多核苷酸磷酸化酶及其应用(上) 关于酶蛋白的研究

多核苷酸磷酸化酶(Polynucleotide phospho-rylase——Polyribonucleotide:Orthophosphate nuc-leotidyltransferase——E.C.2.7.7.8,以下简称PNPase)是一个很重要的酶,自1955年被Ochoa等发现以来,它在核酸研究的许多方面起了重要的作用。早期利用它合成的多或寡聚核苷酸的物理化学和生物学性质,证实了Watson-Crick关于DNA的双螺旋结构理论,阐明了遗传密码及其阅读方向。最近以来,它对特定顺序寡核苷酸的人工合成和RNA的结构分析等起着多方面的重要作用。PNPase所合     

多核苷酸磷酸化酶及其应用(下)——关于应用的研究

人们对于多核苷酸磷酸化酶(PNPase)的巨大兴趣,并非由于它在体内的生理意义(这方面还不清楚),而在于它的广泛应用及其所作出贡献。例如Nirenberg和Ochoa等应用PNPase研究遗传密码及其阅读方向,因此获得诺贝尔奖金。仅此即足以说明PNPase在应用方面的卓越贡献。这些细节过去已有报道,不拟赘述。近十年来PNPase又对核酸人工合成、RNA结构分析、以及合成具有生物功能的polyN等方面作出了重大的贡献,现就这几方面作些介绍。一、PNPase用于核酸的人工合成     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅰ.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备及其基本性质

对-重氮基苯磺酰乙基琼脂糖是制备固定化多核苷酸磷酸化酶的较好材料,与具有同样活性基团的纤维素和葡聚糖凝胶G200相比,活力回收高、稳定性好。固定化酶的最适pH 向偏碱的方向转移,最适温度较自然酶为宽,表观米氏常数与自然酶基本一致。57℃保温30分钟尚保留70%以上的活力,而自然酶仅剩余22%的活力,说明稳定性有所提高。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅰ.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备及其基本性质

对-重氮基苯磺酰乙基琼脂糖是制备固定化多核苷酸磷酸化酶的较好材料,与具有同样活性基团的纤维素和葡聚糖凝胶G200相比,活力回收高、稳定性好。固定化酶的最适pH向偏碱的方向转移,最适温度较自然酶为宽,表观米氏常数与自然酶基本一致。57℃保温30分钟尚保留70%以上的活力,而自然酶仅剩余22%的活力,说明稳定性有所提高。     

微生物多核苷酸磷酸化酶的研究

采用聚丙烯酰胺凝皎电泳柃测不同来源细菌、酵母菌和真菌中的多核苷酸磷酸化酶相似文献   

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究III．酶与多核苷酸复合物的形成

固定化多核苷酸磷酸化酶(简称PNP酶)在催化聚合反应过程中与合成的多核苷酸相联,形成酶多核苷酸复合物。反应产物分析表明：反应液中除了残留未经反应的底物以及大分子聚合物外,未检查出中间寡聚物。以上结果提示,固定化PNp酶催化聚合反应机制为连续反应。     

多核苷酸合成的研究 Ⅸ 在多核苷酸磷酸化酶(PNPase)的单一加成反应中引物和保护底物的特异性问题

在PNPase 利用2′(3′)-o-α甲氧乙基保护的NDP 作为底物的单一加成反应中,CpUpC+ppU~(Me),37℃,7小时,CpUpCpU~(Me)的产率在50%以上,而CpUpC+ppG~(Me)在同一反应条件下,CpUpCpG~(ME)的产率仅10%以下。若提高反应温度、pH 和底物的浓度等,可增加CpUpCpG~(Me)的产率至50～70%。GpCpm′I+PP(?)~(Me)在上述反应条件下,没有获得所希望的反应产物(GpCpm'Ip(?)~(Me),而UpCpC+pp(?)~(Me)时,则有UpCpCp(?)~(Me)的生成。GpCpm'I+pp(?)时,有少量GpCpm'Ip(?)合成。这些结果说明,在PNPase 的单一加成反应中,存在着底物和引物的特异性问题,因而对不同的底物或引物的最适反应条件是有差别的。     

多核苷酸合成的研究——Ⅸ 在多核苷酸磷酸化酶(PNPase)的单一加成反应中引物和保护底物的特异性问题

在PNPase利用2′(3′)-o-α甲氧乙基保护的NDP作为底物的单一加成反应中,CpUpC+ppU~(Me),37℃,7小时,CpUpCpU~(Me)的产率在50%以上,而CpUpC+ppG~(Me)在同一反应条件下,CpUpCpG~(Me)的产率仅10%以下。若提高反应温度、pH和底物的浓度等,可增加CpUpCpG~(Me)的产率至50～70%。GpCpm′I+ppψ~(Me)在上述反应条件下,没有获得所希望的反应产物(GpCpm′Ipψ~(Me)),而UpCpC+ppψ~(Me)时,则有UpCpCpψ~(Me)的生成。GpCpm′I+ppψ时,有少量GpCpm′Ipψ合成。这些结果说明,在PNPase的单一加成反应中,存在着底物和引物的特异性问题,因而对不同的底物或引物的最适反应条件是有差别的。     

利用过滤培养技术生产大肠杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究

将中空纤维膜过滤器与５升自动控制搅拌发酵罐耦联进行大肠杆菌ＡＳ．１．１８３的过滤培养,大肠杆菌细胞的最高浓度可达２５０ｇ／ｌ（湿重,含水７０％）,细胞内多核苷酸磷酸化酶的活性可以稳定在８０ｕ／ｇ菌左右,发酵罐的体积生产效率比分批发酵提高近１０倍。     

利用过滤培养技术生产大肠杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究

将中空纤维膜过滤器与５升自动控制搅拌发酵罐耦联进行大肠杆菌ＡＳ．１．１８３的过滤培养,大肠杆菌细胞的最高浓度可达２５０ｇ／１（湿重,含水７０％）,细胞内多核苷酸磷酸化酶的活性可以稳定在８０ｕ／ｇ菌左右,发酵罐的体积生产效率比分批发酵提高近１０倍。     

大腸杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究 Ⅰ.酶的提純与性质

大腸杆菌的抽提液中,合有焦磷酸酯酶,P~(32)中含有放射性焦磷酸,二者的联合作用,对于利用P~(32)-ADP末端磷交换方法測定多核苷酸磷酸化酶有干扰作用,P~(32)必須事先用酸水解。粗酶液中含有磷酸酯酶,能分解ADP、AMP,含量高时,对测定多核苷酸磷酸化酶有严重的干扰作用。經过一系列提純步驟,純酶制品的比活性与抽提液相比可提高約400倍,其中未檢查出核酸酶,非特异性磷酸单酯酶,5′-核苷酸酶,焦磷酸酯酶的含量很少。提純的酶制品相当稳定,在2—4℃中可保存三周,在37℃、47℃中加热20分钟,仍能保存87.2%与82.7%的活性,TMV-RNA,酵母HRNA与商品酵母HRNA均能稳定酶活性。     

大腸杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究 Ⅱ.核酸的結构与磷酸解作用

(1) 利用磷酸单酯酶切除商品酵母RNA末端磷酸,可以提高大腸杆菌多核苷酸磷酸化酶对其磷酸解速度达5—7倍之多,說明大分子核酸和寡核苷酸一样,3′-磷酸末端是妨碍磷酸解的重要因素。(2) 商品酵母RNA,經过脫氨后,磷酸解速度有所提高;說明RNA二級結构的破坏,有利于磷酸解反应的进行。(3) 磷酸解脫氨RNA时,要求較高濃度的Mg~(++)其最适濃度由5×10~(-3)M提高到8×10~(-2)M。(4) 3′-单核甘酸对RNA的磷酸解无影响。     

蔗糖磷酸化酶及其在糖基化反应中的应用

糖基化反应能有效改善化合物的水溶性、稳定性、生物利用度等性质,利用糖苷水解酶类和糖基转移酶类对生物活性化合物进行糖基化修饰已成为研究热点。相比于糖基转移酶类,糖苷水解酶类在大规模催化中具有来源丰富、成本低的优势。其中,蔗糖磷酸化酶因其卓越的糖基化活性和广泛的底物特异性,在化工领域受到人们的广泛关注。文中综述了蔗糖磷酸化酶的结构与催化特性,概述了蔗糖磷酸化酶的定向改造,同时系统性地总结了蔗糖磷酸化酶在糖基化反应中的应用及与其他酶的联合应用。并且,基于蔗糖磷酸化酶的研究现状,结合笔者研究团队的多年工作经验,探讨了该课题的未来发展方向。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅱ.用固定化酶制备Poly I和Poly C

固定化PNP酶柱反应器在pH9,37℃,含有6微克分子/毫升MgCl_2,0.04%NaN_3,11～12微克分子/毫升CDP(IDP)的条件下,连续聚合反应1.5～2个月,转化率基本不变。所得的Poly I,Poly C用Lowry法测不出蛋白,紫外吸收光谱符合标准。按人体用量放大350～400倍进行急性动物毒性试验证明无毒害作用。可以省去自然酶制备Poly I,Poly C过程中酚脱蛋白的工艺。     

从大肠杆菌B／r中同时制备ATP：RNA腺苷酰转移酶和多核苷酸磷酸化酶

本文报道了从大肠杆菌B／r中同时制备ATP：RNA腺苷酰转移酶和PNPase的简便方法。菌体经压力破碎,聚乙二醇、葡聚糖分相抽提及磷酸纤维素柱层析得到ATP：RNA腺苷酰转移酸。其滤液经DEAE纤维素柱层析和Scphadex G-200凝胶过滤得到PNFasc。用Oligo dT纤维素和聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶反应产物作了初步鉴定。     

细胞骨架结构及其功能(上)

细胞质具有许多凝胶的理化性质。早在四十年代后期,Wyssling就提出细胞质含有细丝组成的网架。细丝数目及细丝间相互作用的强弱决定细胞质的结构状态。细丝数目愈多,细丝间相互作用愈强,细胞就愈呈凝胶状。细胞质的这种网状结构,就是现在人们所谓的细胞骨架。正是这种网架结构,使细胞具有一定结构和形状,并能产生运动。细胞骨架研究概况     

纤维二糖磷酸化酶和纤维寡糖磷酸化酶的研究与应用

自然界中一些厌氧的纤维素降解菌能够产生纤维二糖磷酸化酶(Cellobiose Phosphorylase,CBP)和纤维寡糖磷酸化酶(Cellodextrin Phosphorylase,CDP)磷酸化裂解纤维二糖和纤维寡糖.CBP和CDP属于糖苷水解酶94家族(Glycoside Hydrolase Family 9...     

多核苷酸合成的研究 Ⅶ.RNA连接酶合成十六核苷酸 (CpUpCpGpUpCpCpApCpUpCpGpUpCpCpA)

~(32)pCUCGUCCA(作为供体),CUCGUCCA(作为受体),其比例为1∶50,在RNA连接酶催化下,进行连接反应,形成16核苷酸片段即CUCGUCCA~(32)pCUCGUCCA。反应后产物经Sephadex G-75柱分离,分离后得到的产物通过下列鉴定:抗碱性磷酸单酯酶;同系层析;毗邻分析等。证明是我们所希望的产物,其产率经过重复在50～70%之间。这种RNA连接酶对合成具有一定排列顺序的RNA片段,可以认为将是一种很好的工具酶。