了良好的基础。     

高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为"最具价值的生物炼制产品之一".以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因...     

分别利用产甘油假丝酵母抗逆转录因子CgSTB5和CgSEF1对酿酒酵母菌株糠醛耐受改造

【背景】纤维素是生物转化解决能源问题的主要原料之一,其水解物中存在严重影响抑制菌株生长的糠醛,需脱毒才可应用于发酵,提高菌株耐受性是解决纤维素水解液实际生产应用的关键。【目的】酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是主要的纤维素水解液发酵工业菌株,但糠醛耐受性较低,通过分子改造获得具有高糠醛耐受性的菌株。【方法】利用新获得的产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)的相关抗逆转录因子CgSTB5、CgSEF1和CgCAS5,通过分子技术进行S.cerevisiae改造,考察其对酿酒酵母糠醛耐受性的影响,并尝试应用于未脱毒纤维素乙醇发酵。【结果】单个表达CgSTB5和CgSEF1的酿酒酵母,通过菌株点板实验表明菌株的糠醛耐受性提高25%以上,并且摇瓶发酵结果显示糠醛降解性能明显提高,生长延滞期明显缩短,S.cerevisiae W303/p414-CgSTB5的未脱毒纤维素乙醇发酵生产效率提高12.5%左右。【结论】转录因子CgSTB5和CgSEF1均能对提高酿酒酵母糠醛耐受性起到重要作用,并且有助于提高酿酒酵母菌株未脱毒纤维素乙醇发酵性能。     

代谢工程改造酿酒酵母合成植物萜类D-柠檬烯的策略

植物萜类化合物是以异戊二烯为结构单位的一大类植物天然的次生代谢产物。D-柠檬烯属于单萜类化合物,由于它具有抑菌、增香、抗癌、止咳、平喘等多种功能,已被广泛应用于食品、香料、医疗等行业。目前D-柠檬烯的工业生产主要是从植物的果皮或者果肉中提取的,但提取方法存在着分离纯化复杂、产率低、能耗大等缺点。而本世纪初合成生物学技术的兴起,为微生物异源合成天然活性化合物带来了全新的理念与工具,打破了物种间的界限,使微生物异源合成D-柠檬烯成为现实。构建定向、高效的异源合成D-柠檬烯的微生物细胞工厂,实现微生物发酵法替换传统的植物提取法,具有重要的经济与社会效益。本文主要回顾了近几年利用代谢工程改造酿酒酵母异源合成萜类化合物取得的成就,阐述了以酿酒酵母作为底盘微生物,利用代谢工程和合成生物学的手段构建高产D-柠檬烯的合成策略。     

代谢工程改造酿酒酵母提高法尼醇产量

[目的]法尼醇(FOH,C15H26O)是一种具有芳香气味的非环状倍半萜醇,被广泛应用于化妆品和医学药物的工业化生产,也可作为航空燃料的理想替代品.具有食品级安全性的酿酒酵母细胞能够合成内源性法尼醇,但其产量很低,无法满足工业生产的需要.因此,需要采用代谢工程手段,改造法尼醇合成途径,以有效提高法尼醇在酿酒酵母中的产量...     

Crabtree-negative characteristics of recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae

For recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae, ethanol yield and productivity is substantially lower on xylose than on glucose. In contrast to glucose, xylose is a novel substrate for S. cerevisiae and it is not known how this substrate is recognized on a molecular level. Failure to activate appropriate genes during xylose-utilization has the potential to result in sub-optimal metabolism and decreased substrate uptake. Certain differences in fermentative performance between the two substrates have thus been ascribed to variations in regulatory response. In this study differences in substrate utilization of glucose and xylose was analyzed in the recombinant S. cerevisiae strain TMB3400. Continuous cultures were performed with glucose and xylose under carbon- and nitrogen-limited conditions. Whereas biomass yield and substrate uptake rate were similar during carbon-limited conditions, the metabolic profile was highly substrate dependent under nitrogen-limited conditions. While glycerol production occurred in both cases, ethanol production was only observed for glucose cultures. Addition of acetate and 2-deoxyglucose pulses to a xylose-limited culture was able to stimulate transient overflow metabolism and ethanol production. Application of glucose pulses enhanced xylose uptake rate under restricted co-substrate concentrations. Results are discussed in relation to regulation of sugar metabolism in Crabtree-positive and -negative yeast.     

Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae

Because of many advantages, the yeast Saccharomyces cerevisiae is increasingly being employed for expression of recombinant proteins. Usually, hybrid plasmids (shuttle vectors) are employed as carriers to introduce the foreign DNA into the yeast host. Unfortunately, the transformed host often suffers from some kind of instability, tending to lose or alter the foreign plasmid. Construction of stable plasmids, and maintenance of stable expression during extended culture, are some of the major challenges facing commercial production of recombinant proteins. This review examines the factors that affect plasmid stability at the gene, cell, and engineering levels. Strategies for overcoming plasmid loss, and the models for predicting plasmid instability, are discussed. The focus is on S. cerevisiae, but where relevant, examples from the better studied Escherichia coli system are discussed. Compared to free suspension culture, immobilization of cells is particularly effective in improving plasmid retention, hence, immobilized systems are examined in some detail. Immobilized cell systems combine high cell concentrations with enhanced productivity of the recombinant product, thereby offering a potentially attractive production method, particularly when nonselective media are used. Understanding of the stabilizing mechanisms is a prerequisite to any substantial commercial exploitation and improvement of immobilized cell systems.     

酵母Sirtuins在细胞寿命中的作用

酿酒酵母(以下简略为酵母)作为寿命分析模型广泛应用于寿命研究领域。酵母寿命分析方法有两种,分别是复制型酵母寿命分析法和时序型酵母寿命分析法。目前,通过酵母寿命分析模型已识别出包括SIR2在内的多个寿命调节基因。SIR2是目前较好的被确立起来的寿命调节基因,具有NAD依赖型脱乙酰化酶的活性,从原核生物到真核生物都有良好的保守性。Sirtuins (Sir2蛋白家族的总称)在细胞内具有功能上的多样性,其中包括对于压力耐受的调节、基因转录的调节、代谢通路的调节以及寿命调节作用等。Sir2是Sirtuins家族最早发现的成员,其功能是参与异染色质结构域转录的沉默调节,同时还参与复制型酵母寿命的调节。已证明,SIR2的缺失会缩短酵母的寿命,基因表达的增高会延长寿命。Sir2的高等真核生物的同源蛋白也被证实参与衰老相关疾病的调节。本文中,我们将阐述Sir2以及Sir2的酵母同源蛋白Hst1-Hst4的功能,以及由它们调节的酵母寿命。