葡萄糖异构酶基因工程菌的改造初探

葡萄糖异构酶（ｇｌｕｃｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ,ＧＩ）是使用量最大的工业酶之一,可用于高果糖浆的生产,也可以用含木聚糖物质及废料为底物发酵生产乙醇,具有重要的经济价值．本文选择了表达载体ｐＢＶ２２０［１］,利用ＰＣＲ方法删除了原表达质粒ｐＴＫＤＧＩ１中ＧＩ结构基因５′端多余的核苷酸,并添加了合适的酶切位点,重新构建了能在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达ＧＩＧ１３８Ｐ的表达质粒ｐＢＺＧＩ１．传代实验表明,新表达体系的稳定性明显优于原表达体系．粗酶液经热处理、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ和分子筛Ｓｅ…     

环状芽孢杆菌C—2几丁酶基因在大肠杆菌中的表达

对已克隆的环状芽孢杆菌Ｃ－２的几丁酶基因片段所作的亚克隆分析表明,该几丁酶基因位于１．７ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ－Ｓｔｙ Ｉ片段 。ＣｈｉＩ基因在大肠杆菌ＪＭ１０７,ＤＨ５α,ＸＬ１－ｂｌｕｅ,ＴＧ－１等菌株中均能表达,但表达水平不同,其中ＪＭ１０７的表达活性最高,其胞外几丁酶活性与供体菌Ｃ－２菌株的胞外酶活性几乎相当。     

MHC Class Ib grc—G／C基因的研究进展

ＭＨＣ的ｃｌａｓｓ基因,可分为经典的ｃｌａｓｓ Ｉ和非经典的ｃｌａｓｓＩ,后者称ｃｌａｓｓ Ｉｂ。ｃｌｓｓ Ｉ与β／β Ｔ细胞相关在细胞表面高密度表达,ｃｌａｓｓ Ｉｂ在细胞表面弱表达,其功能尚不清楚,ｃｌａｓｓ Ｉｂ的基因区域中含有一个ｇｒｃ区域,ｇｒｃ基因的ｒｃｃ,ｆｔ,ｄｗ－３三组基因组成。     

在大肠杆菌中提高人α1b型基因工程干扰素的表达

将人α１ｂ型干扰素（ＩＦＮ-α１ｂ）基因插入带有原核增强子样序列的新型载体Ｐｂｖ３２２,使干扰素在大肠杆菌中的表达水平明显高于原表达载体,达到１.６×１０^８ｕ／Ｌ培养液。重组质粒的特点是：含增强子序列Ｘ,ｔｒｐ启动子控制。利用ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析及单克隆抗体亲和层析纯化ＩＦＮ-α１ｂ,获得了电泳纯产品,其比活性为２×１０^７ｕ／ｍｇ,分子量为１９ｋＤａ。此外,用Ｐａｔ１５３代替Ｐｂｖ３２２,构建了带有和不带有Ｘ序列的两种表达载体,平行对比表明增强子Ｘ序列可以将ＩＦＮ-α１ｂ表达提高４倍     

利用谷氨酰胺合成酶基因(GS)作扩增标记在CHO细胞中高效表达乙型肝炎表面抗原基因

利用谷氨酰胺合成酶基因（ＧＳ）［１］作扩增选择标记,结合ＣＭＶ－ＩＥ启动子,在ＣＨＯ细胞中高效表达乙型肝炎表面抗原基因。初筛克隆表达水平ＲＰＨＡ检测为１：６４,经过谷氨酰胺合成酶基因的抑制剂ＭＳＸ的两轮基因扩增,ＨＢｓＡｇ的表达水平ＲＰＨＡ在１：２５６以上。方瓶静置培养收液,ＲＩＡ检测ＨＢｓＡｇ最高产量为９．５μｇ／毫升。表达水平较以前利用ｄｈｆｒ基因扩增选择系统所得到的高表达细胞系Ｂ４３高一倍以上。利用ＧＳ基因扩增选择系统可以在哺乳动物细胞中高水平表达外源基因。     

重组PAI－1在大肠杆菌中的高效表达

纤溶酶原激活物抑制因子－１（ＰＡＩ－１）在天然状态下含量很低。为了进行ＰＡＩ－１的结构与功能的研究,构建了表达重组ＰＡＩ－１的质粒ｐＢＶ２２０／ＰＡＩ－１,并在大肠杆菌中得到了高效表达。最高表达量为菌体总蛋白量的４９％以上,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ检测,得到了分子量为４３．０ｋＤａ的反应条带。对形成包涵体的表达产物进行变、复性处理及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５的初步纯化,得到了潜伏态的重组Ｐ     

牛疱疹病毒Ⅰ型前早期基因BICPO的表达对牛免疫缺陷病毒LTR的反式激活作用

由含有ＢＨＢＶ－１（ＢｏｖｉｎｅＨｅｒｐｅｓＶｉｒｕｓ－１）前早期基因的基因组片段亚克隆ＢＩＣＰＯ（ＢＨＶ－１ＩｎｆｅｃｔｅｄＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎＯ）的ＤＮＡ序列至表达载体ｐＳＶＫ３,构建质粒ｐＳＶ２．９。将该质粒与ｐＢＬＴＲ－Ｌｕｃ共转染小牛肺细胞,检测转染细胞裂解物的荧光素酶活性,ＢＩＣＰＯ的表达产物可以显著地激活ＢＩＶＬＴＲ启动子控制下的荧光素酶基因的表达。根据ｐＳＶ２．９与含有ＢＩＶＬＴＲ不同区段缺失的质粒ｐＤ－３１９－Ｌｕｃ、ｐＤ－１１５－Ｌｕｃ、ｐＤ－５２－Ｌｕｃ共转染小牛肺细胞的实验结果,推测ＢＩＶＬＴＲ－３１９位上游区的ＤＮＡ序列影响ＢＩＣＰＯ基因产物对ＢＩＶＬＴＲ表达的激活作用。     

高秆突变体Mh—1的株高遗传研究

Ｍｈ－１是从矮秆品种桂朝２号辐射诱变后代中产生的高秆突变体。用Ｍｈ－１与ｓｄ－１矮秆、非ｓｄ－１矮秆和普通高秆材料杂交,通过对Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３等世代以及测交后代的株高进行遗传分析,结果表明,Ｍｈ－１的高秆特性是由１对隐性抑制基因控制的,该抑制基因能调节ｓｄ－１基因的表达,而对由非ｓｄ－１基因控制的矮秆没有抑制作用,这一隐性抑制基因暂时被定名为ｉ－ｓｄ－１（ｔ）。还讨论了该基因的遗传学意义和可能的育     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）突变体FrGGI的构建,表达及特性…

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有ＰＡＩ－１抗性的新型ｔ－ＰＡ溶性剂,利用基因重组及定位突变技术构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１、Ｋ２区糖基化位点消除,ＰＡＩ－１结合位点缺失,Ｆ与Ｅ区连接序列Ｈｉｓ４４￣Ｓｅｒ５０置换为纤粘蛋白Ｉ型Ｆ区间连接序列Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ的ｔ－ＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达,对表达产物的生物学特性分析表明     

利用谷氨酰胺合成酶基因（GS）作扩增标记在CHO细胞中高效表达乙型…

利用谷氨酰胺合成酶基因（ＧＳ）作扩增选择标记,结合ＣＭＶ－ＩＥ启动子,在ＣＨＯ细胞中高效表达乙型肝炎的基因。初筛克卫表达水平ＲＰＨＡ检测为１：６４,经过谷氨酰胺合成酶基因的抑制剂ＭＳＸ的两轮基因扩增。ＨＢｓＡｇ的表达水平ＲＰＨＡ在１：２５６以上。方静置培养收液,ＲＩＡ检测ＨＢｓＡｇ最高产量为９．５μｇ／毫升。表达水平较以前利用ｄｈｆｒ基因扩增选择系统所得到的高表达细胞系Ｂ４３高一倍以上。利用ＧＳ基     

拟南芥吲哚—3—甘油磷酸合酶免疫分析

吲哚３甘油磷酸合酶（ＩＧＳ,ｉｎｄｏｌｅ３ｇｌｙｃｅｒｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ,ＥＣ４．１．１．４８）在色氨酸与吲哚乙酸的生物合成途径中,催化生成吲哚３甘油磷酸。研究该基因的表达调控,对于阐明高等植物是如何调控色氨酸及生长素合成是十分重要的。利用已克隆的ＩＧＳｃＤＮＡ,构建了谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ,ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＥＣ２．５．１．１８）与吲哚３甘油磷酸合酶融合蛋白的表达质粒,并将其导入到在异丙基βＤ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导下能高效表达的ＩＧＳ基因缺陷菌株ｔｒｐＣ９８００λＫＣ大肠杆菌中。高表达的融合蛋白通过谷胱甘肽琼脂糖（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅａｇａｒｏｓｅ）亲和层析和ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,用以免疫兔子制备抗血清。免疫印迹法分析表明拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）四种常用生态型只合成一种分子量约为４０ｋＤ的吲哚３甘油磷酸合酶蛋白。在Ａｇ＋、紫外线等逆境条件下,ＩＧＳ含量都有较大幅度的增加,这说明ＩＧＳ可能与植物的防御反应紧密相关。     

BRCA1基因结构及其在乳腺癌中的表达

利用ＭＰＣＲ技术从乳腺组织分离到抑癌基因ＢＲＣＡ１的ｃＤＮＡ片段,将此９１４ｂｐ的片段克隆进质粒ｐＵＣ１１８,并经全序列测定证实。序列分析表明,ＢＲＣＡＩｃＤＮＡ编码的肽链ＮＮ２－末端有一锌指结构,抑癌基因ＢＲＣＡＩ的产物可能是ＤＮＡ结合蛋白,ｃＤＮＡ序列存在两个变异位点：一个是第４０９位的Ｃ→Ａ（Ａｓｐ→Ｇｌｕ）：另一个是第８７９位的Ａ→Ｔ（ＭＩａ同义突变）。以该片段为探针,检测６例乳腺癌组织中ＢＲＣＡＩｍＩＭＡ表达,一例表达明显下降,一例没检测到表达的ｍＩＭＡ产物,说明一些乳腺癌组织的ＢＲＣＡ１基因转录水平降低     

BIV—1—gp120在重组杆状病毒系统中的表达

将中国株ＨＩＶ－１Ｂ亚型ｇｐ１２０全基因序列克隆到杆状病毒转座载体ｐＦａｓｔＢａｃＩ中多角体启动子下游,构建成重组转座载体ｐＦａｓｔＢａｃＩ－ｇｐ１２０,利用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞Ｓｆ９中高效表达了ＨＩＶ－１的外膜糖蛋白ｇｐ１２０,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果一致,证明表达了２种糖基化程度不同的ｇｐ１２０。     

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂cDNA在P.pastoris酵母菌中的表达和鉴定

将编码３７９个氨基酸残基的ＰＡＩ－１ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和ＰＨＯ１分泌信号肽序列的甲醇营养型酵母载体中,构建成表达质粒ｐＹＩＳ－１．表达质粒转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ甲醇营养型酵母细胞,筛选Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ－表型的转化子,经低密度摇瓶培养,１％甲醇诱导表达７ｄ后,培液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,ＰＡＩ－１生物活性测定和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实表达出分子量为４３～５１ｋＤ的４条ＰＡＩ－１条带．表达的ＰＡＩ－１能有效地分泌到培液中,占培液总蛋白的２６％左右,达４ｍｇ／Ｌ培液;其比活性为１．１６×１０４ＡＵ／ｍｇ．不同分子量ＰＡＩ－１可能与其糖基化程度不同有关     

人转化生长因子β1在大肠杆菌中的分泌表达

为了研究双体形式生长因子的原核基因工程,尝试了人转化生长因子β１（ｈＴＧＦβ１）基因的分泌表达．通过缺失突变,构建了能表达具有天然一级结构的ｈＴＧＦβ１单体蛋白的周质分泌表达质粒．采用双顺反子表达系统,使ＴＧＦβ１在周质中获得了高效可溶性表达．研究了改善转运通路对重组蛋白分泌表达的影响,发现共表达σ３２基因和ｄｓｂＡ基因,可促进周质中ＴＧＦβ１双体分子的形成;而共表达ｓｅｃＥ／Ｙ基因对ＴＧＦβ１的分泌表达则没有明显影响．通过共表达ｋｉｌ基因,使ＴＧＦβ１在胞外培养基中获分泌表达,并在胞外折叠、组装形成具有生物活性的双体分子     

PKC对人mdr1基因转录调控的研究

研究了ＰＫＣα、β１和β２亚型对多药耐药基因ｍｄｒ１转录的调控作用．以ｍｄｒ１基因上游调控序列驱动的虫荧光素酶报告基因表达载体和ＰＫＣ基因表达载体共同转染ＣＯＳ７细胞后,测定虫荧光素酶报告基因表达水平．实验结果表明,ＰＫＣα、β１及β２对ｍｄｒ１基因的转录有下调作用,ＰＭＡ可进一步加强这一作用;在此转染体系中,ＰＫＣ抑制剂ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ也可抑制ｍｄｒ１基因的转录,但在只转染ｍｄｒｌｕｃ的细胞中,ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ对ｍｄｒ１的转录则没有影响,提示ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ仅在ＰＫＣ过量表达的细胞中抑制ｍｄｒ１基因的转录．     

单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒载体的构建及LacZ基因的表达

从单纯疱疹病毒Ⅰ型ＨＳＶ－１基因组中分离出其包装信号序列,与含ＨＳＶ－１复制起点及ＩＥ－６８基因启动子的ＤＮＡ序列、β半乳糖苷酶基因和大肠杆菌质粒骨架,构建了一种ＨＳＶ－１扩增子质粒载体ｐＨＳＬ,其中ＬａｃＺ基因置于ＩＥ－６８基因启动子控制下。将此质粒转染已感染了ＨＳＶ－１温度敏感株ｔｓＫ株的Ｖｅｒｏ细胞,ｐＨＳＬ可在ＨＳＶ－１ｔｓＫ的辅助下包装成假病毒颗粒,这样就可得到同时含有假病毒和ＨＳＶ－１ｔｓＫ的混合毒株ｄｖＨＳＬ。将此混合毒株感染传代细胞和神经细胞,可在其中表达ＬａｃＺ基因,而在生理温度（３７℃）下,混合毒株的复制受到抑制。提示这种缺陷型疱疹病毒载体有用于向神经系统基因转移的可能性。     

水稻转座子Tourist—Os6从sbe1基因启动区切离的证明

为研究ｓｂｅｅ１基因的表达调控机理,籼稻ＩＲ３６品种的ｓｂｅ１基因被克隆。经测序一与已报告的ｓｂｅ１上比,ＩＲ３６水稻品种ｓｈｅ１基因５‘上游区顺序中除了有分散的３２个碱基差异外,值得注意的是缺少一般３３５ｂｐ长的Ｔｏｕｒｉｓｔ－Ｏｓ６序列,并在缺失的位置上留下转座子切离后的特征性足印顺序,这表明ＩＲ３６品种的Ｔｏｕｒｉｓｔ－Ｏｓ６已从ｓｂｅ１基因中切离。因而为Ｔｏｕｒｉｓｔ－Ｏｓ６是可移动的转座     

水稻转座子TouristOs6 从sbe1 基因启动区切离的证明

为研究ｓｂｅ１ 基因的表达调控机理,籼稻ＩＲ３６ 品种的ｓｂｅ１ 基因被克隆。经测序后与已报告的ｓｂｅ１ 基因顺序相比,ＩＲ３６ 水稻品种ｓｂｅ１ 基因５’上游区顺序中除了有分散的３２ 个碱基差异外,值得注意的是缺少一段３３５ ｂｐ 长的ＴｏｕｒｉｓｔＯｓ６ 序列,并在缺失的位置上留下转座子切离后的特征性足印顺序,这表明ＩＲ３６ 品种的ＴｏｕｒｉｓｔＯｓ６ 已从ｓｂｅ１ 基因中切离。因而为ＴｏｕｒｉｓｔＯｓ６ 是可移动的转座子提供了一个有力的证据     

人组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）突变体FrGGI的构建、表达及特性分析

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有ＰＡＬ－１抗性的新型ｔ－ＰＡ溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１、Ｋ２区糖基化位点消除,ＰＡＩ－１结合位点缺失,Ｆ与Ｅ区连接序列Ｈｉｓ４４～Ｓｅｒ５０置换为纤粘蛋白Ⅰ型Ｆ区间连接序列ＧｌｕＳｅｒＬｙｓＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｕ的ｔ－ＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,ＦｒＧＧＩ在大鼠血浆中的半衰期延长了１５倍,并获得了ＰＡＩ－１抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。