A型流感病毒血凝素、神经氨酸酶DNA疫苗研究

用BALB/C小鼠为模型,检测A型流感病毒血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白DNA疫苗抗流感能力。研究表明:血凝素、神经氨酸酶DNA疫苗能提供有效的抗流感保护;血凝素、神经氨酸酶和基质蛋白联合免疫动物提供最佳免疫保护。     

流感病毒血凝素基因、神经氨酸酶基因在小鼠中的免疫效果观察

流感病毒血凝素基因,神经氨酸酶基因免疫BALB／c小鼠,获得特异阳性抗体反应,抗体滴度与基因免疫量呈正相关性,各实验组免疫小鼠抗同型流感病毒攻击存活率为100％,血凝素基因免疫小鼠抗异型流感病毒攻击存活率为100％,神经氨酸酶基因免疫小鼠抗异型流感病毒攻击存活率为75％,血凝素基因与神经氨酸酶基因联合免疫小鼠抗异型流感病毒攻击存活率为100％。     

广州2006年乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因特性分析

为了解2006年广州地区流行的乙型流感病毒株血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的基因特性,选择病原学监测病毒株和暴发性疫情病毒株,提取病毒RNA并逆转录为cDNA,通过PCR方法扩增乙型流感病毒HA和NA全长基因,将扩增的DNA片段接入T-A克隆载体进行测序,并使用DNAStar软件对测序结果进行分析。结果显示:不同来源的流感病毒株HA的同源性为99%以上,都属于Victoria系;不同来源的病毒株NA同源性为98%以上。HA和NA的种系发生树分析表明:病原学监测毒株同源性更接近,而暴发性疫情毒株的同源性则相对较为分散。所有毒株与WHO推荐的2005~2006年度疫苗株B/Shanghai/361/2002的同源性只有88.9%~89.7%,说明该年度的流感疫苗对乙型流感不能提供最佳的保护。     

陕西省2016-2021监测年度B/Victoria系流感病毒流行和进化分析

本文通过分析陕西省2016-2021监测年度B/Victoria系流感病毒的流行趋势及进化特征,为流感防控工作提供数据支撑。随机选取25株2016-2021监测年度分离出的B/Victoria系病毒株,通过全基因组深度测序方法获得血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）基因序列,与世界卫生组织（WHO）推荐的同期北半球疫苗株进行同源性分析,构建系统进化树,分析病毒变异情况。陕西省2016-2021监测年度B/Victoria系流感呈季节性持续传播,流行高峰集中在冬春季。同源性分析表明2016-2018监测年度流行株与同期疫苗株匹配性总体较好（HA基因氨基酸同源性99.3%～99.6%）,2018-2021监测年度流行株与同期疫苗株匹配性降低（HA基因氨基酸同源性98.5%～98.8%）。进化特征表现为单一谱系内的抗原漂移,不同监测年度流行株均属于V1A大分支,亲缘关系随时间的推移逐渐变远,在V1A大分支内依次进化为V1A.1、V1A.2和V1A.3三个分支,毒株的变异位点逐渐增多,在HA抗原表位120-loop、150-loop、160...     

表达流感病毒神经氨酸酶基因的重组腺病毒的构建

通过RT-PCR方法扩增流感病毒神经氨酸酶基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pTrackCMV,此重组质粒与腺病毒DNA共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。经PCR证实目的基因已整合至腺病毒基因组中,western blot检测到神经氨酸酶的表达。重组病毒经筋鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果表明2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答反应,滴鼻组的免疫效果优于灌胃组。     

DNA疫苗预防B型流感病毒感染

用基因枪和电穿孔法将B型流感病毒DNA疫苗免疫BALB/C小鼠 ,实验证明B型流感病毒HA ,NADNA疫苗能有效抵御致死性同源B型病毒感染。同时实验表明 ,基因枪方法较电穿孔法诱导抗体水平略低。     

表达流感病毒神经氨酸酶基因的重组腺病毒的构建

通过RT-PCR方法扩增流感病毒神经氨酸酶基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pTrackCMV,此重组质粒与腺病毒DNA共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒.经PCR证实目的基因已整合至腺病毒基因组中,western blot检测到神经氨酸酶的表达.重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果表明2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答反应,滴鼻组的免疫效果优于灌胃组.     

云南省2009～2014年甲型H1N1流感病毒HA及NA基因特征分析

了解云南省2009~2014年甲型H1N1流感病毒的流行趋势,研究HA和NA基因进化特征。对云南省近6年来上报的流感监测病例数据进行病原谱总结,挑选出23株甲型H1N1流感毒株进行HA及NA基因分析。利用MEGA 5.0软件对测序结果构建进化树分析基因同源性。2009~2014年云南省共监测到4次甲型H1N1流感流行高峰,核酸检测结果中甲型H1N1流感占检出总量的28.8%。测序结果显示,HA与NA基因均分为3个类群,检测到一株具有H275Y突变位点的毒株。甲型H1N1流感是导致本省流感流行的重要亚型之一,2009~2014年间分离的毒株主要有Goup1、Gourp7和Gourp6三个支系,绝大部分甲型H1N1流感毒株仍对神经氨酸酶抑制剂敏感。     

流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在酵母菌中的表达

在成功克隆流感病毒H1N1全长HA(Hemagglulinin,HA)、NA(Neuramidinase,NA) 基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMETA上,构建了重组表达质粒pMETA/HA(52~1 557 bp)、pMETA/NA(121~1 263 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。SDS-PAGE显示重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,蛋白纯度占总蛋白的95％以上,ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒H1N1 HA、NA基因序列,为流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了参考。     

A、B型流感病毒HA1嵌合基因疫苗的构建及免疫保护研究

为制备能提供交叉保护的疫苗,本研究在证实A型、B型流感病毒HA1 DNA能够提供抗流感病毒保护的基础上,将编码A型和B型流感病毒HA1的基因构建在同一质粒中,制备成嵌合DNA疫苗.将该重组质粒免疫小鼠,并以致死量同种流感病毒A/PR/8/34或B/Ibaraki/2/85攻击,通过测定小鼠的血清抗HA抗体和保护效果(包括存活率、肺部病毒量和体重丢失率)来评价DNA疫苗的免疫效果.结果表明:A、B型流感病毒HAl嵌合DNA疫苗能保护小鼠抵抗两种致死量流感病毒的攻击,具有提供交叉保护的能力.     

一次接种HA DNA保护小鼠抵抗B型流感病毒攻击

为详细探讨小鼠不同次数接种B型流感病毒HA DNA疫苗后免疫应答情况,以及CpG基序的免疫佐剂效果,采用不同剂量HA DNA,1次或2次(间隔3周)电击法免疫BALB/C小鼠。初免4周后(或二免加强免疫1周后)用致死量流感病毒(B/Ibaraki/2/85)攻击。研究发现:①100μg HA DNA一次接种的小鼠全部存活;②经含有CpG基序的DNA免疫的小鼠体内诱导产生的抗HAIgG抗体更高,小鼠体重丢失更少。这些结果说明,1次接种100μg HA DNA疫苗可以使小鼠抵抗致死量B型流感病毒攻击,CpG基序能够增强HA DNA疫苗的免疫保护作用。     

IL-12增强流感血凝素DNA疫苗在小鼠中抗流感作用

流感病毒的表面抗原血凝素 (hemagglutinin ,HA)能作为DNA疫苗抗流感病毒攻击 ,在小鼠模型中检测白介素 12 (interleukin 12 ,IL 12 )能否作为HADNA疫苗佐剂增强小鼠抗流感病毒攻击。将IL 12和HA共同免疫小鼠 ,免疫 2次 ,间隔 3周 ,加强免疫后用致死量流感病毒攻击。共同免疫IL 12和HADNA与单独免疫HA相比 ,无论初免还是加强免疫后血清中抗HA的IgG抗体显著提高 ,小鼠体重丢失 (一种临床症状 )明显减少且提高了小鼠的存活率。这些结果表明了IL 12能作为一种佐剂提高流感DNA疫苗的免疫效价。     

H9N2亚型禽流感病毒HA基因的克隆及其DNA疫苗的动物免疫试验

血凝素(HA)是决定禽流感病毒的毒力强弱和免疫原性的主要蛋白质.根据已发表的H9亚型AIV的HA基因序列,设计合成了1对H9 HA特异引物,以AIV A/Chicken/Henan/1/1999/(H9N2)核酸为模板,通过RT-PCR扩增出1条1.6 kb cDNA片段.将HA基因插入pVAX1中,构建了真核表达质粒pVAX-H9.采用活体电击法免疫3周龄SPF鸡10只,剂量为50 μg/只,3周后加强免疫一次,5周后以100倍鸡胚感染剂量(EID)的HA基因同源病毒对所有鸡进行攻毒.其间每周检测抗体水平变化,6周后以棉拭子进行泄殖腔病毒分离.结果为攻毒后免疫组鸡HI效价为9log2～10log2,对照组为2log2～4log2;免疫组病毒分离数为0/10,对照组为10/10.表明所构建的HA基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应.     

一种含不同流感病毒血凝素抗原表位的核酸疫苗

流感病毒表面抗原血凝素( hemagglutinin,HA)是流感核酸疫苗重要的靶抗原,针对HA的保护性中和抗体主要由HA上的五个抗原表位诱导产生.在本文中,我们构建了一种以新甲型H1N1流感病毒HA1为骨架的含2个A/PR/8( H1N1)流感病毒HA抗原表位和3个新甲型H1N1流感病毒HA抗原表位的核酸疫苗,并在B...     

流感病毒识别糖链受体分子机制的研究进展

近年来,由于流感病毒(influenza virus)不可预测的局部流行和有可能引发全球大流行,其一直是研究的热点课题之一．流感病毒表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)特异识别宿主细胞表面的糖链受体是流感病毒感染宿主、进而复制并继续传播的生物学基础．影响流感病毒宿主特异性的两个主要因素是HA自身的变化(包括基因突变、重组、糖基化位点数量和糖基化位置的变化)和宿主细胞表面糖链受体的变化(包括糖链受体的类型、分布和分子构象的改变)等．因此准确掌握这些信息有助于人们进一步加强对流感病毒的防控．本文主要从糖组学角度概述了流感病毒识别糖链受体的分子机制,重点介绍流感病毒宿主细胞表面糖链受体的研究进展．     

禽流感病毒血凝素蛋白的结构、功能与表达

血凝素蛋白（HA）既是一种重要吸附蛋白,介导禽流感病毒吸附和穿入宿主细胞而发挥致病作用,也是一种良好的保护性抗原,对宿主抵抗禽流感起到了决定性保护作用。研究HA蛋白对揭示禽流感病毒的致病机理和免疫防治禽流感均具有重要意义。本文重点概述了HA蛋白的结构、功能和蛋白表达方面的研究进展,并对HA蛋白在禽流感疫苗中的应用进行了探讨。     

人H5N1流感病毒血凝素蛋白DNA疫苗的构建及其免疫原性研究

将我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和HA1基因片段并克隆至真核表达载体pStar,构建成真核表达质粒。通过Western blot和间接免疫荧光检测方法确认,构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和HA1。将重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测免疫后外周血中HA/HA1特异性抗体的效价,并比较HA和HA1的免疫原性。结果表明,重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应,且二者的血清抗体效价无显著性差异。     

Functional Interactions of the Influenza Virus Glycoproteins

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are functionally related envelope glycoproteins of the influenza virus (Flu). HA interacts with terminal sialyl residues of oligosaccharides and ensures the binding of the virus particle to the cell surface. NA is a receptor-destroying enzyme that removes sialyl residues from oligosaccharides contained in cell and virus components and thereby prevents aggregation of virus particles. Analysis of reassortants combining low-functional NA of human Flu with HA of avian Flu showed that sialyl residues are not completely removed in some cases. With high HA affinity for sialyl substrates, such virus particles aggregate, aggregates accumulate on the cell surface, and virus yield decreases. Serial passaging of low-yield aggregating reassortants may lead to selection of high-yield variants, which do not aggregate. The loss of aggregation is due to a decrease in HA affinity for high-molecular-weight sialyl substrates. On evidence of sequencing of the HA gene in original reassortants and their nonaggregating variants, for different HA antigenic subtypes (H2, H3, H4, and H13) the affinity is reduced and aggregation lost through a common mechanism: an increase in the negative charge as a result of an amino acid substitution in the vicinity of the receptor-binding pocket of HA. Taken together, these findings suggest a way of postreassortment adaptation, which improves the functional match of HA and NA. The experimental system employed provides a model of natural processes associated with emergence of Flu variants having a pandemic potential.